Summary
Denne artikkelen beskriver en metode for å klult og analysere glomerulære parietale epitelceller utvekster av innkapslede glomeruli isolert fra mus nyre. Denne metoden kan brukes til å studere veier involvert i parietal epitelcelleproliferasjon og migrasjon.
Abstract
Parietal epitelcelle (PEC) aktivering er en av de viktigste faktorene som er involvert i utvikling og progresjon av glomerulosklerose. Hemming av veier involvert i parietal epitelcelleaktivering kan derfor være et verktøy for å dempe utviklingen av glomerulære sykdommer. Denne artikkelen beskriver en metode for kultur og analysere parietal epitelcelleutvekst av innkapslede glomeruli isolert fra mus nyre. Etter disseksjonering av isolerte musnyrer blir vevet hakket, og glomeruli isoleres ved sikting. Innkapslede glomeruli samles, og enkeltglomeruli er kultivert i 6 dager for å oppnå glomerulær utvekst av parietale epitelceller. I løpet av denne perioden kan parietal epitelcellespredning og migrasjon analyseres ved å bestemme cellenummeret eller overflatearealet til utvoksende celler. Denne analysen kan derfor brukes som et verktøy for å studere effekten av et endret genuttrykk hos transgene- eller knockout-mus eller effekten av kulturforhold på parietal epitelcellevekstegenskaper og signalering. Ved hjelp av denne metoden kan viktige veier som er involvert i prosessen med parietal epitelcelleaktivering og følgelig i glomerulosklerose studeres.
Introduction
Glomerulære sykdommer er en viktig gruppe nyresykdommer og representerer en viktig årsak til terminal nyresykdom (ESRD). Dessverre er spesifikke behandlingsalternativer begrenset og progresjon til ESRD er uunngåelig. Glomerulære sykdommer defineres av tilstedeværelsen av glomerulær skade og kan grupperes i inflammatoriske og ikke-inflammatoriske sykdommer. Selv om den første fornærmelsen er forskjellig, har nyere studier vist at en vanlig cellulær mekanisme fører til glomerulær epitelcellehyperplasi og til slutt til glomerulosklerose i alle glomerulære sykdommer, uavhengig av den underliggende årsaken1,2,3,4.
Spesielt ble det vist at glomerulosklerotiske lesjoner hovedsakelig består av aktiverte parietale epitelceller5,6. Under fysiologiske forhold er parietale epitelceller flate quiescent epitelceller som linje Bowmans kapsel av glomerulus. Imidlertid kan enhver glomerulær skade enten på grunn av genetiske mutasjoner (f.eks. podocyte spesifikke eller mitokondriecy cytopatier), betennelse eller hyperfiltrering (f.eks. forårsaket av redusert nyremasse, hypertensjon, fedme eller diabetisk mellitus) utløse aktivering av pariettale epitelceller. Aktiverte parietale epitelceller sprer seg og deponerer ekstracellulær matrise som resulterer i dannelse av cellulære halvmåne eller sklerotiske lesjoner5,,7,,8. Progresjon av disse prosessene resulterer i tap av nyrefunksjon9. Derfor er parietal epitelcelleaktivering en nøkkelfaktor i utvikling og progresjon av glomerulosklerose i både inflammatoriske og ikke-inflammatoriske glomerulære sykdommer1,2,3,4,10.
De molekylære prosessene som medierer parietal epitelcelleaktivering, er fortsatt i stor grad ukjente. Nyere studier viser at aktiverte parietale epitelceller de novo express CD44, en reseptor som er viktig for aktivering av ulike veier involvert i cellulær spredning og migrasjon. Videre ble hemming av CD44 vist å hemme parietal epitelcelleaktivering og dempe utviklingen av halvmånedannelse og glomerulosklerose i dyremodeller av inflammatoriske samt ikke-inflammatoriske glomerulære sykdommer11,12.
Som parietal epitelcelleaktivering er en nøkkelspiller for utvikling av glomerulosklerose og halvmånedannelse, kan hemming av disse cellene bremse utviklingen av glomerulære sykdommer. Belysing av de molekylære banene som driver parietal epitelcelleaktivering, kan føre til utvikling av spesifikke terapeutiske inngrep som demper dannelsen av hyperplastiske og glomerulosklerotiske lesjoner i glomerulær sykdom.
I eksperimentelle dyremodeller er det ofte vanskelig å gi bevis for en direkte effekt av et endret genuttrykk (knock-out modeller eller transgene musemodeller) eller narkotikabehandling på parietal epitelceller. I en konvensjonell knock-out mus kan de observerte in vivo-endringene forklares ved direkte endringer i parietale epitelceller. Men siden genuttrykket også endres i andre celletyper i musen, kan man ikke utelukke indirekte effekter mediert av andre celletyper. Utviklingen av betingede cre-lox mus drevet av arrangører hovedsakelig aktive i parietal epitelceller har gitt en løsning i noentilfeller 13. Likevel er betingede transgene modeller komplekse, og selv om mer betingede linjer blir tilgjengelige, er det for mange av de konvensjonelle knock-out eller transgene muselinjene ennå ikke en betinget erstatning.
For å studere de direkte effektene på parietale epitelceller, har vår gruppe utviklet en ex vivo-analyse ved hjelp av enkeltinnkapslede glomeruli isolert fra musnyrer for å måle og analysere parietal epitelcelleproliferasjon og migrasjon. Denne metoden vil gjøre oss i stand til å bestemme parietal epitelcellespesifikke effekter og å finne ansvarlige veier for parietal epitelcelleaktivering og testbehandlingsalternativer for å hemme denne aktiveringen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk ble utført i henhold til retningslinjene til Dyreetikkkomiteen ved Radboud University Nijmegen.
MERK: Ubehandlede, friske villtypemus (WT) mus (n = 4) og cd44-/- (n = 4) mus ble ofret i en alder av 12-16 uker. Både mannlige og kvinnelige mus ble brukt. Alle musene var på C57Bl/6-bakgrunnen.
1. Mus nyre disseksjon
- Ofre friske WT-mus eller genetisk endrede mus ved cervical dislokasjon.
- Dissekere hele musenyrene rett etter å ha ofret musene. For dette, utføre en median laparotomi ved hjelp av abdominal saks, kutte huden og deretter magemusklene. Fjern tarmen og plasser den ved siden av musen.
- Frigjør nyrene fra å koble vev og trekke ut nyrene ved hjelp av kirurgiske tang, kutte nyrearterien, nyrevenen og urineren med saks.
- Fjern nyrekapsene fra nyrene ved å holde nyrene med kirurgiske tang og trekk av kapselen ved hjelp av et annet par tang.
- Plasser nyrene i en 6-brønns cellekulturplate (2 nyrer/brønn) tilberedt med 2 ml Hanks' balanserte saltløsning (HBSS) per brønn og legg på is.
2. Isolering av glomeruli fra mus nyre
- Overfør nyrene til en 100 mm petriskål og hakk nyrene i små biter på 1−2 mm ved hjelp av to skalpeller. Hold de hakkete nyrebitene våte med 1–2 ml HBSS.
- Plasser de hakkete nyrebitene på toppen av en 300 μm metallsil og trykk nyrene gjennom silen ved hjelp av et stempel på en 20 ml sprøyte. Skyll silen gjentatte ganger med HBSS i mellom og samle gjennomstrømningen i en ren petriskål ved hjelp av en serologisk pipet. Samle også alt som gjenstår / stikker til undersiden av silen ved å skrape den av med skalpellen og overføre den til den innsamlede gjennomstrømningen (nyre homogenat).
- Skyll nyre homogenatet gjennom en 75 μm sil med HBSS. Samle gjennomstrømningen og skyll deretter denne gjennomstrømningen gjennom en 53 μm sil. Vask begge siktene med HBSS for å fjerne alle mindre strukturer.
MERK: I dette trinnet er flyten bare skylt, men ikke presset gjennom 75 μm og 53 μm sikt. Vasking med HBSS er nødvendig for å fjerne rusk og mindre strukturer på siktene. Normalt brukes normalt 200−300 ml HBSS totalt. - Samle nyrestrukturer / materiale som forblir på 75 μm og 53 μm sikt ved å vaske den øvre overflaten av silene med Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) supplert med 20% fosterkalv serum (FCS) og overføre materialet til en 6-godt ultra-lav feste mikroplate.
MERK: For å vaske den øvre overflaten av silen, skyll silen i skråstilling (>45°) og samle nyrematerialet på kanten av silen. Det innsamlede materialet er beriket for innkapslet samt innkapslet glomeruli, som bare viser noen få rørformede fragmenter. Innkapslet glomeruli er veldig klebrig. For å samle enkelt glomeruli, er det derfor viktig å forhindre glomeruli å holde seg til overflaten av en Petri parabolen eller brønnplate. For å unngå overholdelse, bruk medium med 20% FCS og bruk ultra-lave festeplater for dette trinnet.
3. Kulturing av glomerulær utvekst
- Før den ultra-lave festemikroplaten til et invertert lysmikroskop og samle enkelt innkapslet og/eller dekapslet glomeruli med en 20 μL pipette. Unngå pipettering av andre strukturer og rusk. Etter å ha samlet en enkelt glomerulus i pipettespissen, tilsett friskt DMEM medium uten samlet nyremateriale i samme pipettespiss til et volum på 20 μL.
- Overfør enkelt glomerulus med 20 μL DMEM medium til midten av en brønn av en 24-brønn celle kultur plate og inkubere i 3 t ved 37 ° C og 5% (v / v) CO2 for å tillate vedlegg av glomerulus til midten av brønnen. Flytt forsiktig platen for å unngå å flyte av glomerulus til boarders av brønnen.
- Etter 3 h inkubasjon er glomerulus festet til midten av brønnen. Legg forsiktig til 500 μL endotelbasalmedium (EBM) supplert med et vekstfaktorsett som inneholder hydrokortison, human endotelvekstfaktor, storfe hjerneekstrakt og gentamicinsulfatamfotericin B (Tabell over materialer) og ytterligere 5 % (v/v) FBS og 1 % (v/v) penicillin/streptomycin (penn/strep) til hver brønn.
- Kultur enkelt glomeruli i 6 dager ved 37 °C, 5% (v/v) CO2.
MERK: Innen 6 dager dannes utveksten bestående av parietale epitelceller. Hvis man tar sikte på å teste effekten av spesifikke forbindelser eller legemidler på parietal epitelceller, bør det legges til mediet i denne seks-dagers perioden.
4. Analyse av parietal epitelcelleproliferasjon
- Analyser den glomerulære utveksten etter 6 dager. Ta mikroskopiske bilder ved hjelp av et digitalt invertert lysmikroskop.
- Bruk en bildeanalyseprogramvare (f.eks. ImageJ/FIJI) til å bestemme overflatearealet og diameteren på den glomerulære utveksten, og antall utvoksende celler eller utvoksende glomeruli.
- For å bestemme overflatearealet av glomerulær utvekst, åpne tif. fil av glomerulær utvekst med skala bar i ImageJ. Tegn en rett linje på skalalinjen og bestem avstanden i piksler ved å klikke på analyser og mål (f.eks. 1 mm = 460 piksler).
- Bestem vekten ved å klikke på analyser,angi skala og skriv inn den kjente avstanden i piksel (f.eks. 460), også skriv inn den kjente avstanden (f.eks. 1) og lengdenheten (f.eks. 1 mm). Klikk ok.
- Bestem hvilke resultater som skal vises i resultattabellen ved å klikke på analyser og deretter angi målinger. For å bestemme overflatearealet av glomerulær utvekst, aktiver alternativområdet og displayetiketten. Klikk ok.
- For å bestemme overflatearealet av glomerulær utvekst, tegn et fritthåndsvalg rundt den glomerulære utveksten. Klikk på analysere og deretter måle, vil en resultattabell dukke opp i ImageJ som viser overflatearealet av utvekst i den tidligere bestemte skalaen (se trinn 4.4, f.eks. mm2).
5. Karakterisering av den glomerulære celle utveksten
MERK: For å vurdere den cellulære sammensetningen av utveksten utføres immunfluorescensfarging for cellespesifikke markører på de glomerulære utvekstene ved t = 6 dager.
- Fjern forsiktig mediet og vask glomerulien forsiktig to ganger med fosfatbufret saltvann (PBS).
- Fikser i 10 min ved romtemperatur ved bruk av 2 % (w/v) paraformaldehyd (PFA) supplert med 4 % (w/v) sukrose i PBS og vask forsiktig 2x med PBS.
- Inkuber med det primære antistoffet med passende konsentrasjon (Tabell over materialer) fortynnet i PBS-ovine serumalbumin (BSA) 1 % (v/v) i 1 timer ved romtemperatur.
- Fjern antistoffoppløsningen og vask forsiktig 3x med PBS.
- Inkuber med sekundært antistoff (Tabell over materialer) fortynnet i PBS-BSA 1% (v / v) i mørket i 45 min ved romtemperatur.
- Vask forsiktig 3x med PBS og monter forsiktig med 1-2 dråper vandig monteringsmedium med 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) for å visualisere kjerner og dekke brønnen med en rund dekkslip.
- Ta mikroskopiske bilder ved hjelp av et fluorescerende mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et systematisk diagram over metoden for å utføre den glomerulære utvekstanalysen er vist i figur 1. Figur 2A-D viser glomerulære utvekster av innkapslede glomeruli på forskjellige tidspunkter som observert ved hjelp av lysmikroskopi. Utvekster vises på dag 2, 4 og 6 (Figur 2B-D)i kultur etter glomerulus isolasjon fra mus nyre. For å bekrefte at de utvoksende cellene er parietale epitelceller, har halshugget glomeruli også blitt isolert og kultivert i 6 dager som vist i figur 2E, F. Decapsulated glomeruli viste ingen celleutvekst i inkubasjonsperioden innen 6 dager. I figur 3ble immunofluorescensfarging utført for forskjellige parietale epitelcellemarkører, podocytespesifikke markører samt endotelcellemarkører. Resultatene bekrefter at de utvoksende cellene faktisk er parietale epitelceller. Figur 4 viser utveksten av isolerte innkapslede glomeruli fra cd44-/- vs WT mus etter 6 dager i kultur. Glomeruli isolert fra cd44-/- mus viste et redusert antall utvoksende celler samt et redusert overflateareal av glomerulær utvekst sammenlignet med glomeruli isolert fra WT mus, noe som tyder på en viktig rolle for CD44 i parietal epitelcelleaktivering som publisert tidligere11. I figur 5bestemmes et eksempel, der overflatearealet til de utvoksende parietale epitelcellene bestemmes ved hjelp av ImageJ.
Figur 1: Skjematisk oversikt over metoden for å utføre en glomerulær utvekstanalyse for å analysere parietal epitelcelleproliferasjon. (1) Nyrer er dissekert fra ofret mus og hakket i små biter. (2) Nyrevev presses gjennom 300 μm sikt og skylles gjennom 75 μm og 53 μm sikter. (3) Glomeruli som forblir på toppen av silene samles opp ved hjelp av medium + 20% (v / v) FCS og overføres til en ultra-lav festeplate. (4) Enkelt glomeruli samles opp ved hjelp av et omvendt lysmikroskop og overføres til 24-brønns kulturplater. (5) Etter inkubasjon ved 37 °C, 5 % (v/v) CO2 i 6 dager, kan glomerulær utvekst analyseres ved hjelp av et digitalt invertert lysmikroskop. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Glomerulær utvekst av isolerte innkapslede glomeruli fra nyrer dissekert fra WT-mus. Utveksten av innkapslede glomeruli inkuberes ved 37 °C vises ved forskjellige tidspunkter: (A) 0 dager, (B) 2 dager, (C) 4 dager, og (D) 6 dager. Decapsulated glomeruli ble også isolert og dyrket ved 37 ° C og mikroskopiske bilder ble tatt på (E) dag 0 og (F) dag 6 viser ingen utvoksende celler. Vektlinjer: (A,E,F) 200 μm, (B) 400 μm, (C, D) 1000 μm. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Utvoksende glomerulære celler viser uttrykk for parietal epitelcellemarkør. Immunofluorescensfarging ble utført på dag 6 etter isolering av enkeltinnkapslede glomeruli for å karakterisere de utvoksende epitelcellene. Utvoksende celler farget positivt for parietal epitelcellemarkører: (A) CD44, (B) SSeCKS og (C) claudin-1, men viste ikke uttrykk for (D) den podocytespesifikke markøren synaptopodin eller (E) den endotelcellespesifikke markøren CD31, som utelukkende ble lokalisert inne i glolerulus. Skalalinjer: (A, B, D, E) 100μm, (C) 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Glomerulær utvekst er svekket i glomeruli isolert fra CD44 knockout mus. Innkapslede glomeruli ble isolert fra dissekert nyrer av (A) WT mus og (B) cd44-/- mus. Mikroskopiske bilder ble tatt etter 6 dager i kulturen ved hjelp av et digitalt invertert lysmikroskop. Antallet utvoksende parietale epitelceller samt overflatearealet av utvekst ble økt i glomeruli fra WT-mus sammenlignet med cd44-/- mus, noe som tyder på en viktig rolle for CD44 i parietal epitelcelleaktivering. Skala barer: 1000 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Et eksempel på analysen av overflatearealet av den glomerulære utveksten som en markør for parietal epitelcelleproliferasjon ved hjelp av ImageJ (FIJI). (A)Glomerulær utvekst av en innkapslet glomerulus av en WT mus etter 6 dager i kultur ved 37 °C. (B) Først er skalaen fast bestemt på å analysere overflatearealet i mm2. Her: 1 mm = 460 piksler. (C) Etter at du har satt skalaen, tegnes en utvalgslinje rundt området med glomerulær utvekst. (D) Dette valgte området kan deretter måles (overflateareal i dette eksemplet = 2,235 mm2). Skala barer: 1000 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ved hjelp av protokollen som er beskrevet i denne artikkelen, kan man bruke enkeltinnkapslede glomeruli for å evaluere parietal epitelcelleproliferasjon som er en konsekvens av parietal epitelcelleaktivering. Denne ex vivo-modellen vil gjøre oss i stand til å studere i detalj de molekylære banene, som er involvert i parietal epitelcelleaktivering. Den beskrevne metoden er avhengig av det enkle konseptet med nyredisseksjon og sikting for å isolere og kultur innkapslet glomeruli og å sammenligne spredning og/eller migrering av parietale epitelceller under forskjellige eksperimentelle forhold. Resultatene som kan analyseres etter 6 dager i kultur er for eksempel overflatearealet eller diameteren av utveksten eller antall utvoksende celler av en enkelt kapslet glomerulus. En annen anvendelse for denne analysen kan være å studere effekten av legemidler som induserer eller hemme molekylære veier som kan være involvert i parietal epitelcelleaktivering.
Immunofluorescensfarging bekreftet at de utvoksende cellene etter 6 dager i kulturen er parietale epitelceller da de farget positivt for parietale epitelcellemarkører (CD44, claudin-1, SSeCKS), men uttrykte ikke podocyte-spesifikke markør synaptopodin, eller endotelcellemarkørene CD31. I tråd med resultatene av fargingen kan ingen utvoksende celler observeres 6 dager etter isolasjon og kultur av enkelt halshugget glomeruli, noe som indikerer at det er begrenset forurensning av andre glomerulære celler i celleutveksten i denne 6-dagers perioden. En annen studie analyserte også glomerulær utvekst og viste at de raske prolifererende cellene avledet fra den glomerulære utveksten faktisk er etterkommer fra parietale epitelceller14.
Fargeprotokollen som ble brukt til å analysere markøruttrykket til de utvoksende cellene, kan også tilpasses for å teste andre molekyler av interesse. Immunstainingen ble utført inne i brønnene til platene der glomeruli ble inkubert i 6 dager. Disse brønnene var ikke belagt, men glomeruli festet til brønnene i løpet av den første 2-3 h inkubasjon. Inkubasjon på glassinnlegg eller et kammerskliesystem som ville resultere i bedre avbildning var ikke mulig da glomeruli ikke festet helt til overflaten og glomerulær utvekst ble svekket. Denne spesifikke protokollen ble nylig satt opp for å studere parietal epithelia celle utvekst fra glomeruli av sunn WT og cd44-/- mus11. Ved hjelp av denne metoden ble det vist at CD44-mangelfulle parietale epitelceller viser en redusert spredningshastighet, som også er demonstrert i figur 4. Denne metoden kan også brukes til mus av andre stammer og også for andre genetisk endrede mus. I en tidligere studie for eksempel ble en sammenlignbar tilnærming brukt til å analysere effekten av glukokortikoidreseptorsignalering15.
Bruken av denne teknikken for å isolere glomeruli fra mus og analysere cellulære utvekster har mange fordeler mot bruk av udødelige parietale epitelcellelinjer for analyse av veier som er involvert i parietal epitelcelleaktivering eller legemidler som kan påvirke prosessen med epitelcelleproliferasjon. Først, i denne metoden, brukes primære celler som direkte vokser ut av glomerulus og er bare 6 dager i kultur. Derfor gjennomgikk parietale epitelceller fra glomerulære utvekster færre endringer i fenotype sammenlignet med udødelige cellelinjer, som trenger ytterligere vekstpassasjer for å skape cellelinjen16. Videre kan metoden som er beskrevet her brukes til å sammenligne effekten av spesifikk genknockout på parietal cellespredning også for veier som er vanskelige å slå ut i cellelinjer på grunn av nedsatt cellevekst eller effektivitet av genknockout ved hjelp av deaktiveringsmetoder.
For å tilpasse protokollen til andre dyremodeller eller til menneskelig nyrevev, bør størrelsen på siktene optimaliseres for å oppnå det beste resultatet. Dette skyldes at den glomerulære størrelsen varierer mellom artene og derfor varierer størrelsen på silene som glomeruliene kan samles på. Det er også viktig å isolere intakt innkapslet glomeruli med det formål å denne metoden. Derfor skal glomeruli ikke trykkes, men skylles forsiktig gjennom de mindre siktene.
Et annet kritisk skritt i protokollen er samlingen av innkapslet glomeruli etter sikting. Her er det viktig å bruke medium med 20% FCS for å unngå vedlegg av glomeruli til hverandre. I tillegg bør løsningen beriket med glomeruli overføres direkte til ultralave vedheftplater fordi glomeruli ellers vil feste seg direkte til overflaten av vanlige cellekulturplater og til og med til overflaten av plastrør som gjør det vanskelig å fange og isolere enkeltglomeruli.
Etter samling av enkelt innkapslede glomeruli, bør disse dyrkes 3 timer i et lite volum av kulturing medium i sentrum av brønnen for å tillate etterlevelse. Flytende av glomeruli mot boarder av brønnene bør unngås for å optimalisere avlesningen under bildeanalyse.
For å oppnå de beste resultatene ved hjelp av protokollen som er beskrevet her, vil vi anbefale å kulture enkeltglomeruli og utføre opplesingen på dag 6. På dette tidspunktet kan en homogen cellulær utvekst bestående av parietale epitelceller observeres. På senere tidspunkt blir glomerulær utvekst fenotypisk heterogen som indikerer utvekst av andre celletyper. Derfor synes protokollen ikke å være egnet for svært lange inkubasjonstider. Man bør huske på at inkubasjonstider for parietal epitelcellevekst kan variere mellom arter eller mellom forskjellige musestammer. Derfor bør kulturtider testes og optimaliseres for hver musestamme eller art. I tillegg bør opprinnelsen til glomerulær utvekst alltid validert ved farging for parietal epitelcellespesifikke markører.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av dutch Kidney foundation (grant 14A3D104) og Nederland Organization for Scientific Research (NWO VIDI stipend: 016.156.363).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well cell culture plate | Corning Costar | ||
| anti-CD31 | BD Pharmingen | Endothelial cell marker (used concentration 1:200) | |
| chicken-anti-rat Alexa 647 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) | |
| DAPI-Fluoromount G | Southern Biotech | Mounting medium containing DAPI | |
| Digital inverted light microscope | Westburg, EVOS fl microscope | ||
| donkey-anti-goat Alexa 568 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) | |
| donkey-anti-rabbit Alexa 568 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium | Lonza | ||
| EBM Medium | Lonza | ||
| EBM-MV Single Quots kit | Lonza | containing hydrocortisone, hEGF, GA-1000, FBS and BBE | |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | ||
| Fetal Calf Serum | Lonza | ||
| Fluorescent microscope | Leica Microsystems GmbH | ||
| goat-anti-synaptopodin | Santa Cruz | Podocyte marker (used concentration 1:200) | |
| Hanks'Balanced Salt Solution | Gibco | ||
| ImageJ software | FIJI 1.51n | ||
| petri dish | Sarstedt | size 100 | |
| rabbit-anti-claudin1 | Abcam | Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:100) | |
| rabbit-anti-SSeCKS | Roswell Park Comprehensive Cancer Center,Buffalo, NY, USA | kindly provided by Dr. E. Gelman, Parietal epithelial cell marker | |
| rat-anti-CD44 | BD Pharmingen | Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:200) | |
| scalpel | Dahlhausen | size 10 | |
| Sieves | Endecotts Ltd | size 300 µm, 75 µm, 53 µm, steel | |
| syringe | BD Plastipak | size: 20 ml | |
| Ultra-Low Attachment Microplates | Corning Costar | 6-well plates |
References
- Fatima, H., et al. Parietal epithelial cell activation marker in early recurrence of FSGS in the transplant. Clinical journal of the American Society of Nephrology: CJASN. 7 (11), 1852-1858 (2012).
- Dijkman, H. B., et al. Proliferating cells in HIV and pamidronate-associated collapsing focal segmental glomerulosclerosis are parietal epithelial cells. Kidney International. 70 (2), 338-344 (2006).
- Kuppe, C., et al. Common histological patterns in glomerular epithelial cells in secondary focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 88 (5), 990-998 (2015).
- Dijkman, H., Smeets, B., van der Laak, J., Steenbergen, E., Wetzels, J. The parietal epithelial cell is crucially involved in human idiopathic focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 68 (4), 1562-1572 (2005).
- Smeets, B., et al. Parietal epithelial cells participate in the formation of sclerotic lesions in focal segmental glomerulosclerosis. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 22 (7), 1262-1274 (2011).
- Smeets, B., et al. Tracing the origin of glomerular extracapillary lesions from parietal epithelial cells. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (12), 2604-2615 (2009).
- Smeets, B., Moeller, M. J. Parietal epithelial cells and podocytes in glomerular diseases. Seminars in Nephrology. 32 (4), 357-367 (2012).
- Ryu, M., et al. Plasma leakage through glomerular basement membrane ruptures triggers the proliferation of parietal epithelial cells and crescent formation in non-inflammatory glomerular injury. The Journal of Pathology. 228 (4), 482-494 (2012).
- Eymael, J., Smeets, B. Origin and fate of the regenerating cells of the kidney. European Journal of Pharmacology. 790, 62-73 (2016).
- Smeets, B., et al. Renal progenitor cells contribute to hyperplastic lesions of podocytopathies and crescentic glomerulonephritis. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (12), 2593-2603 (2009).
- Eymael, J., et al. CD44 is required for the pathogenesis of experimental crescentic glomerulonephritis and collapsing focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 93 (3), 626-642 (2018).
- Roeder, S. S., et al. Activated ERK1/2 increases CD44 in glomerular parietal epithelial cells leading to matrix expansion. Kidney International. 91 (4), 896-913 (2017).
- Appel, D., et al. Recruitment of podocytes from glomerular parietal epithelial cells. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (2), 333-343 (2009).
- Yaoita, E., et al. Visceral epithelial cells in rat glomerular cell culture. European Journal of Cell Biology. 67 (2), 136-144 (1995).
- Kuppe, C., et al.
- Ohse, T., et al. Establishment of conditionally immortalized mouse glomerular parietal epithelial cells in culture. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 19 (10), 1879-1890 (2008).
