Summary
Questo articolo descrive un metodo per coltivare e analizzare le escrescenze glomeriane delle cellule epiteliali glomeriali di glomeruli incapsulati isolati dal rene del topo. Questo metodo può essere utilizzato per studiare i percorsi coinvolti nella proliferazione e migrazione delle cellule epiteliali parietali.
Abstract
L'attivazione delle cellule epiteliali parietali (PEC) è uno dei fattori chiave coinvolti nello sviluppo e nella progressione della glorulosclerosi. L'inibizione delle vie coinvolte nell'attivazione delle cellule epiteliali parietali potrebbe quindi essere uno strumento per attenuare la progressione delle malattie glomerari. Questo articolo descrive un metodo per coltura e analizzare la crescita delle cellule epiteliali parietali di glomeruli incapsulati isolati dal rene del topo. Dopo aver sezionato i reni di topo isolati, il tessuto viene macinato e i glomeruli vengono isolati dalla setacciatura. I glomeruli incapsulati vengono raccolti e i glomeruli singoli vengono coltivati per 6 giorni per ottenere la crescita glomerare delle cellule epiteliali parietali. Durante questo periodo, la proliferazione e la migrazione delle cellule epiteliali parietali possono essere analizzate determinando il numero di cellule o la superficie delle cellule in crescita in emigrazione. Questo saggio può quindi essere utilizzato come strumento per studiare gli effetti di un'espressione genica alterata nei topi transgenici o knockout o gli effetti delle condizioni di coltura sulle caratteristiche e la segnalazione della crescita delle cellule epiteliali parietali. Utilizzando questo metodo, è possibile studiare importanti vie coinvolte nel processo di attivazione delle cellule epiteliali parietali e, di conseguenza, nella glomerulosclerosi.
Introduction
Le malattie glomeriari sono un importante gruppo di disturbi renali e rappresentano una delle principali cause della malattia renale allo stadio finale (ESRD). Sfortunatamente, le opzioni di trattamento specifiche sono limitate e la progressione verso l'ESRD è inevitabile. Le malattie glomerari sono definite dalla presenza di lesioni glomeriule e possono essere raggruppate in malattie infiammatorie e non infiammatorie. Anche se l'insulto iniziale è diverso, studi recenti hanno dimostrato che un meccanismo cellulare comune porta a iperplasia delle cellule epiteliali glomerale e, infine, alla glomerulosclerosi in tutte le malattie glomerari, indipendentemente dalla causa sottostante1,2,3,4.
In particolare, è stato dimostrato che le lesioni glomerulosclerotice sono composte principalmente da cellule epiteliali parietali attivate5,6. In condizioni fisiologiche, le cellule epiteliali parietali sono cellule epiteliali quiescenti piatte che riallineano la capsula del Bowman del glomerulus. Tuttavia, qualsiasi lesione glomerare dovuta a mutazioni genetiche (ad esempio, citopatie specifiche di podociti o mitocondriali), infiammazione o iperfiltrazione (ad esempio, causata da ridotta massa renale, ipertensione, obesità o mellito diabetico) può innescare l'attivazione delle cellule epiteliali parietali. Le cellule epiteliali parietali attive proliferano e depositano matrice extracellulare che si traduce nella formazione di mezzalune cellulari o lesioni sclerotiche5,7,8. La progressione di questi processi comporta la perdita della funzione renale9. Pertanto, l'attivazione delle cellule epiteliali parietali è un fattore chiave nello sviluppo e nella progressione della glomerulosclerosi nelle malattie glomerari sia infiammatorie che non infiammatorie1,2,3,4,10.
I processi molecolari che mediano l'attivazione delle cellule epiteliali parietali sono ancora in gran parte sconosciuti. Recenti studi dimostrano che le cellule epiteliali parietali attivate de novo esprimono CD44, un recettore importante per l'attivazione di diversi percorsi coinvolti nella proliferazione cellulare e nella migrazione. Inoltre, l'inibizione del CD44 ha dimostrato di inibire l'attivazione delle cellule epiteliali parietali e attenuare la progressione della formazione della mezzaluna e della glomerulosclerosi nei modelli animali di malattie glomerari e infiammatorie11,12.
Poiché l'attivazione delle cellule epiteliali parietali è un attore chiave per lo sviluppo della glomerulsclerosi e della formazione della mezzaluna, l'inibizione di queste cellule potrebbe rallentare la progressione delle malattie glomerari. La chiarificazione delle vie molecolari che determinano l'attivazione delle cellule epiteliali parietali può portare allo sviluppo di interventi terapeutici specifici che attenuano la formazione delle lesioni iperplastiche e glomerulosclerotice nella malattia glomerare.
Nei modelli animali sperimentali, è spesso difficile fornire prove di un effetto diretto di un'espressione genica alterata (modelli di eliminazione o modelli murini transgenici) o di un trattamento farmacologico sulle cellule epiteliali parietali. In un topo knock-out convenzionale i cambiamenti osservati in vivo potrebbero essere spiegati da cambiamenti diretti nelle cellule epiteliali parietali. Tuttavia, poiché l'espressione genica è alterata anche in altri tipi di cellule all'interno del mouse, non si possono escludere gli effetti indiretti mediati da altri tipi di cellule. Lo sviluppo di topi condizionati cre-lox guidati da promotori attivi principalmente in cellule epiteliali parietali ha fornito una soluzione in alcuni casi13. Tuttavia, i modelli transgenici condizionali sono complessi e, anche se diventano disponibili linee più condizionali, per molte delle linee di topo convenzionali knock-out o transgeniche non esiste ancora un sostituto condizionale.
Per studiare gli effetti diretti sulle cellule epiteliali parietali, il nostro gruppo ha sviluppato un saggio ex vivo utilizzando glomeruli singoli incapsulati isolati dai reni dei topi per misurare e analizzare la proliferazione e la migrazione delle cellule epiteliali parietali. Questo metodo ci permetterà di determinare gli effetti specifici delle cellule epiteliali parietali e di trovare vie responsabili per l'attivazione delle cellule epiteliali parietali e testare le opzioni di trattamento per inibire questa attivazione.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida del Comitato Etico Animale della Radboud University Nijmegen.
NOTA: i topi di tipo selvaggio non trattati (WT) (n - 4) e i topi cd44-/- (n - 4) sono stati sacrificati all'età di 12-16 settimane. Sono stati usati sia topi maschi che femmine. Tutti i topi erano sullo sfondo C57Bl/6.
1. Dissezione renale del topo
- Sacrifica topi WT sani o topi geneticamente alterati dalla lussazione cervicale.
- Dissect interi reni di topo direttamente dopo aver sacrificato i topi. Per questo, eseguire una laparotomia mediana utilizzando forbici addominali, tagliando la pelle e poi i muscoli addominali. Rimuovere l'intestino e posizionarlo accanto al mouse.
- Liberare i reni dal tessuto di collegamento e tirare fuori il rene con pinze chirurgiche, tagliando l'arteria renale, vena renale e ureter con le forbici.
- Rimuovere le capsule renali dai reni tenendo il rene con pinze chirurgiche ed estrarre la capsula utilizzando un altro paio di pinze.
- Mettere i reni in una piastra di coltura a 6 cellule (2 reni/bene) preparata con 2 mL di soluzione di sale equilibrato di Hanks (HBSS) per pozzo e posto su ghiaccio.
2. Isolamento del glomeruli dal rene di topo
- Trasferire i reni in un piatto Petri da 100 mm e tritare i reni in piccoli pezzi di 1/2 mm usando due bisturi. Mantenere i pezzi di rene macinati bagnati usando 1-2 mL di HBSS.
- Posizionare i pezzi di rene macinati sopra un setaccio di metallo di 300 m e premere il rene attraverso il setaccio utilizzando uno stantuffo di una siringa da 20 mL. Sciacquare ripetutamente il setaccio con HBSS in mezzo e raccogliere il flusso attraverso in una piastra Petri pulita utilizzando un pipet sierologico. Raccogliere anche tutto ciò che rimane / si attacca al lato inferiore del setaccio raschiando via con il bisturi e trasferirlo al flusso-attraverso raccolto (omogeneo renale).
- Sciacquare l'omogenea renale attraverso un setaccio di 75 m con HBSS. Raccogliere il flusso attraverso e successivamente sciacquare questo flusso attraverso un setaccio di 53 m. Lavare entrambi i setacci utilizzando HBSS per rimuovere tutte le strutture più piccole.
NOTA: In questa fase il flusso, ma non viene sciacquato solo attraverso il setaccio di 75 m e 53 m. Lavaggio con HBSS è necessario rimuovere detriti e strutture più piccole sui setacci. Pertanto normalmente vengono utilizzati in totale 200-300 mL di HBSS. - Raccogliere le strutture/materiali renali che rimangono sul setaccio 75 m e 53 m lavando la superficie superiore dei setacci con il mezzo dell'Aquila modificato di Dulbecco (DMEM) integrato con il 20% di siero di vitello fetale (FCS) e trasferire il materiale in una micropiastra di fissaggio ultra-basso a 6 bassissimi.
NOTA: Per lavare la superficie superiore del setaccio, sciacquare il setaccio in posizione inclinata (>45) e raccogliere il materiale renale sul bordo del setaccio. Il materiale raccolto è arricchito per glomeruli incapsulati e incapsulati, mostrando solo pochi frammenti tubolari. I glomeruli incapsulati sono molto appiccicosi. Per raccogliere singoli glomeruli, è quindi importante evitare che i glomeruli aderiscano alla superficie di un piatto Petri o di un piatto di pozzo. Per evitare l'aderenza, utilizzare il supporto con 20% FCS e utilizzare piastre di fissaggio ultra-basse per questo passaggio.
3. Coltura di escrescenza glomerare
- Portare la microplacca di fissaggio ultra-bassa in un microscopio luminoso invertito e raccogliere singoli glomeruli incapsulati e/o incapsulati con una pipetta da 20 l. Evitare di pipettare altre strutture e detriti. Dopo aver raccolto un singolo glomerulus nella punta della pipetta, aggiungere il nuovo supporto DMEM senza materiale renale raccolto nella stessa punta di pipetta per un volume di 20 .
- Trasferire il singolo glomerulus con il mezzo DMEM da 20 gradi al centro di un pozzo di una piastra di coltura cellulare a 24 pozze e incubare per 3 h a 37 oC e 5% (v/v) CO2 per consentire l'attaccamento del glomerulus al centro del pozzo. Spostare con attenzione la piastra per evitare di galleggiare del glomerulus ai bordodel.
- Dopo 3 h incubazione, il glomerulus è attaccato al centro del pozzo. Aggiungere con attenzione 500 l di mezzo basale endoteliale (EBM) integrato con un kit per il fattore di crescita contenente idrocortisone, fattore di crescita endoteliale umano, estratto cerebrale bovino e anfido-amphotericina b di gentamicin B (Tabella dei materiali) e ulteriore 5% (v/v) FBS e 1% (v/v) penicillina / s ptomicina (pentre) ogni beh.
- Cultura il singolo glomeruli per 6 giorni a 37 gradi centigradi, 5% (v/v) CO2.
NOTA: Entro 6 giorni si forma la crescita costituita da cellule epiteliali parietali. Se si mira a testare gli effetti di composti specifici o farmaci sulle cellule epiteliali parietali dovrebbe essere aggiunto al mezzo entro questo periodo di sei giorni.
4. Analisi della proliferazione delle cellule epiteliali parietali
- Analizzare l'escrescenza glomerare dopo 6 giorni. Scatta immagini microscopiche utilizzando un microscopio digitale a luce rovesciata.
- Utilizzare un software di analisi delle immagini (ad esempio, ImageJ/FIJI) per determinare la superficie e il diametro della crescita glomerare e il numero di cellule in crescita o glomeruli in crescita.
- Per determinare la superficie di escrescenza glomerare, aprire il tif. file della crescita glomerare con barra della scala in ImageJ. Disegnare una linea retta sulla barra della scala e determinare la distanza in pixel facendo clic su analizza e misura (ad esempio, 1 mm e 460 pixel).
- Determinare la scala facendo clic su Analizza, impostare la scala e digitare la distanza nota in pixel (ad esempio, 460), digitare anche la distanza nota (ad esempio, 1) e l'unità di lunghezza (ad esempio, 1 mm). Fare clic su OK.
- Determinare quali risultati verranno visualizzati nella tabella dei risultati facendo clic su Analizza e quindi impostare le misurazioni. Per determinare la superficie della crescita glomerare, attivare l'area delle opzioni e l'etichetta di visualizzazione. Fare clic su OK.
- Per determinare la superficie della crescita glomerare, disegnare una selezione a mano libera intorno alla crescita glomerare. Fare clic su analizza e quindi misurare, verrà visualizzata una tabella dei risultati in ImageJ che mostra la superficie di crescita della superficie nella scala determinata in precedenza (vedere il passaggio 4.4, ad esempio, mm2).
5. Caratterizzazione della crescita della cellula glomerare
NOTA: Per valutare la composizione cellulare della escrescenza, la colorazione dell'immunofluorescenza per i marcatori specifici delle cellule viene eseguita sulle escrescenze glomeriule a t e 6 giorni.
- Rimuovere con attenzione il mezzo e lavare delicatamente la glomeruli due volte utilizzando la salina con buffer fosfato (PBS).
- Fissare per 10 min a temperatura ambiente utilizzando 2% (w/v) paraformaldeide (PFA) integrato con 4% (w/v) di saccarosio in PBS e lavare con attenzione 2x utilizzando PBS.
- Incubare con l'anticorpo primario con adeguata concentrazione (Tabella dei materiali) diluito nell'albumina del siero PBS-ovine (BSA) 1% (v/v) per 1 h a temperatura ambiente.
- Rimuovere la soluzione anticorpale e lavare con cura 3x con PBS.
- Incubazione con anticorpo secondario (Tabella dei materiali) diluito in PBS-BSA 1% (v/v) al buio per 45 min a temperatura ambiente.
- Lavare con cura 3x con PBS e montare utilizzando 1o2 gocce di supporto di montaggio acquoso con 4,6-diamidino-2-fenilondoma (DAPI) per visualizzare i nuclei e coprire il pozzo con uno slittamento di copertura rotondo.
- Scatta immagini microscopiche usando un microscopio fluorescente.
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Representative Results
Un diagramma sistematico del metodo per eseguire l'escrescenza glomerare è illustrato nella Figura 1. Figura 2A-D mostra escrescenze glomeriul di glomeruli incapsulati in diversi punti temporali come osservato utilizzando microscopia leggera. Le escrescenze sono mostrate al giorno 2, 4 e 6 ( Figura 2B-D) nellacolturadopo l'isolamento glomerulus dal rene di topo. Al fine di verificare che le cellule in ecrescente siano cellule epiteliali parietali, anche i glomeruli decapsulati sono stati isolati e coltivati per 6 giorni, come mostrato nella Figura 2E, F. Glomeruli incapsulati non ha mostrato alcuna escrescenza cellulare durante il periodo di incubazione entro 6 giorni. Nella Figura 3, la colorazione dell'immunofluorescenza è stata eseguita per diversi marcatori di cellule epiteliali parietali, marcatori specifici di podociti e marcatori di cellule endoteliali. I risultati confermano che le cellule in ecrescente sono effettivamente cellule epiteliali parietali. Figura 4 Mostra la disoccupazione di glomeruli incapsulato isolato da cd44-/vs WT topi dopo 6 giorni in coltura. Glomeruli isolati da topi cd44-/// hanno mostrato una diminuzione del numero di cellule in emiccrescenza e una diminuzione della superficie di crescita glomerare rispetto ai glomeruli isolati dai topi WT, suggerendo un ruolo importante per CD44 nell'attivazione delle cellule epiteliali parietali come pubblicato in precedenza11. Nella Figura 5viene fornito un esempio, in cui la superficie delle cellule epiteliali parietali in crescita viene determinata utilizzando ImageJ.
Figura 1: Panoramica schematica del metodo per eseguire un'escrescenza glomerare per analizzare la proliferazione delle cellule epiteliali parietali. (1) I reni sono sezionati dal topo sacrificato e macinati in piccoli pezzi. (2) Il tessuto renale viene premuto attraverso il setaccio di 300 m e sciacquato attraverso i setacci da 75 e 53 m. (3) I Glomeruli che rimangono in cima ai setacci vengono raccolti utilizzando fcS medio -20% (v/v) e trasferiti su una piastra di fissaggio ultra-bassa. (4) I glomeruli singoli vengono raccolti al microscopio luminoso invertito e vengono trasferiti in piastre di coltura di 24 pozzi. (5) Dopo l'incubazione a 37 gradi centigradi, il 5% (v/v) di CO2 per 6 giorni, l'escrescenza glomerare può essere analizzata utilizzando un microscopio digitale a luce rovesciata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Escrescenza glomerare di glomeruli isolati incapsulati da reni sezionati dai topi WT. La crescita della glomeruli incapsulata incubata a 37 gradi centigradi è mostrata in diversi punti temporali: (A) 0 giorni, (B) 2 giorni, (C) 4 giorni e (D) 6 giorni. I glomeruli incapsulati sono stati anche isolati e coltivati a 37 gradi centigradi e sono state scattate immagini microscopiche al giorno 0 di( E)e (F) giorno 6 che non mostrano cellule in crescita. Barre della scala: (A, E, F) 200 m, (B) 400 m, (C, D) 1000 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Le cellule glomerari in crescita mostrano l'espressione del marcatore delle cellule epiteliali parietali. L'attenuazione dell'immunofluorescenza è stata eseguita al sesto giorno dopo l'isolamento di glomeruli singoli incapsulati per caratterizzare le cellule epiteliali in ecrescente. Le cellule in elemosina hanno macchiato positivo per i marcatori di cellule epiteliali parietali: (A) CD44, (B) SSeCKS e (C) claudin-1, ma non mostravano espressione di (D) il marcatore sinaptopodino specifico del podocito o (E) il marcatore endoteliale specifico CD31, che erano esclusivamente localizzati all'interno dei glomeri. Barre della scala: (A, B, D, E) 100 m, (C) 50 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: L'escrescenza glomerare è compromessa nei glomeruli isolati dai topi da urlo CD44. I glomeruli incapsulati sono stati isolati dai reni sezionati di topi WT(A)e topi(B) cd44-/-. Le immagini microscopiche sono state scattate dopo 6 giorni di vita con un microscopio digitale a luce rovesciata. Il numero di cellule epiteliali parietali in crescita e la superficie di escrescenza sono state aumentate nei glomeruli dei topi WT rispetto ai topi cd44-/- suggerendo un ruolo importante per il CD44 nell'attivazione delle cellule epiteliali parietali. Barre della scala: 1000 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Un esempio dell'analisi della superficie dell'escrescenza glomerare come marcatore per la proliferazione delle cellule epiteliali parietali utilizzando ImageJ (FIJI). (A) Disoccupazione glomerare di un glomerulus incapsulato di un topo WT dopo 6 giorni di cultura a 37 gradi centigradi. (B) In primo luogo, la scala è determinata per analizzare l'area della superficie in mm2. Qui: 1 mm - 460 pixel. (C) Dopo aver impostato la scala, viene tracciata una linea di selezione intorno all'area di escrescenza glomerare. (D) L'area selezionata può quindi essere misurata (superficie in questo esempio : 2,235 mm2). Barre della scala: 1000 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Utilizzando il protocollo descritto in questo articolo, è possibile utilizzare glomeruli singoli incapsulati per valutare la proliferazione delle cellule epiteliali parietali che è una conseguenza dell'attivazione delle cellule epiteliali parietali. Questo modello ex vivo ci permetterà di studiare in dettaglio i percorsi molecolari, che sono coinvolti nell'attivazione delle cellule epiteliali parietali. Il metodo descritto si basa sul semplice concetto di dissezione renale e setacciatura per isolare e coltura incapsulato glomeruli e per confrontare la proliferazione e/o la migrazione di cellule epiteliali parietali in diverse condizioni sperimentali. I risultati che possono essere analizzati dopo 6 giorni di coltura sono, ad esempio, la superficie o il diametro della crescita o il numero di cellule in ecrescente di un singolo glomerulus capsulato. Un'altra applicazione per questo saggio potrebbe essere quello di studiare gli effetti dei farmaci che inducono o inibiscono percorsi molecolari che possono essere coinvolti nell'attivazione delle cellule epiteliali parietali.
La colorazione dell'immunofluorescenza ha confermato che le cellule in ecrescente dopo 6 giorni di coltura sono cellule epiteliali parietali in quanto macchiate positiva per i marcatori di cellule epiteliali parietali (CD44, claudine-1, SSeCKS) ma non hanno espresso il marcatore sinaptopodina specifico del podocito, né il marcatore della cellula endoteliale CD31. In linea con i risultati della colorazione, non è stato possibile osservare cellule in evaso 6 giorni dopo l'isolamento e la coltura di singoli glomeruli incapsulati, il che indica che vi è una contaminazione limitata di altre cellule glomeriari nella escrescenza cellulare entro questo periodo di 6 giorni. Un altro studio ha anche analizzato la crescita glomerare e ha mostrato che le cellule che proliferano rapidamente derivate dall'escrescenza glomerare sono infatti discendenti dalle cellule epiteliali parietali14.
Il protocollo di colorazione utilizzato per analizzare l'espressione del marcatore delle cellule in ecrescente può anche essere adattato per testare altre molecole di interesse. L'immunostaining è stata eseguita all'interno dei pozzi delle piastre in cui i glomeruli sono stati incubati per 6 giorni. Questi pozzi non erano rivestiti, ma glomeruli attaccati ai pozzi durante la prima incubazione di 2x3 h. L'incubazione su inserti in vetro o un sistema di scorrimento a camera che avrebbe comportato una migliore imaging non era possibile in quanto i glomeruli non si attaccavano completamente alla superficie e l'escrescenza glomerare era compromessa. Questo protocollo specifico è stato istituito di recente per studiare l'escrescenza della cellula epiteliale parietale da glomeruli di WT sani e topi cd44-/- 11. Utilizzando questo metodo, è stato dimostrato che le cellule epiteliali parietali carenti di CD44 mostrano una diminuzione del tasso di proliferazione, come illustrato anche nella Figura 4. Questo metodo può essere utilizzato anche per topi di altri ceppi e anche per altri topi geneticamente alterati. In uno studio precedente, per esempio, è stato utilizzato un approccio comparabile per analizzare gli effetti della segnalazione del recettore glucocorticoide15.
L'uso di questa tecnica per isolare i glomeruli dai topi e analizzare le escrescenze cellulari ha molti vantaggi verso l'uso di linee cellulari epiteliali immortalate per l'analisi delle vie coinvolte nell'attivazione delle cellule epiteliali parietali o nei farmaci che potrebbero influenzare il processo di proliferazione delle cellule epiteliali. In primo luogo, in questo metodo, vengono utilizzate cellule primarie che crescono direttamente dal glomerulus e sono solo 6 giorni in coltura. Pertanto, le cellule epiteliali parietali da escrescenze glomeriule hanno subito meno cambiamenti nel fenotipo rispetto alle linee cellulari immortalate, che necessitano di ulteriori passaggi di crescita per creare la linea cellulare16. Inoltre, il metodo qui descritto può essere utilizzato per confrontare l'effetto di un knockout genico specifico sulla proliferazione cellulare parietale anche per percorsi difficili da eliminare nelle linee cellulari a causa della compromissione della crescita cellulare o dell'efficienza dell'eliminazione genica utilizzando metodi di silenziamento.
Per adattare il protocollo ad altri modelli animali o ai tessuti renali umani, la dimensione dei setacci dovrebbe essere ottimizzata per ottenere il miglior risultato. Questo perché la dimensione glomerare differisce tra le specie e quindi la dimensione dei setacci su cui è possibile raccogliere i glomeruli varia. Inoltre, è importante isolare glomeruli intatto incapsulato ai fini di questo metodo. Pertanto, i glomeruli non devono essere premuti ma delicatamente sciacquati attraverso i setacci più piccoli.
Un altro passaggio critico del protocollo è la raccolta dei glomeruli incapsulati dopo la setacciazione. Qui, è importante utilizzare medio con 20% FCS per evitare l'attaccamento di glomeruli tra loro. Inoltre, la soluzione arricchita con glomeruli dovrebbe essere trasferita direttamente in piastre di adesione ultra-basse perché, altrimenti, i glomeruli si attaccheranno direttamente alla superficie delle normali piastre di coltura cellulare e persino alla superficie dei tubi di plastica che rende difficile catturare e isolare i glomeruli singoli.
Dopo la raccolta di glomeruli singoli incapsulati, questi dovrebbero essere coltivati 3 h in un piccolo volume di mezzo di coltura al centro del pozzo per consentire l'aderenza. Galleggiante del glomeruli verso il bordo dei pozzi dovrebbe essere evitato per ottimizzare la lettura durante l'analisi dell'immagine.
Per ottenere i migliori risultati utilizzando il protocollo qui descritto, si consiglia di coltura singola glomeruli ed eseguire la lettura al giorno 6. In questo momento, può essere osservata una escrescenza cellulare omogenea costituita da cellule epiteliali parietali. In momenti successivi, la crescita glomerare diventa fenotipica che indica la crescita di altri tipi di cellule. Pertanto, il protocollo non sembra essere adatto per tempi di incubazione molto lunghi. Si dovrebbe tenere a mente che i tempi di incubazione per l'escrescenza delle cellule epiteliali parietali possono variare tra le specie o tra diversi ceppi murini. Pertanto, i tempi di coltura devono essere testati e ottimizzati per ogni ceppo o specie di topo. Inoltre, l'origine dell'escrescenza glomerare deve sempre essere convalidata colorando i marcatori parieliali specifici delle cellule.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata sostenuta dalla fondazione rene olandese (sovvenzione 14A3D104) e dall'Organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO VIDI grant: 016.156.363).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well cell culture plate | Corning Costar | ||
| anti-CD31 | BD Pharmingen | Endothelial cell marker (used concentration 1:200) | |
| chicken-anti-rat Alexa 647 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) | |
| DAPI-Fluoromount G | Southern Biotech | Mounting medium containing DAPI | |
| Digital inverted light microscope | Westburg, EVOS fl microscope | ||
| donkey-anti-goat Alexa 568 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) | |
| donkey-anti-rabbit Alexa 568 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium | Lonza | ||
| EBM Medium | Lonza | ||
| EBM-MV Single Quots kit | Lonza | containing hydrocortisone, hEGF, GA-1000, FBS and BBE | |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | ||
| Fetal Calf Serum | Lonza | ||
| Fluorescent microscope | Leica Microsystems GmbH | ||
| goat-anti-synaptopodin | Santa Cruz | Podocyte marker (used concentration 1:200) | |
| Hanks'Balanced Salt Solution | Gibco | ||
| ImageJ software | FIJI 1.51n | ||
| petri dish | Sarstedt | size 100 | |
| rabbit-anti-claudin1 | Abcam | Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:100) | |
| rabbit-anti-SSeCKS | Roswell Park Comprehensive Cancer Center,Buffalo, NY, USA | kindly provided by Dr. E. Gelman, Parietal epithelial cell marker | |
| rat-anti-CD44 | BD Pharmingen | Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:200) | |
| scalpel | Dahlhausen | size 10 | |
| Sieves | Endecotts Ltd | size 300 µm, 75 µm, 53 µm, steel | |
| syringe | BD Plastipak | size: 20 ml | |
| Ultra-Low Attachment Microplates | Corning Costar | 6-well plates |
References
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