Summary
Qui, presentiamo un protocollo per dissociare e ordinare una popolazione cellulare specifica dalle ghiandole accessorie maschili della Drosophila (cellule secondarie) per il sequenziamento dell'RNA e RT-qPCR. L'isolamento cellulare si realizza attraverso la purificazione FACS delle cellule secondarie che esprime GFP dopo un processo di dissociazione multifase che richiede dissezione, proteasi di gestione e dispersione meccanica.
Abstract
Per comprendere la funzione di un organo, è spesso utile comprendere il ruolo delle sue popolazioni cellulari costituenti. Sfortunatamente, la rarità delle singole popolazioni di cellule spesso rende difficile ottenere materiale sufficiente per studi molecolari. Ad esempio, la ghiandola accessoria del sistema riproduttivo maschile della Drosophila contiene due tipi distinti di cellule secretory. Le cellule principali costituiscono il 96% delle cellule secretory della ghiandola, mentre le cellule secondarie (SC) costituiscono il restante 4% delle cellule (circa 80 cellule per maschio). Sebbene entrambi i tipi di cellule producano componenti importanti del liquido seminale, solo pochi geni sono noti per essere specifici per le SCs. La rarità delle SC ha, finora, ostacolato lo studio di analisi trascrittomica di questo importante tipo di cellula. Qui, viene presentato un metodo che consente la purificazione delle SCs per l'estrazione e il sequenziamento dell'RNA. Il protocollo consiste nel sezionare prima le ghiandole da mosche che esprimono un reporter GFP specifico scmedico e poi sottoponendo queste ghiandole alla digestione proteasi e alla dissociazione meccanica per ottenere singole cellule. Seguendo questi passi, le cellule individuali, viventi, marcate TBC vengono ordinate utilizzando un sorter cellulare attivato fluorescente (FACS) per la purificazione dell'RNA. Questa procedura produce RNA specifici di SC da 40 maschi per condizione per il sequenziamento a valle di RT-qPCR e/o RNA nel corso di un giorno. La rapidità e la semplicità della procedura consentono di determinare in un breve periodo di tempo i trascrittomi di molte mosche diverse, provenienti da genotipi o condizioni ambientali diverse.
Introduction
Gli organi sono costituiti da più tipi di cellule, ognuna con funzioni discrete e talvolta esprimi nobili di geni molto diversi. Per ottenere una comprensione precisa di come funziona un organo, è spesso fondamentale studiare ogni tipo di cellula distinta che costituisce questo organo. Uno dei metodi principali utilizzati per esplorare la possibile funzione è l'analisi del trascrittoma. Questo potente metodo fornisce un'istantanea dell'espressione genica in una cellula, per rivelare processi e percorsi attivi. Tuttavia, questo tipo di analisi è spesso difficile per le popolazioni di cellule rare che devono essere purificate da cellule vicine molto più abbondanti. Ad esempio, la ghiandola accessoria maschile della Drosophila è un organo composto principalmente da due tipi di cellule secretorie. Poiché il più raro dei due tipi di cellule comprende solo il 4% delle cellule di questa ghiandola, l'uso di un'analisi del trascrittoma specifico di tipo cella non era stato utilizzato per aiutare a determinare la funzione di queste cellule.
Le ghiandole accessorie (AG) sono organi del tratto riproduttivo maschile negli insetti. Sono responsabili della produzione della maggior parte delle proteine del liquido seminale (proteine del liquido seminale (SFP) e proteine accessorie della ghiandola (ACP)). Alcuni di questi SFP sono noti per indurre le risposte fisiologiche e comportamentali nelle femmine accoppiate, comunemente chiamate risposta post-accoppiamento (PMR). Alcuni dei PMR includono: un aumento dell'ovulazione e del tasso di deposizione delle uova, lo stoccaggio e il rilascio di spermatozoi, un cambiamento nella dieta femminile, e una diminuzione della ricettività femminile ai maschi corteggiati secondari1,2. Poiché gli insetti hanno un impatto su molti importanti problemi sociali dalla salute umana (come vettori per malattie mortali) all'agricoltura (gli insetti possono essere parassiti, ma sono fondamentali per l'impollinazione e la qualità del suolo), la comprensione della riproduzione degli insetti è un'importante area di ricerca. Lo studio di AG e ACP è stato avanzato in modo significativo con l'organismo modello Drosophila melanogaster. Questi studi hanno evidenziato il ruolo degli AG e di alcune delle singole proteine che producono nella creazione del PMR, influenzando il lavoro in altre specie come il vettore di malattia Aedes aegypti3,4, e altri insetti1 ,5. Inoltre, poiché gli AG secernono i costituenti del liquido seminale1,6 sono spesso considerati come l'analogo funzionale della ghiandola prostatica dei mammiferi e della vescica seminale. Questa somiglianza di funzione combinata con somiglianze molecolari tra i due tipi di tessuto, hanno reso il GS un modello per la ghiandola prostatica nelle mosche7.
All'interno del maschio della Drosophila, ci sono due lobi di ghiandole accessorie. Ogni lobo può essere visto come una struttura simile a un sacco costituita da un monostrato di cellule secretorie che circondano un lumari centrale, e avvolto da muscoli lisci. Come accennato in precedenza, esistono due tipi di cellule secretorie morfologicamente, dallo sviluppo e funzionalmente distinte che compongono questa ghiandola: le cellule principali a forma di poligono (che costituiscono il 96% delle cellule) e le celle secondarie più grandi e rotonde (SC) (che costituiscono il restante il 4% delle cellule, o circa 40 cellule per lobo). È stato dimostrato che entrambi i tipi di cellule producono insiemi distinti di ACP per indurre e mantenere il PMR. La maggior parte dei dati ottenuti fino ad oggi evidenzia il ruolo di una singola proteina nell'innescare la maggior parte dei comportamenti caratteristici del PMR. Questa proteina, il peptide sessuale, è un piccolo peptide aminoacido 36 che viene secreto dalle cellule principali8,9,10. Anche se il peptide sessuale sembra svolgere un ruolo importante nel PMR, altri ACP, prodotti da entrambe le cellule principali e secondarie, hanno anche dimostrato di influenzare vari aspetti del PMR11,12,13,14 ,15,16,17. Ad esempio, sulla base delle nostre attuali conoscenze, le SC, attraverso le proteine che producono, sembrano essere necessarie per la perpetuazione della segnalazione SP dopo il primo giorno18.
Data la rarità delle SC (solo 80 cellule per maschio), tutte le nostre conoscenze su queste cellule e sulle proteine che producono provengono dalla genetica e dagli approcci candidati. Finora, solo un elenco relativamente piccolo di geni ha dimostrato di essere specifico SC. Questo elenco include la proteina dell'omeodominio Defective provenive (Dve)19, lncRNA MSA20, Rab6, 7, 11 e 1921, CG1656 e CG1757511, 15,21 e il fattore di trascrizione omeobox Abdominal-B (Abd-B)18. In precedenza, abbiamo dimostrato che un mutante carente sia per l'espressione di Abd-B che per l'MSA lncRNA nelle cellule secondarie(iab-6cocuD1 mutant) accorcia la lunghezza del PMR da 10 giorni a un solo giorno12 , 18 mi lato , 20.Questo fenotipo sembra essere causato dall'immagazzinamento improprio di SP nel tratto riproduttivo femminile12,18,20. A livello cellulare, le cellule secondarie di questo mutante mostrano una morfologia anormale, perdendo le loro caratteristiche strutture vacuole18,20,21. Utilizzando questa linea mutante, in precedenza abbiamo tentato di identificare i geni coinvolti nella funzione SC confrontando i profili trascrizionali di interi gruppi di disponibilità da ghiandole accessorie di tipo selvatico omutanti 12. Inoltre, altri laboratori hanno dimostrato che il numero SC, la morfologia e il contenuto vacuolare dipendono dalla dieta maschile, dallo stato di accoppiamento e dall'etàdi 21anni,25,26.
Anche se sono stati compiuti progressi positivi utilizzando questi approcci, un trascrittoma SC completo era ben lungi dall'essere raggiunto. La rarità di queste cellule in questo organo ha reso difficile progredire ulteriormente anche da cellule di tipo selvatico. Per testare l'espressione genica, i cambiamenti in queste cellule dopo particolari stimoli ambientali sarebbero ancora più difficili. Pertanto, era necessario un metodo per isolare e purificare l'RNA SC che fosse abbastanza veloce e semplice da funzionare in diversi contesti genetici e condizioni ambientali.
Entrambi i geni Abd-B e MSA richiedono un potenziatore specifico di 1,1 kb dal complesso Drosophila Bithorax (chiamato potenziatore D1) per la loro espressione in SCs18,20. Questo potenziatore è stato utilizzato in precedenza per creare un driver GAL4 che, se associato a un UAS-GFP,è in grado di guidare un'espressione GFP forte in particolare nei SCs. Così, abbiamo usato questa linea come base per un protocollo FACS per isolare queste cellule sia dal tipo selvaggio che dai cocuD1 aG iab-6). Poiché le SC mutate iab-6cocuD1 mostrano una morfologia cellulare diversa, mostriamo che questo protocollo può essere utilizzato per isolare le cellule per la determinazione del loro trascrittoma da questo raro tipo di cellula in condizioni molto diverse.
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Protocol
1. Linee di Drosophila utilizzate e raccolta dei maschi
- Per questo protocollo, utilizzare i maschi che esprimono GFP nelle SCs e non nelle cellule principali. In questo caso, viene utilizzato un driver AbdB-GAL4 (descritto nel riferimento18),ricombinato con UAS-GFP (sul cromosoma 2). Possono essere utilizzati anche altri driver appropriati. Per l'isolamento delle SC in diverse condizioni mutanti, attraversa la mutazione in linee contenenti la linea GFP specifica per SC.
- Raccogliere due lotti di circa 25 maschi sani e vergini per ogni genotipo e invecchiarli a 25 gradi centigradi per 3-4 giorni in fiale con cibo drosophila appena fatto.
NOT: Come età, stato di accoppiamento, nutrizione e ambiente sociale influenzano ciascuno la biologia riproduttiva, devono essere seguiti protocolli rigorosi per controllare questi parametri. I maschi vergine di età sono invecchiati per 3-4 giorni dopo l'eclosione pupina a 25 gradi centigradi con un ciclo di luce/buio di 12 h/12 h, sul cibo standard del farina di mais-agar-lievito, in gruppi di 20-25 maschi per fiala.
2. Soluzioni e preparazione dei materiali
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Preparare le soluzioni seguenti.
- Preparare il siero -minerato medio (SSM): il mezzo Drosophila di Schneider integrato con il 10% di calore inattivato dal siero bovino fetale e l'1% Penicillina-Streptomycin.
- Preparare l'enzima di 1x di trypsin (ad esempio, TrypLE Express Enzyme) e conservarli a temperatura ambiente.
- Preparare le aliquote di papaina [50 U/mL] (conservate a -20 gradi centigradi e scongerate una sola volta).
- Preparare 1x salina buffer fosfato (PBS, conservato a temperatura ambiente).
-
Preparare più punte pipet a fiamma per la dissociazione fisica delle ghiandole accessorie.
NOTA: Utilizzare punte di bassa ritenzione per la gestione delle ghiandole accessorie in quanto tendono ad aderire alla plastica non trattata. Il processo di arrotondamento della fiamma riduce l'apertura della punta e leviga i bordi della punta. Ciò garantisce un'efficiente dissociazione dopo la digestione dei peptidasi senza tosare le membrane cellulari.- Tagliare una punta di 200 -L con una lama affilata e passarla delicatamente sopra una fiamma per arrotondare la sua punta in modo che l'apertura sia più ampia ma liscia per la maneggevolezza durante la fase 3.7.
- Restringere l'apertura di più punte di 1.000 punte passando la punta di apertura vicino a una fiamma per meno di un secondo. Ruotare leggermente la punta per evitare un'eccessiva fusione o intasamento. Ordinare le punte fatte da più stretto a più ampio. Questo può essere fatto cronometrando la velocità di aspirazione. Provare a dissociare un campione su piccola scala di ag per testare l'efficienza delle punte più strette.
NOT: Questi suggerimenti sono fondamentali per l'agitazione meccanica (passaggi 5.2 e 5.3). Le punte del tubo di fiamma di qualità consentono una completa dissociazione preservando la vitalità cellulare. Come tale, questi suggerimenti vengono lavati accuratamente con acqua alla fine della procedura per il riutilizzo. Questo permette dissociazione riproducibile giorno per giorno.
3. Dissezione delle ghiandole accessorie
- Mettere da 20 a 25 Maschi Drosophila in un piatto di vetro sul ghiaccio.
- Dissect 1 maschio in SSM. Togliere il suo tratto riproduttivo e cancellare la coppia di ghiandola accessoria da tutti gli altri tessuti a parte il condotto eiaculatorio.
NOT: Rimuovere i testicoli perché lo sperma rilasciato può creare grumi e disturbare il processo di dissociazione. Rimuovere la lampadina eiaculatoria, che rende difficile la manipolazione quando galleggia. - Con pinze, trasferire le ghiandole accessorie in una lastra di vetro riempita con SSM a temperatura ambiente. Ripetere i passaggi 3.2-3.3 20 volte per ottenere un lotto di 20 coppie di ghiandole in SSM.
NOT: Questi passaggi saranno raggiunti in 15-20 min. GFP può essere monitorato utilizzando un microscopio fluorescente. - Trasferire le ghiandole accessorie a 1x PBS per un lavaggio di 1-2 min a temperatura ambiente.
NOT: Per una migliore dissociazione, è imperativo sciacquare le ghiandole con PBS. La durata di questo passaggio, tuttavia, dovrebbe essere limitata in quanto le cellule mostrano segni di stress nella PBS; cellule secondarie dissociate in PBS si gonfiano rapidamente e muoiono. - Diluire 20 papaina [50 U/mL] in 180 - L di 1x enzima trypsin per ottenere la soluzione di dissociazione (per scalare verso l'alto o verso il basso mantenere 9 L di enzima di metapina e 1 L di papaina per ogni maschio). Con pinze, trasferire le ghiandole accessorie a questa soluzione.
- Isolare la punta delle ghiandole accessorie (contenenti celle secondarie) dalla parte prossimale. Utilizzare pinze sottili per pizzicare saldamente il centro di un lobo ghiandolare e tagliare con la punta affilata di una seconda pinze. Rimuovere la parte prossimale delle ghiandole accessorie e il condotto eiaculatorio per migliorare la dissociazione e ridurre il tempo di smistamento cellulare.
NOT: Dissezione della parte dissale da 20 coppie di ghiandole avrà 15 a 20 min e la digestione da peptidasi inizierà quindi a temperatura ambiente. - Dopo che tutte le punte della ghiandola sono state sezionate, trasferirle in un tubo da 1,5 mL utilizzando una speciale punta di pipetta da 200 lun preparata al Passo 2.2.1. Dovrebbe essere largo, arrotondato e umido prima di maneggiare le ghiandole.
NOT: Per pipet tessuto ghiandola accessorio, le punte devono sempre essere pre-bagnate con soluzione appropriata (enzima trypsin o SSM, tenere un tubo di ciascuno per questo scopo). Risciacquare con attenzione le punte tra i campioni per evitare la contaminazione.
4. Digestione dei tessuti
- Mettere il microtubo in uno shaker da 37 gradi centigradi per 60 min, dondolando a 1.000 giri/mm.
NOT: Sia il tempo di agitazione che quello di digestione sono fondamentali per una dissociazione di successo. La digestione più breve o immobile darà scarsa dissociazione, probabilmente perché lo strato muscolare esterno e il liquido seminale viscoso interno proteggono le cellule della ghiandola accessoria dai peptidasi. - Aggiungere 1 mL di SSM a temperatura ambiente per interrompere la digestione e procedere immediatamente al passaggio 5.
5. Dissociazione meccanica delle cellule
- Utilizzando una punta larga arrotondata di 1.000 gradi, pre-bagnata con SSM, trasferire il campione su una piastra di 24 pozzetti. Monitorare la fluorescenza GFP al microscopio: la maggior parte delle punte della ghiandola dovrebbe apparire intatta e alcune SC dovrebbero essere staccate.
- Utilizzando una punta a tubo stretto arrotondato generata al passo 2.2.2, pipet su e giù da 3 a 5 volte per interrompere il tessuto della ghiandola accessoria.
NOT: Monitorare la fluorescenza per assicurarsi che grandi macchie di tessuto sono stati rotti. Ripetere il passaggio 5.2 se questo non è il caso. - Utilizzando una punta di tubo arrotondata molto stretta (generata al punto 2.2.2), pipet su e giù 1-2 volte.
NOT: Solo le singole celle devono essere visibili dopo il passaggio 5.3. Si consiglia di utilizzare piastre a 24 pozze perché consentono un facile monitoraggio del processo. Quando alcuni campioni sono stati elaborati e hanno dato risultati soddisfacenti (cellule secondarie dall'aspetto sano perfettamente dissociate), i passaggi di pipettaggio verranno eseguiti nel microtubo. - Attendere almeno 15 min per lasciare che le cellule si stabilizzino nella parte inferiore del pozzo e rimuovere l'SSM in eccesso per ridurre il tempo di smistamento.
NOT: Lasciare che le cellule si depositino si sono dimostrate superiori a metodi alternativi come la centrifugazione e consente un'ultima ispezione visiva delle cellule poco prima del FACS. - Convogliale alle cellule in un tubo pulito da 1,5 mL e piscina campioni identici (due lotti di 20 maschi per ogni condizione). Sciacquare i pozzi con SSM per recuperare le ultime cellule e convogliarle nel tubo (utilizzare un piccolo volume).
- In microtubi da 1,5 mL, aggiungere 300 l of Cell Lysis Solution e 1 ll di Proteinase K [50 g/l] (soluzioni fornite nel kit di purificazione dell'RNA, vedere il passaggio 7). Preparare due tubi per ogni campione (uno per gli MC e uno per gli SCs).
6. FACS (Fluorescence-activated Cell Sorting)
- Aggiungere un marcatore di vitalità a ogni campione da ordinare pochi minuti prima dell'ordinamento (0,3 mM Draq7).
ATTENZIONE: Draq7 deve essere gestito con cautela. -
Ordinare una popolazione omogenea di cellule secondarie vive (cellule GFP-positive, Draq7-negative). In un altro microtubo, ordinare una popolazione di cellule principali (più piccole, GFP-negativo, Draq7-negativo). Utilizzare la seguente strategia di gating FACS:
NOTA: Impostare la pressione della selezione celle a 25 PSI e passare le celle attraverso un ugello di 100 m. La velocità di smistamento è di circa 2.000 celle/s.- Escludere i detriti e selezionare le celle totali in base a FSC-SSC(Figura 2E) per escludere i detriti.
- Escludere le cellule morte. Emoziono Draq7 con un laser da 640 nm e raccogli la fluorescenza emessa con un filtro passa-banda 795/70. Cancello Draq7-positivo cellule fuori (Figura 2F).
- Rimuovere i doppietti utilizzando un doppio gating su SSC-H vs SSC-W e FSC-A vs FSC-H (Figura 2H).
NOT: Escludere rigorosamente i doppi cellulari usando il doppio gating, per ridurre la contaminazione cellulare principale. - Ordinare le cellule gFP-positive in un microtubo da 1,5 mL con buffer di lisni e Proteinase K. Questa popolazione è considerata cellule secondarie (SC, Figura 2G). Escite GFP a 488 nm e raccogli la fluorescenza emessa con un filtro passa-banda 526/52.
- Ordina 1.000 cellule GFP-negative, omogenee e di piccole dimensioni, in un microtubo da 1,5 mL con buffer di lysis e Proteinase K. Questa popolazione è considerata cellule principali (MC, Figura 2G).
- Vortice tutti i campioni.
NOT: Da 40 maschi (40 x 80 SC e 3.200 cellule secondarie), si ottengono da 600 a 800 cellule secondarie singlet vive (circa il 20-25% di recupero). Interrompere lo smistamento di circa 550 SC e 1.000 MC per normalizzare i campioni.
7. Estrazione dell'RNA
NOT: Abbiamo usato il kit di purificazione dell'RNA Epicentre MasterPure per l'estrazione dell'RNA, con i seguenti adattamenti. Altri kit potrebbero essere utilizzati fino a quando il rendimento è abbastanza alto per preparare una libreria per la sequenziazione da 500 dollari (2 ng RNA è stato utilizzato qui).
- Campioni di calore a 65 gradi centigradi per 15 min e vortice ogni 5 min per completare la lisi cellulare.
- Posizionare i campioni sul ghiaccio per 5 min. Seguire le raccomandazioni del produttore per le precipitazioni degli acidi nucleici (parti "Precipitazioni di acidi nucleici totali" e "Rimozione del DNA contaminato dai preparatia dell'acido nucleico totale").
- Sospendere l'RNA pellet in 10 -L di buffer TE senza RNase.
- Aggiungere l'inibitore rNase (opzionale).
- Conservare i campioni a -80 gradi centigradi.
8. Controlli di qualità di quantità, qualità e specificità dell'RNA
- Stimare la qualità e la concentrazione dell'RNA. A causa del piccolo volume e della concentrazione, usa i chip RNA 6000 Pico qui. L'RNA di buona qualità è definito come non degradato, visibile come una linea di base bassa con picchi taglienti corrispondenti ai rRNA.
-
RT-qPCR per controllare l'identità delle celle ordinate
- Eseguire la trascrizione inversa con 2 ng di RNA totali utilizzando hexamers casuali come primer. Eseguire RT sull'RNA della cellula secondaria e sull'RNA della cellula principale.
NOTA: i cDNA possono essere diluiti, applicati e tenuti congelati per un uso successivo. - Esegui la PCR quantitativa in tempo reale utilizzando le coppie di primer appropriate per quantificare i geni delle pulidi (alpha-Tubulin, 18S rRNA),i geni specifici delle cellule secondarie (MSA, Rab19, Abd-B) e il gene specifico della cellula principale (Sex peptide).
- Eseguire la trascrizione inversa con 2 ng di RNA totali utilizzando hexamers casuali come primer. Eseguire RT sull'RNA della cellula secondaria e sull'RNA della cellula principale.
9. Sequenziamento (preparazione della libreria cDNA, sequenziamento e analisi dei dati)
- Utilizzare 2 ng di RNA totali per sintetizzare i cDNA con i primer polidT. Utilizzare la tecnologia SMARTer per amplificarli per l'amplificazione.
- Utilizzare un kit Nextera XT per preparare la libreria.
- Sequenza che usa il sequenziamento multiplexed, 100 nucleotidi letture singole (anche se 50 letture nucleotidi sono appropriate per la maggior parte degli scopi) per produrre circa 30 milioni di letture per ogni campione.
10. Analisi dei dati
- Eseguire FastQC.
- Utilizzare l'allineatore STAR per mappare le letture sul genoma di riferimento di UCSC dm6 Drosophila e generare file .bam. Utilizzare Integrative Genomics Viewer (IGV) per visualizzare le letture sul browser del genoma.
- Utilizzare HTSeq per eseguire conteggi genici.
- Utilizzare il metodo Trimmed Mean of M-values (TMM) per normalizzare i conteggi genici22. Utilizzare edgeR per eseguire analisi statistiche di espressione differenziale, grafici MA e PCA.
- Per l'analisi e le statistiche dell'espressione genica, utilizzare Modello lineare generale, quasi-probabilità F-test con False Detection Rate (FDR) e Benjamini & Hochberg correzione (BH).
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Representative Results
Il protocollo qui presentato consente a uno sperimentatore di isolare le cellule secondarie dalle ghiandole accessorie maschili della Drosophila e di estrarre il loro RNA nel corso di un solo giorno (Figura 1).
Usiamo il costrutto Abd-B-GAL4 18 per etichettare le celle secondarie (SC) ma non le celle principali (MC) con GFP(Figura 2A). Uno degli obiettivi di questa procedura è quello di ottenere il trascrittoma di tipo selvaggio delle SC (il tipo selvatico è scritto con virgole invertite poiché sono ottenute da mosche transgeniche che esprimono GFP e GAL4). Un altro obiettivo è quello di ottenere l'RNA SC attraverso una procedura semplice e veloce che consenta di studiare la loro espressione genica in condizioni diverse. Così, abbiamo eseguito questa procedura utilizzando il tipo selvaggio e i mutanti "iab-6cocuD1" che trasportano una delezione di 1,1 kb rimuovendo l'esaltatore di Abd-B responsabile dell'espressione SC. Questa eliminazione rimuove anche il promotore di MSA, una trascrizione importante per lo sviluppo di cellule secondarie, morfologia e funzione18,20 (Figura 2B,C). Questo protocollo è stato ripetuto tre volte con 2 genotipi ogni volta per ottenere triplicati biologici (in seguito indicato come WT-1,-2,-3 per il tipo selvaggio e D1-1,-2 e -3 per il cocuD1iab-6).
Questo protocollo consente la dissociazione MC e SC dalle ghiandole accessorie della Drosophila in poche ore (Figura 2D). Entrambe le popolazioni di cellule vengono quindi ordinate in due tubi diversi per isolare MC e SC. La strategia di gating per FACS è illustrato figura 2E-2G. Draq7 permette di stimare la vitalità cellulare intorno al 70% per l'intero campione (Figura 2F). I singlet rappresentano oltre il 90% della popolazione SC e oltre l'80% della popolazione MC, come stimato da FSC-A vs FSC-H e SSC-H vs SSC-W. (vedere la figura 2H). Ciò riflette un'efficiente dissociazione. Circa il 10% degli eventi di selezione sono stati interrotti perché un'altra cellula o detriti era presente nella stessa goccia FACS. Da 40 maschi, in genere raccogliamo 550 SC e 1.000 MC e poi interrompiamo lo smistamento. Da 1 campione (su 6), non siamo riusciti a raggiungere 550 cellule secondarie. Il campione WT-1 è stato quindi ottenuto solo da 427 SC, ma ha fornito RNA di qualità e quantità simili ad altri.
Le cellule sono ordinate in tampone di lisi (contenente proteine K). Non appena tutti i campioni sono pronti, gli RNA vengono estratti da ogni campione di cellule per avere pellet di RNA alla fine della giornata. La qualità e la quantità degli RNA sono stimate utilizzando un bioanalizzatore con un chip appropriato per affrontare basse concentrazioni e piccoli volumi. Poiché le concentrazioni stimate erano variabili tra i campioni (che vanno da oltre 1.300 pg/L fino a 344 pg/L, vedi la figura 3A), abbiamo regolato il materiale di partenza sia per la sintesi della libreria RT-qPCR che quella cDNA a circa 2 ng (misurato concentrazioni non sono molto accurate). Abbiamo quantificato l'espressione di geni specifici in tempo reale qPCR su estratti MC e SC di tipo selvatico per controllare l'identità delle popolazioni cellulari che abbiamo ordinato. Figura 3 B mostra l'espressione genica come quantificazioni relative normalizzate in espressione alfa-tubulina. I geni delle pulidi come 18S rRNA e alpha-tubulina vengono rilevati in tutti i campioni, come previsto. Al contrario, il gene SC Rab19 viene rilevato solo da estratti SC e il gene MC Sex Peptide viene rilevato solo da MC. Notiamo che l'espressione Rab19 in SC mutanti iab-6cocuD1 è bassa rispetto al tipo selvaggio SC, suggerendo che l'espressione di questo gene è influenzata dalla perdita di Abd-B e MSA (coerentemente, il grande I vacuoli con etichetta Rab19 vengono persi nel mutante iab-6cocuD1 21). La trascrizione secondaria specifica della cellula MSA viene rilevata solo da un tipo selvaggio SC e non da MC, né da SC iab-6cocuD1, che era previsto da quando il promotore MSA viene eliminato in questo mutante. Complessivamente, i QC mostrati nella Figura 3 dimostrano che gli RNA ottenuti con questo protocollo non sono degradati e che entrambe le popolazioni cellulari (SC e MC) sono ordinate con successo da ghiandole accessorie, sia in condizioni di tipo selvaggio che in condizioni mutanti. Qui sono stati sequenziati solo gli RNA delle cellule secondarie, ma si noti che questa procedura consente la profilazione trascrittoma concomitante di SC e MC.
Il sequenziamento dell'RNA è stato realizzato utilizzando procedure standard. In questo caso, discuteremo solo le analisi di controllo qualità che sono pertinenti ai fini di questo metodo. Quando si ottengono sequenze, le letture vengono mappate al genoma di riferimento della Drosophila, attribuito ai geni, e normalizzato. La PCA (Principal Component Analysis) è stata eseguita sui 6 campioni (3 tipi selvatici e 3 repliche di cocuD1 iab-6). La maggior parte della variabilità dei dati è contabilizzata in PC1, e la maggior parte della variabilità rimanente è contabilizzata in PC2. Come illustrato nella Figura 4A, il tipo selvaggio replica il cluster vicini e lontano dai campioni dicocuD1 Iab-6. Questo dimostra che i campioni di WT sono più simili tra loro che quelli mutanti. Questo illustra il metodo riproducibilità e la sua capacità di rilevare un programma genetico anormale da cellule secondarie mutanti. Mentre i campioni D1-2 e D1-3 si raggruppano, si nota che il campione D1-1 è piuttosto divergente. Poiché tutti i QC per questa replica sono buoni e paragonabili a tutti gli altri replica, possiamo escludere un problema di preparazione del campione (29 milioni di letture in totale, >76% dei quali si allineano in modo univoco al genoma di riferimento. Tra questi, >77% sono attribuiti a un gene, >90% sono mRNA, e <3% sono rRNA). Questa divergenza potrebbe riflettere il fatto che l'espressione genica in SC è instabile nel cocuDiab-6, anche se testare questa ipotesi richiederebbe più repliche.
La visualizzazione delle letture allineate a particolari geni sul genoma consente una stima visiva della qualità dei dati. La figura 4 mostra una selezione di geni, con letture da 1 replica rappresentativa per ogni genotipo. Non sorprende che i geni delle pulidi come act5C siano espressi in entrambi i genotipi (Figura 4B), sia nei geni specifici di SC Rab19 e Dve (Figura 4C,D). La mancanza di letture introniche conferma che il polidT ha innescato in modo selettivo la trascrizione inversa da mRNA maturamente uniti per la preparazione della libreria cDNA. In particolare, possiamo vedere variazioni importanti e significative nell'espressione di geni specifici tra il tipo selvaggio e ilcocuD1 iab-6. Questo è esemplificato in Figura 4E dal gene MSA la cui forte espressione in tipo selvaggio viene persa in iab-6cocuD1. L'MSA è presentata come prova di principio che questo metodo consente di identificare i geni che sono mal regolati in condizioni mutanti. Questo aiuterà a comprendere i fenotipi osservati in questo mutante e potrebbe dare nuove intuizioni sulle normali funzioni secondarie delle cellule secondarie.
Figura 1: Panoramica del protocollo. Vengono visualizzati i passaggi chiave del protocollo, con la linea temporale sul lato destro. Questa procedura permette di iniziare con la Drosophila dal vivo al mattino di avere cellule dighiventiate accessorie per mezzogiorno, ordinarle in base all'espressione GFP e ottenere i loro RNA estratti entro la fine della giornata lavorativa. Il sequenziamento dell'RNA e l'analisi dei dati richiederanno in genere alcune settimane. Questa cifra è stata modificata dal riferimento27. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Isolamento e ordinamento delle celle secondarie che esprimono GFP. (A) Immagine confocale della ghiandola accessoria Abd-B:GAL4 UAS-GFP che esprime GFP nelle celle secondarie (SC), ma non nelle celle principali (MC). I nuclei sono macchiati di DAPI (blu). La linea bianca punteggiata delimita i lobi AG. La disgella è un condotto eiaculatorio. Le barre bianche nell'angolo in alto a sinistra sono squame da 50 m. (B,C) Panorami ingranditi della parte dissal della ghiandola accessoria con SC che esprime GFP, in caratteri selvaggi (B) e iab-6cocuD1 (C) sfondo. (D) Celle dissociate a basso ingrandimento sotto il binocolo GFP. (E-H) Strategia di gating FACS per purificare SC e MC. Punti rossi su tutti i pannelli mostrati SC come definito nel pannello (G). In primo luogo i detriti sono esclusi (E, passo 6.2.1) così come le cellule morte positive Draq-7 (F, passo 6.2.2). Le celle positive GFP sono selezionate (SC) e una popolazione omogenea di cellule negative GFP (MC)(G, passaggi 6.2.4 e 6.2.5). Le doppiettole sono escluse dalla popolazione MC e SC (passaggio 6.2.3, solo il gating SSC-H vs SSC-W per SC è mostrato su 2H come esempio). Questa cifra è stata modificata dal riferimento27. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: QC sugli RNA: qualità, quantità e specificità del tipo di cella. (A) Controllo della qualità dell'RNA e stima della concentrazione su PicoChip. Il picco di 25 nt è il controllo per la quantificazione. La linea di base bassa indica una bassa degradazione e i 2 picchi principali sono gli RNA ribosomici. Vengono mostrati i 3 campioni utilizzati per RT-qPCR, la loro qualità è rappresentativa di tutti i campioni di RNA utilizzati in questo studio e le loro concentrazioni stimate riflettono la variazione dell'RNA totale ottenuto tra i campioni. (B) RT-qPCR dimostra la specificità dello smistamento di celle secondarie (SC) e cellule principali (MC). La quantificazione dell'espressione genica viene eseguita utilizzando la formula q-2(40-Cq). Ogni triplice di ogni gene in ogni condizione viene normalizzato alla quantità media di RNA alfa-tubulina per compensare la variazione totale dell'RNA. Le barre di errore mostrano la deviazione standard. WT significa tipo selvaggio e D1 si riferisce al mutante iab-6cocuD1. Questa cifra è stata modificata dal riferimento27. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: QC sui dati di sequenziamento dell'RNA. (A) Analisi dei componenti principali (PCA) su set di dati di sequenziamento dell'RNA WT-1,-2,-3 (punti verdi) e D1-1,-2,-3 (punti blu). (B-E) Letture di sequenziamento mappate al genoma di riferimento della Drosophila utilizzando il software IGV. Viene visualizzato un solo campione rappresentativo di ciascun genotipo per motivi di chiarezza (WT-1 e D1-2) e vengono visualizzati solo alcuni loci specifici. I nomi genici sono scritti sopra ogni pannello, > e < simboli si riferiscono al loro orientamento. I numeri tra parentesi rappresentano per ogni traccia la scala per il numero di letture per coppia di basi di DNA. Questa scala è la stessa per entrambe le condizioni per un determinato gene, ma varia tra i geni per una migliore visualizzazione. Le barre blu nella parte inferiore di ogni pannello mostrano gli introni dei geni (linea sottile), gli esoni (linea larga) e l'ORF (rettangoli con >>). Si noti che Rab19 e Arl5 sono geni convergenti sovrapposti (C). Questa cifra è stata modificata dal riferimento27. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Primer utilizzati per RT-qPCR in questo studio: | ||
| Gene bersaglio | Primer in avanti | Primer inverso |
| alfa-Tubulina | TTTTCCTTGTCGCGTGAA | CCAGCCTGACCAACATGGAT |
| 18S rRNA | CTGAGAAACGGCTACCCCATC | ACCAGACTTGCCCCCAAT |
| Rab19 | CAGGAGAGGTTCGCACTATTAC | TTGGAAAAGGAAGGCTTG |
| Peptide del sesso | GGAATGGCGGGGATAGGATAGA | TAACATCTCTCTCTCCCAGGC |
| Msa | CTCATCTGCGTCTCTCGTG | CAGCTCCGTTGTAATCTCTCMAGGC |
Tabella 1: sequenza Primers
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Discussion
I metodi per la dissociazione cellulare dal tessuto della Drosophila come i dischi immaginari sono già descritti23. I nostri tentativi di utilizzare semplicemente queste procedure sulle ghiandole accessorie fallirono, incoraggiandoci a sviluppare questo nuovo protocollo. La digestione proteasi e la triturazione meccanica sono stati i passi critici che abbiamo colpito per il successo della procedura, e abbiamo quindi inserito molte note nelle sezioni da 2 a 5 per aiutare gli sperimentatori a ottenere risultati soddisfacenti. Affinché la dissociazione abbia successo, i peptidasi devono raggiungere le cellule della ghiandola accessoria, che sono protette dal liquido seminale viscoso nel lume e dallo strato muscolare intorno alla ghiandola. La dissezione della parte dissarica delle ghiandole è stata quindi critica (passaggio 3.6). Inoltre, era necessaria digerire per 60 min almeno con agitazione vigorosa (passaggio 4.1). La dissociazione delicata con la soluzione di trypsina (ad esempio, TrypLE) ha preservato l'integrità della ghiandola e la vitalità delle cellule fino alla dissociazione meccanica. L'aggiunta di papaina o collagenasi in associazione con la soluzione di trypsin ha migliorato la dissociazione (la dissociazione perfetta è stata ottenuta con meno pipettaggio, con conseguente migliore sopravvivenza cellulare). Tuttavia, nessuno di questi enzimi era sufficiente a dissociare le cellule da soli. La pipettatura con punte strette arrotondate generate nella parte 2.2.2 è un passo chiave per questo metodo. Quindi, questa triturazione (passaggi 5.2-5.3) dovrebbe essere ottimizzata in esperimenti su piccola scala per scegliere la migliore combinazione di suggerimenti (vedi nota nel passaggio 5.3).
Utilizzando questo protocollo, si sarà in grado di isolare 500-800 cellule secondarie vive da 40 maschi. Questo rappresenta il 20% del usd (5%) recupero considerando 3.200 SC come materiale di partenza (40 maschi x 80 SC). L'efficienza del 20% era abbastanza alta per il sequenziamento dell'RNA poiché potevamo elaborare più campioni in un giorno. Tuttavia, questo potrebbe essere migliorato con diversi metodi tra cui: lavorare in lotti più grandi; fare la triangolazione nel tubo di digestione e saltare il passaggio 5.4 per ridurre i trasferimenti; triturare molto delicatamente (alcune cellule dissociate di GFP muoiono poco dopo il passaggio 5.3); riduzione del periodo tra la dissociazione e la FACS; diminuendo il tempo di digestione utilizzando la soluzione trypsin a una maggiore concentrazione; utilizzando parametri meno rigorosi per la selezione singlet (passaggio 6.2.3) e l'ordinamento interrotto. Una limitazione di questo protocollo è che ci vogliono diverse ore per isolare le cellule; quindi non è adatto a studiare cambiamenti di espressione genica molto transitoria. Con questo protocollo, 4 x 20 maschi possono essere elaborati da una sola persona (con allenamento) in una mattina, consentendo l'estrazione di RNA da SC di due diverse condizioni in 1 giorno (Figura 1). In particolare, più sperimentatori possono partecipare alla raccolta delle ghiandole accessorie (passaggi 3.1-3.3) al fine di elaborare più campioni nello stesso giorno. Tuttavia, i passaggi 3.4 in poi saranno eseguiti preferibilmente dalla stessa persona per massimizzare la riproducibilità.
Le cellule secondarie svolgono funzioni essenziali per la fecondità maschile12,20,24, ma il quadro completo dei geni che esprimono per adempiere a questo ruolo è ancora mancante. Qui, descriviamo come ottenere il trascrittoma di queste cellule da un numero relativamente piccolo di mosche, consentendo il confronto dell'espressione genica in SC in condizioni diverse. Qui, è stato utilizzato un mutante che colpisce la funzione E la morfologia di SC, e importanti cambiamenti nel suo trascrittoma sono visibili. Questo metodo potrebbe quindi aiutare a identificare i nuovi geni SC necessari per la loro funzione. A nostra conoscenza, l'unico metodo alternativo per ottenere il trascrittoma SC è stato eseguito nel nostro laboratorio raccogliendo manualmente le SC. Sono stati ottenuti dati di sequenziamento dell'RNA di buona qualità, ma la procedura era troppo laboriosa per essere eseguita in più condizioni. Confronteremo i nostri set di dati SC RNAseq e analizzeremo il loro significato biologico sulla biologia SC in un documento distinto (in preparazione).
In futuro, questa tecnica non solo farà luce sul trascrittoma sfumato di tipo selvatico SC, ma consentirà anche di studiare l'impatto dell'ambiente o dell'alterazione genica sul trascrittoma delle cellule della ghiandola accessoria. Il numero SC, la morfologia e il contenuto vacuolare hanno dimostrato di dipendere dalla dieta maschile, dallo stato di accoppiamento e dall'età21,25,26. Abbiamo ancora una comprensione limitata dei percorsi genetici coinvolti e confrontare i trascrittomi SC in diverse condizioni sarebbe perspicace. Questo protocollo veloce e relativamente semplice consentirà tali studi. È importante sottolineare che questo metodo consente di isolare le cellule principali dagli stessi individui, e potrebbe quindi essere utilizzato in quanto è per determinare se i parametri genetici e ambientali influenzano entrambi i tipi di cellule della ghiandola accessoria contemporaneamente.
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Disclosures
Gli autori non hanno alcuna divulgazione.
Acknowledgments
Siamo grati ai membri del laboratorio Karch, alla piastra di genomica iGE3, alla struttura centrale Flow Cytometry dell'Università di Ginevra e al Dr. Jean-Pierre Aubry-Lachainaye che ha stabilito il protocollo per FACS. Ringraziamo Luca Stickley per il suo aiuto nella visualizzazione delle letture su IGV. Ci ringraziamo per il gentile permesso di riutilizzare le figure, e gli editori per averci spinto ad essere creativi con la scrittura.
Questa ricerca è stata finanziata dallo Stato di Ginevra (CI, RKM, FK), dal Fondo nazionale svizzero per la ricerca (www.snf.ch) (FK e RKM) e dalle donazioni della Fondazione Claraz (FK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-wells Tissue Culture plate | VWR | 734-2325 | |
| Binocular microscope for dissection | |||
| Binocular with light source for GFP | |||
| Bunsen | |||
| Draq7 0.3 mM | BioStatus | DR71000 | |
| Plastic microtubes 1.5 mL | Eppendorf | ||
| FACS | Beckman Coulter | MoFlo Astrios | |
| Fine dissection forceps | |||
| Foetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | heat inactivated prior to use |
| Glass dishes for dissection | |||
| Ice bucket | |||
| ImProm-II Reverse Transcription System | Promega | A3800 | |
| MasterPure RNA Purification Kit | Epicentre | MCR85102 | |
| Nextera XT kit | illumina | https://emea.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html | |
| P1000 | Gilson | ||
| P20 | Gilson | ||
| P200 | Gilson | ||
| Papain | 50U/mL stock | ||
| PBS | home made | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
| PolydT primers | |||
| Random hexamer primers | |||
| RNA 6000 Pico kit | Agilent | ||
| Schneider’s Drosophila medium | Gibco | 21720-001 | |
| SMARTer cDNA synthesis kit | Takara | https://www.takarabio.com/products/cdna-synthesis/cdna-synthesis-kits/smarter-cdna-synthesis-kits | |
| SYBR select Master mix for CFX | applied biosystems | 4472942 | |
| Thermo Shaker | Hangzhou Allsheng intruments | MS-100 | |
| Tipone 1250 μL graduated tip | Starlab | S1161-1820 | |
| Tipone 200 μL bevelled tip | Starlab | S1161-1800 | |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604013 | |
| Vortex |
References
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