Glomerulær utvekst som en Ex Vivo-analyse for å analysere veier involvert i parietal epitelcelleaktivering
Summary
Denne artikkelen beskriver en metode for å klult og analysere glomerulære parietale epitelceller utvekster av innkapslede glomeruli isolert fra mus nyre. Denne metoden kan brukes til å studere veier involvert i parietal epitelcelleproliferasjon og migrasjon.
Abstract
Parietal epitelcelle (PEC) aktivering er en av de viktigste faktorene som er involvert i utvikling og progresjon av glomerulosklerose. Hemming av veier involvert i parietal epitelcelleaktivering kan derfor være et verktøy for å dempe utviklingen av glomerulære sykdommer. Denne artikkelen beskriver en metode for kultur og analysere parietal epitelcelleutvekst av innkapslede glomeruli isolert fra mus nyre. Etter disseksjonering av isolerte musnyrer blir vevet hakket, og glomeruli isoleres ved sikting. Innkapslede glomeruli samles, og enkeltglomeruli er kultivert i 6 dager for å oppnå glomerulær utvekst av parietale epitelceller. I løpet av denne perioden kan parietal epitelcellespredning og migrasjon analyseres ved å bestemme cellenummeret eller overflatearealet til utvoksende celler. Denne analysen kan derfor brukes som et verktøy for å studere effekten av et endret genuttrykk hos transgene- eller knockout-mus eller effekten av kulturforhold på parietal epitelcellevekstegenskaper og signalering. Ved hjelp av denne metoden kan viktige veier som er involvert i prosessen med parietal epitelcelleaktivering og følgelig i glomerulosklerose studeres.
Introduction
Glomerulære sykdommer er en viktig gruppe nyresykdommer og representerer en viktig årsak til terminal nyresykdom (ESRD). Dessverre er spesifikke behandlingsalternativer begrenset og progresjon til ESRD er uunngåelig. Glomerulære sykdommer defineres av tilstedeværelsen av glomerulær skade og kan grupperes i inflammatoriske og ikke-inflammatoriske sykdommer. Selv om den første fornærmelsen er forskjellig, har nyere studier vist at en vanlig cellulær mekanisme fører til glomerulær epitelcellehyperplasi og til slutt til glomerulosklerose i alle glomerulære sykdommer, uavhengig av den underliggende årsaken1,2,3,4.
Spesielt ble det vist at glomerulosklerotiske lesjoner hovedsakelig består av aktiverte parietale epitelceller5,6. Under fysiologiske forhold er parietale epitelceller flate quiescent epitelceller som linje Bowmans kapsel av glomerulus. Imidlertid kan enhver glomerulær skade enten på grunn av genetiske mutasjoner (f.eks. podocyte spesifikke eller mitokondriecy cytopatier), betennelse eller hyperfiltrering (f.eks. forårsaket av redusert nyremasse, hypertensjon, fedme eller diabetisk mellitus) utløse aktivering av pariettale epitelceller. Aktiverte parietale epitelceller sprer seg og deponerer ekstracellulær matrise som resulterer i dannelse av cellulære halvmåne eller sklerotiske lesjoner5,,7,,8. Progresjon av disse prosessene resulterer i tap av nyrefunksjon9. Derfor er parietal epitelcelleaktivering en nøkkelfaktor i utvikling og progresjon av glomerulosklerose i både inflammatoriske og ikke-inflammatoriske glomerulære sykdommer1,2,3,4,10.
De molekylære prosessene som medierer parietal epitelcelleaktivering, er fortsatt i stor grad ukjente. Nyere studier viser at aktiverte parietale epitelceller de novo express CD44, en reseptor som er viktig for aktivering av ulike veier involvert i cellulær spredning og migrasjon. Videre ble hemming av CD44 vist å hemme parietal epitelcelleaktivering og dempe utviklingen av halvmånedannelse og glomerulosklerose i dyremodeller av inflammatoriske samt ikke-inflammatoriske glomerulære sykdommer11,12.
Som parietal epitelcelleaktivering er en nøkkelspiller for utvikling av glomerulosklerose og halvmånedannelse, kan hemming av disse cellene bremse utviklingen av glomerulære sykdommer. Belysing av de molekylære banene som driver parietal epitelcelleaktivering, kan føre til utvikling av spesifikke terapeutiske inngrep som demper dannelsen av hyperplastiske og glomerulosklerotiske lesjoner i glomerulær sykdom.
I eksperimentelle dyremodeller er det ofte vanskelig å gi bevis for en direkte effekt av et endret genuttrykk (knock-out modeller eller transgene musemodeller) eller narkotikabehandling på parietal epitelceller. I en konvensjonell knock-out mus kan de observerte in vivo-endringene forklares ved direkte endringer i parietale epitelceller. Men siden genuttrykket også endres i andre celletyper i musen, kan man ikke utelukke indirekte effekter mediert av andre celletyper. Utviklingen av betingede cre-lox mus drevet av arrangører hovedsakelig aktive i parietal epitelceller har gitt en løsning i noentilfeller 13. Likevel er betingede transgene modeller komplekse, og selv om mer betingede linjer blir tilgjengelige, er det for mange av de konvensjonelle knock-out eller transgene muselinjene ennå ikke en betinget erstatning.
For å studere de direkte effektene på parietale epitelceller, har vår gruppe utviklet en ex vivo-analyse ved hjelp av enkeltinnkapslede glomeruli isolert fra musnyrer for å måle og analysere parietal epitelcelleproliferasjon og migrasjon. Denne metoden vil gjøre oss i stand til å bestemme parietal epitelcellespesifikke effekter og å finne ansvarlige veier for parietal epitelcelleaktivering og testbehandlingsalternativer for å hemme denne aktiveringen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ved hjelp av protokollen som er beskrevet i denne artikkelen, kan man bruke enkeltinnkapslede glomeruli for å evaluere parietal epitelcelleproliferasjon som er en konsekvens av parietal epitelcelleaktivering. Denne ex vivo-modellen vil gjøre oss i stand til å studere i detalj de molekylære banene, som er involvert i parietal epitelcelleaktivering. Den beskrevne metoden er avhengig av det enkle konseptet med nyredisseksjon og sikting for å isolere og kultur innkapslet glomeruli og å sammenligne spredning og/eller mi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskningen ble støttet av dutch Kidney foundation (grant 14A3D104) og Nederland Organization for Scientific Research (NWO VIDI stipend: 016.156.363).
Materials
| 24-well cell culture plate | Corning Costar | |
| anti-CD31 | BD Pharmingen | Endothelial cell marker (used concentration 1:200) |
| chicken-anti-rat Alexa 647 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) |
| DAPI-Fluoromount G | Southern Biotech | Mounting medium containing DAPI |
| Digital inverted light microscope | Westburg, EVOS fl microscope | |
| donkey-anti-goat Alexa 568 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) |
| donkey-anti-rabbit Alexa 568 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium | Lonza | |
| EBM Medium | Lonza | |
| EBM-MV Single Quots kit | Lonza | containing hydrocortisone, hEGF, GA-1000, FBS and BBE |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | |
| Fetal Calf Serum | Lonza | |
| Fluorescent microscope | Leica Microsystems GmbH | |
| goat-anti-synaptopodin | Santa Cruz | Podocyte marker (used concentration 1:200) |
| Hanks'Balanced Salt Solution | Gibco | |
| ImageJ software | FIJI 1.51n | |
| petri dish | Sarstedt | size 100 |
| rabbit-anti-claudin1 | Abcam | Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:100) |
| rabbit-anti-SSeCKS | Roswell Park Comprehensive Cancer Center,Buffalo, NY, USA | kindly provided by Dr. E. Gelman, Parietal epithelial cell marker |
| rat-anti-CD44 | BD Pharmingen | Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:200) |
| scalpel | Dahlhausen | size 10 |
| Sieves | Endecotts Ltd | size 300 µm, 75 µm, 53 µm, steel |
| syringe | BD Plastipak | size: 20 ml |
| Ultra-Low Attachment Microplates | Corning Costar | 6-well plates |
References
- Fatima, H., et al. Parietal epithelial cell activation marker in early recurrence of FSGS in the transplant. Clinical journal of the American Society of Nephrology: CJASN. 7 (11), 1852-1858 (2012).
- Dijkman, H. B., et al. Proliferating cells in HIV and pamidronate-associated collapsing focal segmental glomerulosclerosis are parietal epithelial cells. Kidney International. 70 (2), 338-344 (2006).
- Kuppe, C., et al. Common histological patterns in glomerular epithelial cells in secondary focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 88 (5), 990-998 (2015).
- Dijkman, H., Smeets, B., van der Laak, J., Steenbergen, E., Wetzels, J. The parietal epithelial cell is crucially involved in human idiopathic focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 68 (4), 1562-1572 (2005).
- Smeets, B., et al. Parietal epithelial cells participate in the formation of sclerotic lesions in focal segmental glomerulosclerosis. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 22 (7), 1262-1274 (2011).
- Smeets, B., et al. Tracing the origin of glomerular extracapillary lesions from parietal epithelial cells. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (12), 2604-2615 (2009).
- Smeets, B., Moeller, M. J. Parietal epithelial cells and podocytes in glomerular diseases. Seminars in Nephrology. 32 (4), 357-367 (2012).
- Ryu, M., et al. Plasma leakage through glomerular basement membrane ruptures triggers the proliferation of parietal epithelial cells and crescent formation in non-inflammatory glomerular injury. The Journal of Pathology. 228 (4), 482-494 (2012).
- Eymael, J., Smeets, B. Origin and fate of the regenerating cells of the kidney. European Journal of Pharmacology. 790, 62-73 (2016).
- Smeets, B., et al. Renal progenitor cells contribute to hyperplastic lesions of podocytopathies and crescentic glomerulonephritis. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (12), 2593-2603 (2009).
- Eymael, J., et al. CD44 is required for the pathogenesis of experimental crescentic glomerulonephritis and collapsing focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 93 (3), 626-642 (2018).
- Roeder, S. S., et al. Activated ERK1/2 increases CD44 in glomerular parietal epithelial cells leading to matrix expansion. Kidney International. 91 (4), 896-913 (2017).
- Appel, D., et al. Recruitment of podocytes from glomerular parietal epithelial cells. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (2), 333-343 (2009).
- Yaoita, E., et al. Visceral epithelial cells in rat glomerular cell culture. European Journal of Cell Biology. 67 (2), 136-144 (1995).
- Kuppe, C., et al. Investigations of Glucocorticoid Action in GN. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 28 (5), 1408-1420 (2017).
- Ohse, T., et al. Establishment of conditionally immortalized mouse glomerular parietal epithelial cells in culture. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 19 (10), 1879-1890 (2008).
