Summary
Este artículo describe un método para cultivar y analizar los crecimientos de células epiteliales parietales glollares de glomérulos encapsulados aislados del riñón de ratón. Este método se puede utilizar para estudiar las vías implicadas en la proliferación y migración de células epiteliales parietales.
Abstract
La activación de la célula epitelial parietal (PEC) es uno de los factores clave involucrados en el desarrollo y progresión de la glomerulosclerosis. Por lo tanto, la inhibición de las vías implicadas en la activación de células epiteliales parietales podría ser una herramienta para atenuar la progresión de las enfermedades glomerulares. Este artículo describe un método para cultivar y analizar el crecimiento de células epiteliales parietales de glomérulos encapsulados aislados del riñón de ratón. Después de diseccionar los riñones aislados de ratón, el tejido se pica, y los glomérulos se aíslan por tamizado. Se recogen glomérulos encapsulados, y se cultivan 6 días para obtener el crecimiento glomerular de células epiteliales parietales. Durante este período, la proliferación y migración de células epiteliales parietales se puede analizar determinando el número de célula o el área de superficie de las células que crecen. Por lo tanto, este ensayo puede utilizarse como herramienta para estudiar los efectos de una expresión génica alterada en ratones transgénicos o noqueadores o los efectos de las condiciones de cultivo en las características de crecimiento y señalización de células epiteliales parietales. Utilizando este método, se pueden estudiar vías importantes implicadas en el proceso de activación celular epitelial parietal y, en consecuencia, en la glomerulosclerosis.
Introduction
Las enfermedades glomerulares son un grupo importante de trastornos renales y representan una de las principales causas de la enfermedad renal terminal(ESRD). Desafortunadamente, las opciones de tratamiento específicas son limitadas y la progresión a la ESRD es inevitable. Las enfermedades glomerulares se definen por la presencia de lesiones glomerulares y pueden agruparse en enfermedades inflamatorias y no inflamatorias. Aunque el insulto inicial es diferente, estudios recientes han demostrado que un mecanismo celular común conduce a la hiperplasia celular epitelial glomerular y, en última instancia, a la glomerulosclerosis en todas las enfermedades glomerulares, independientemente de la causa subyacente1,,2,,3,4.
Específicamente, se demostró que las lesiones glomeruloscleróticas se componen principalmente de células epiteliales parietales activadas5,6. En condiciones fisiológicas, las células epiteliales parietales son células epiteliales en reposo planas que recubren la cápsula del Bowman del glomerulo. Sin embargo, cualquier lesión glomerular ya sea debido a mutaciones genéticas (por ejemplo, citopatías de podocitos específicos o mitocondriales), inflamación o hiperfiltración (por ejemplo, causada por la reducción de la masa renal, hipertensión, obesidad o mellitus diabético) puede desencadenar la activación de células epiteliales parietales. Las células epiteliales parietales activadas proliferan y depositan matriz extracelular que resulta en la formación de media lunas celulares o lesiones escleróticas5,7,8. La progresión de estos procesos da lugar a la pérdida de la función renal9. Por lo tanto, la activación celular epitelial parietal es un factor clave en el desarrollo y progresión de la glomerulosclerosis tanto en enfermedades glomerulares inflamatorias como no inflamatorias1,,2,,3,,4,,10.
Los procesos moleculares que median la activación de células epiteliales parietales son aún desconocidos en gran medida. Estudios recientes muestran que las células epiteliales parietales activadas de novo express CD44, un receptor que es importante para la activación de diferentes vías implicadas en la proliferación celular y la migración. Además, se demostró que la inhibición de CD44 inhibe la activación de células epiteliales parietales y atenúa la progresión de la formación de media luna y la glomerulosclerosis en modelos animales de enfermedades glomerulares inflamatorias y no inflamatorias11,12.
Como la activación de células epiteliales parietales es un actor clave para el desarrollo de la glomerulosclerosis y la formación de media luna, la inhibición de estas células podría ralentizar la progresión de las enfermedades glomerulares. La elucidación de las vías moleculares que impulsan la activación celular epitelial parietal puede conducir al desarrollo de intervenciones terapéuticas específicas que atenúen la formación de lesiones hiperplásicas y glomeruloscleróticas en la enfermedad glomerular.
En modelos animales experimentales, con frecuencia es difícil proporcionar evidencia para un efecto directo de una expresión génica alterada (modelos de eliminación o modelos de ratón transgénicos) o tratamiento farmacológico en las células epiteliales parietales. En un ratón noqueado convencional, los cambios in vivo observados podrían explicarse por cambios directos en las células epiteliales parietales. Sin embargo, dado que la expresión génica también se altera en otros tipos de células dentro del ratón, no se pueden excluir los efectos indirectos mediados por otros tipos de células. El desarrollo de ratones cre-lox condicionales impulsados por promotores principalmente activos en células epiteliales parietales ha proporcionado una solución en algunos casos13. Sin embargo, los modelos transgénicos condicionales son complejos y aunque hay más líneas condicionales disponibles, para muchas de las líneas convencionales de ratón noqueado o transgénico aún no hay un sustituto condicional.
Para estudiar los efectos directos sobre las células epiteliales parietales, nuestro grupo ha desarrollado un ensayo ex vivo utilizando glomérulos encapsulados aislados de los riñones de ratón para medir y analizar la proliferación y migración de células epiteliales parietales. Este método nos permitirá determinar los efectos específicos de las células epiteliales parietales y encontrar vías responsables para la activación de células epiteliales parietales y probar opciones de tratamiento para inhibir esta activación.
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Protocol
Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices del Comité de Etica Animal de la Universidad Radboud Nijmegen.
NOTA: Los ratones no tratados de tipo salvaje sano (WT) (n.o 4) y los ratones cd44-/- (n x 4) fueron sacrificados a la edad de 12 a 16 semanas. Se utilizaron ratones machos y hembras. Todos los ratones estaban en el fondo C57Bl/6.
1. Disección renal de ratón
- Sacrificar ratones WT sanos o ratones genéticamente alterados por luxación cervical.
- Diseccione los riñones enteros del ratón directamente después de sacrificar los ratones. Para ello, realizar una laparotomía mediana usando tijeras abdominales, cortando la piel y luego los músculos abdominales. Retire el intestino y colóquelo junto al ratón.
- Libera los riñones del tejido de conexión y extrae el riñón usando fórceps quirúrgicos, cortando la arteria renal, la vena renal y el uréter con tijeras.
- Retire las cápsulas renales de los riñones sosteniendo el riñón con fórceps quirúrgicos y tire de la cápsula usando otro par de fórceps.
- Coloque los riñones en una placa de cultivo celular de 6 pozos (2 riñones/pozo) preparada con 2 ml de solución de sal equilibrada de Hanks (HBSS) por pozo y colóquela en hielo.
2. Aislamiento de glomérulos por riñón de ratón
- Transfiera los riñones a una placa Petri de 100 mm y pica los riñones en trozos pequeños de 1 x 2 mm usando dos bisturíes. Mantenga las piezas renales picadas húmedas usando 1 x 2 ml de HBSS.
- Coloque las piezas renales picadas en la parte superior de un tamiz metálico de 300 m y presione el riñón a través del tamiz con un émbolo de una jeringa de 20 ml. Enjuague repetidamente el tamiz con HBSS en el medio y recoja el flujo a través en un plato limpio de Petri usando un pipeteo serológico. Recoger también todo lo que queda / se pega a la parte inferior del tamiz raspándolo con el bisturí y transferirlo al flujo recogido a través (homogeneizar riñón).
- Enjuagar el color de los riñones a través de un tamiz de 75 m con HBSS. Recoger el flujo a través y posteriormente enjuagar este flujo a través de un tamiz de 53 m. Lave ambos tamices con HBSS para eliminar todas las estructuras más pequeñas.
NOTA: En este paso, el flujo-aunque sólo se enjuaga pero no se presiona a través del tamiz de 75 y 53 m. El lavado con HBSS es necesario para eliminar los desechos y las estructuras más pequeñas en los tamices. Por lo tanto, normalmente se utilizan 200 a 300 ml de HBSS en total. - Recoger las estructuras/materiales renales que permanecen en el tamiz de 75 y 53 m lavando la superficie superior de los tamices con el medio de Aguirute modificado de Dulbecco (DMEM) complementado con un 20% de suero de ternero fetal (FCS) y transferir el material a una microplaca de unión ultrabajo de 6 pocillos.
NOTA: Para lavar la superficie superior del tamiz, enjuague el tamiz en una posición inclinada (>45o) y recoja el material renal en el borde del tamiz. El material recogido se enriquece para glomérulos encapsulados y decapsulados, mostrando sólo unos pocos fragmentos tubulares. Los glomérulos encapsulados son muy pegajosos. Por lo tanto, para recoger glomérulos individuales, es importante evitar que los glomérulos se adhieran a la superficie de un plato o plato de pozo De Petri. Para evitar la adherencia, utilice el medio con 20% FCS y utilice placas de fijación ultrabajos para este paso.
3. Cultivo del crecimiento glomerular
- Lleve la microplaca de fijación ultrabajo a un microscopio de luz invertido y recoja glomérulos encapsulados y/o decapsulados con una pipeta de 20 l. Evite pipetear otras estructuras y escombros. Después de recoger un solo glomerulo en la punta de la pipeta, agregue un medio DMEM fresco sin material renal recogido en la misma punta de pipeta a un volumen de 20 l.
- Transfiera el glomerulo único con el medio DMEM de 20 l al centro de un pocero de una placa de cultivo celular de 24 pocillos e incubar durante 3 h a 37 oC y 5% (v/v) CO2 para permitir la fijación del glomerero al centro del pozo. Mueva cuidadosamente la placa para evitar flotar del glomérulo a los embarques del pozo.
- Después de 3 h de incubación, el glomérulo se une al centro del pozo. Agregue cuidadosamente 500 l de medio basal endotelial (EBM) complementado con un kit de factor de crecimiento que contenga hidrocortisona, factor de crecimiento endotelial humano, extracto cerebral bovino y gentamicina sulfato-anfotericina B(Tabla de Materiales)y 5% (v/v) adicional FBS y 1% (v/v) penicilina/estreptocecina (pluma/estreptocipto) a cada pozo.
- Cultivar los glomérulos individuales durante 6 días a 37oC, 5% (v/v) CO2.
NOTA: Dentro de 6 días se forma el crecimiento que consiste en células epiteliales parietales. Si uno tiene como objetivo probar los efectos de compuestos específicos o fármacos en las células epiteliales parietales se debe añadir al medio dentro de este período de seis días.
4. Análisis de la proliferación de células epiteliales parietales
- Analice el crecimiento glomerular después de 6 días. Tome imágenes microscópicas con un microscopio de luz digital invertido.
- Utilice un software de análisis de imágenes (por ejemplo, ImageJ/FIJI) para determinar el área de superficie y el diámetro del crecimiento glomerular, y el número de células que crecen o glomérulos.
- Para determinar el área de superficie del crecimiento glomerular, abra el tif. archivo del crecimiento glomerular con la barra de escala en ImageJ. Dibuje una línea recta en la barra de escala y determine la distancia en píxeles haciendo clic en analizar y medir (por ejemplo, 1 mm a 460 píxeles).
- Determine la escala haciendo clic en analizar,establecer escala y escribir la distancia conocida en píxeles (por ejemplo, 460), también escriba la distancia conocida (por ejemplo, 1) y la unidad de longitud (por ejemplo, 1 mm). Haga clic en Aceptar.
- Determine qué resultados se mostrarán en la tabla de resultados haciendo clic en analizar y, a continuación, establecer las mediciones. Para determinar el área de superficie del crecimiento glomerular, active el área de opciones y la etiqueta de visualización. Haga clic en Aceptar.
- Para determinar el área de superficie del crecimiento glomerular, dibuje una selección a mano alzada alrededor del crecimiento glomerular. Haga clic en analizar y luego medir, aparecerá una tabla de resultados en ImageJ que muestra el área de superficie del crecimiento en la escala determinada anteriormente (consulte el paso 4.4, por ejemplo, mm2).
5. Caracterización del crecimiento celular glomerular
NOTA: Para evaluar la composición celular del crecimiento, la tinción de inmunofluorescencia para marcadores específicos de la célula se realiza en los crecimientos glomerulares en t a 6 días.
- Retire cuidadosamente el medio y lave suavemente los glomérulos dos veces con solución salina tamponada por fosfato (PBS).
- Fijar durante 10 min a temperatura ambiente usando 2% (p/v) paraformaldehído (PFA) complementado con sacarosa del 4% (p/v) en PBS y lavar cuidadosamente 2x usando PBS.
- Incubar con el anticuerpo primario con la concentración adecuada(Tabla de materiales)diluido en albúmina sérica PBS-ovina (BSA) 1% (v/v) durante 1 h a temperatura ambiente.
- Retire la solución de anticuerpos y lave cuidadosamente 3x con PBS.
- Incubar con anticuerpos secundarios (Tabla de Materiales) diluidos en PBS-BSA 1% (v/v) en la oscuridad durante 45 min a temperatura ambiente.
- Lave cuidadosamente 3x con PBS y monte usando 1 x 2 gotas de medio de montaje acuoso con 4o,6-diamidino-2-fenilindondole (DAPI) para visualizar los núcleos y cubrir el pozo con un resbalón redondo de la cubierta.
- Tome imágenes microscópicas con un microscopio fluorescente.
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Representative Results
En la Figura 1se muestra un diagrama sistemático del método para realizar el ensayo de crecimiento glomerular. La Figura 2A-D muestra los crecimientos glomerulares de glomérulos encapsulados en diferentes puntos de tiempo como se observa mediante microscopía de luz. Los crecimientos se muestran en los días 2, 4 y 6(Figura 2B-D) en el cultivo después del aislamiento del glomerulo del riñón del ratón. Para validar que las células que crecen son células epiteliales parietales, los glomérulos decapsulados también se han aislado y cultivado durante 6 días como se muestra en la Figura 2E,F. Los glomérulos decapsulados no mostraron crecimiento celular durante el período de incubación en un plazo de 6 días. En la Figura 3,se realizó la tinción de inmunofluorescencia para diferentes marcadores de células epiteliales parietales, marcadores específicos de podocitos, así como marcadores de células endoteliales. Los resultados validan que las células que crecen son de hecho células epiteliales parietales. La Figura 4 muestra el crecimiento de glomérulos encapsulados aislados de ratones cd44-/- vs WT después de 6 días en cultivo. Los glomérulos aislados de los ratones cd44-/- mostraron una disminución del número de células que se asomeban, así como una disminución de la superficie del crecimiento glomerular en comparación con los glomérulos aislados de ratones WT, lo que sugiere un papel importante para cd44 en la activación de células epiteliales parietales como se publicó anteriormente11. En la Figura 5, se muestra un ejemplo, en el que el área de superficie de las células epiteliales parietales que crecen se determina mediante ImageJ.
Figura 1: Visión general esquemática del método para realizar un ensayo de crecimiento glomerular para analizar la proliferación de células epiteliales parietales. (1) Los riñones se diseccionan del ratón sacrificado y se pican en trozos pequeños. (2) El tejido renal se presiona a través del tamiz de 300 m y se enjuaga a través de los tamices de 75 y 53 m. (3) Los glomérulos que permanecen en la parte superior de los tamices se recogen utilizando FCS medio + 20% (v/v) y se transfieren a una placa de fijación ultrabajo. (4) Los glomérulos individuales se recogen con un microscopio de luz invertido y se transfieren a placas de cultivo de 24 pozos. (5) Después de la incubación a 37 oC, 5 % (v/v)CO2 durante 6 días, el crecimiento glomerular puede analizarse utilizando un microscopio de luz digital invertida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Crecimiento glomerular de glomérulos encapsulados aislados de riñones diseccionados de ratones WT. El crecimiento de los glomérulos encapsulados incubados a 37 oC se muestra en diferentes puntos de tiempo: (A) 0 días, (B) 2 días, (C) 4 días y (D) 6 días. Los glomérulos decapsulados también fueron aislados y cultivados a 37 oC y se tomaron imágenes microscópicas al día(E)0 y (F) día 6 que no muestran células que crecen. Barras de escala: (A,E,F) 200 m, (B) 400 m, (C,D) 1000 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Las células glomerulares que crecen muestran la expresión del marcador de células epiteliales parietales. La tinción por inmunofluorescencia se realizó en el día 6 después del aislamiento de glomérulos encapsulados individuales para caracterizar las células epiteliales que crecen. Las células de crecimiento se mostraron positivas para los marcadores celulares epiteliales parietales: (A) CD44, (B) SSeCKS y (C) claudin-1, pero no mostraron expresión de (D) el marcador específico de podocitos sinaptopodin o (E) el marcador específico de celda endotelial CD31, que se localizaron exclusivamente dentro del glomerul. Barras de escala: (A,B,D,E) 100 ám, (C) 50 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: El crecimiento glomerular se ve afectado en los glomérulos aislados de ratones noqueados CD44. Los glomérulos encapsulados se aislaron de los riñones diseccionados de ratones (A) WT y (B) cd44-/- ratones. Se tomaron imágenes microscópicas después de 6 días en cultivo utilizando un microscopio de luz digital invertido. El número de células epiteliales parietales que se superan, así como la superficie del crecimiento, se incrementó en los glomérulos de ratones WT en comparación con los ratones cd44/-, lo que sugiere un papel importante para CD44 en la activación de células epiteliales parietales. Barras de escala: 1000 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Un ejemplo del análisis de la superficie del crecimiento glomerular como marcador para la proliferación de células epiteliales parietales utilizando ImageJ (FIJI). (A) Crecimiento glomerular de un glomérulo encapsulado de un ratón WT después de 6 días en cultivo a 37 oC. (B) En primer lugar, la escala se determina para analizar la superficie en mm2. Aquí: 1 mm a 460 píxeles. (C) Después de establecer la escala, se dibuja una línea de selección alrededor del área de crecimiento glomerular. (D) A continuación, se puede medir esta área seleccionada (área de superficie en este ejemplo de 2.235 mm2). Barras de escala: 1000 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Usando el protocolo descrito en este artículo, se puede utilizar glomérulos encapsulados individuales para evaluar la proliferación de células epiteliales parietales que es una consecuencia de la activación de células epiteliales parietales. Este modelo ex vivo nos permitirá estudiar en detalle las vías moleculares, que intervienen en la activación de células epiteliales parietales. El método descrito se basa en el concepto simple de disección renal y tamizado para aislar y cultivar glomérulos encapsulados y comparar la proliferación y/o migración de células epiteliales parietales en diferentes condiciones experimentales. Los resultados que se pueden analizar después de 6 días en cultivo son, por ejemplo, el área de superficie o el diámetro del crecimiento o el número de células que crecen de un único glomerulo capsulado. Otra aplicación para este ensayo podría ser estudiar los efectos de los fármacos que inducen o inhiben las vías moleculares que pueden estar implicadas en la activación de células epiteliales parietales.
La tinción por inmunofluorescencia confirmó que las células que crecen después de 6 días en el cultivo son células epiteliales parietales, ya que se tiñen positivas para los marcadores de células epiteliales parietales (CD44, claudin-1, SSeCKS) pero no expresaron la sinaptopodina marcador específica del podocito, ni el marcador de células endoteliales CD31. En línea con los resultados de la tinción, no se pudo observar ninguna célula de crecimiento 6 días después del aislamiento y el cultivo de glomérulos decapsulados individuales, lo que indica que hay contaminación limitada de otras células glomerulares en el crecimiento celular dentro de este período de 6 días. Otro estudio también analizó el crecimiento glomerular y demostró que las células proliferantes rápidas derivadas del crecimiento glomerular son de hecho descendientes de las células epiteliales parietales14.
El protocolo de tinción que se utilizó para analizar la expresión del marcador de las células que crecen también se puede adaptar para probar otras moléculas de interés. La inmunostaining se realizó dentro de los pozos de las placas en las que los glomérulos fueron incubados durante 6 días. Estos pozos no estaban recubiertos, sino glomérulos unidos a los pozos durante la primera incubación de 2 a 3 h. La incubación en plaquitas de vidrio o un sistema de deslizamiento de cámara que resultaría en mejores imágenes no era posible, ya que los glomérulos no se unieron completamente a la superficie y el crecimiento glomerular se deterioró. Este protocolo específico se creó recientemente para estudiar el crecimiento de la célula epitelia parietal a partir de glomérulos de WT sano y cd44-/- ratones11. Usando este método, se demostró que las células epiteliales parietales deficientes de CD44 muestran una disminución de la tasa de proliferación, que también se demuestra en la Figura 4. Este método también se puede utilizar para ratones de otras cepas y también para otros ratones genéticamente alterados. En un estudio anterior, por ejemplo, se utilizó un enfoque comparable para analizar los efectos de la señalización del receptor de glucocorticoides15.
El uso de esta técnica para aislar glomérulos de ratones y analizar los crecimientos celulares tiene muchas ventajas hacia el uso de líneas celulares epiteliales parietales inmortalizadas para el análisis de vías implicadas en la activación celular epitelial parietal o fármacos que podrían influir en el proceso de proliferación de células epiteliales. En primer lugar, en este método, se utilizan células primarias que crecen directamente fuera del glomérulo y son sólo 6 días en el cultivo. Por lo tanto, las células epiteliales parietales de los crecimientos gloméricos sufrieron menos cambios en el fenotipo en comparación con las líneas celulares inmortalizadas, que necesitan pasajes de crecimiento adicionales para crear la línea celular16. Además, el método descrito aquí se puede utilizar para comparar el efecto de la eliminación genética específica en la proliferación de células parietales también para las vías que son difíciles de eliminar en las líneas celulares debido a la disminución del crecimiento celular o la eficiencia de la eliminación de genes utilizando métodos silenciadores.
Para adaptar el protocolo a otros modelos animales o al tejido renal humano, el tamaño de los tamices debe optimizarse para obtener el mejor resultado. Esto se debe a que el tamaño glomerular difiere entre las especies y, por lo tanto, el tamaño de los tamices en los que se pueden recoger los glomérulos varía. Además, es importante aislar glomérulos encapsulados intactos para el propósito de este método. Por lo tanto, los glomérulos no deben ser prensados, sino suavemente enjuagados a través de los tamices más pequeños.
Otro paso crítico en el protocolo es la recolección de los glomérulos encapsulados después del tamizado. Aquí, es importante utilizar medio con 20% FCS para evitar la fijación de glomérulos entre sí. Además, la solución enriquecida con glomérulos debe transferirse directamente a placas de adhesión ultrabajos porque, de lo contrario, los glomérulos se unen directamente a la superficie de las placas de cultivo celular regulares e incluso a la superficie de los tubos de plástico, lo que dificulta la captura y el aislamiento de glomérulos individuales.
Después de la recolección de glomérulos encapsulados individuales, estos deben ser cultivados 3 h en un pequeño volumen de medio de cultivo en el centro del pozo para permitir la adherencia. Se debe evitar la flotación de los glomérulos hacia el embarque de los pozos para optimizar la lectura durante el análisis de la imagen.
Para obtener los mejores resultados utilizando el protocolo descrito aquí, recomendamos cultivar glomérulos individuales y realizar la lectura en el día 6. En este momento, se puede observar un crecimiento celular homogéneo que consiste en células epiteliales parietales. En puntos posteriores, el crecimiento glomerular se vuelve fenotípicamente heterogéneo que indica el crecimiento de otros tipos de células. Por lo tanto, el protocolo no parece ser adecuado para tiempos de incubación muy largos. Hay que tener en cuenta que los tiempos de incubación para el crecimiento de células epiteliales parietales podrían variar entre especies o entre diferentes cepas de ratón. Por lo tanto, los tiempos de cultivo deben ser probados y optimizados para cada cepa o especie de ratón. Además, el origen del crecimiento glomerular siempre debe validarse mediante manchas para marcadores específicos de células epiteliales parietales.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por la Fundación Riñón Holandesa (concesión 14A3D104) y la Organización Neerlandesa para la Investigación Científica (subvención NWO VIDI: 016.156.363).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well cell culture plate | Corning Costar | ||
| anti-CD31 | BD Pharmingen | Endothelial cell marker (used concentration 1:200) | |
| chicken-anti-rat Alexa 647 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) | |
| DAPI-Fluoromount G | Southern Biotech | Mounting medium containing DAPI | |
| Digital inverted light microscope | Westburg, EVOS fl microscope | ||
| donkey-anti-goat Alexa 568 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) | |
| donkey-anti-rabbit Alexa 568 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium | Lonza | ||
| EBM Medium | Lonza | ||
| EBM-MV Single Quots kit | Lonza | containing hydrocortisone, hEGF, GA-1000, FBS and BBE | |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | ||
| Fetal Calf Serum | Lonza | ||
| Fluorescent microscope | Leica Microsystems GmbH | ||
| goat-anti-synaptopodin | Santa Cruz | Podocyte marker (used concentration 1:200) | |
| Hanks'Balanced Salt Solution | Gibco | ||
| ImageJ software | FIJI 1.51n | ||
| petri dish | Sarstedt | size 100 | |
| rabbit-anti-claudin1 | Abcam | Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:100) | |
| rabbit-anti-SSeCKS | Roswell Park Comprehensive Cancer Center,Buffalo, NY, USA | kindly provided by Dr. E. Gelman, Parietal epithelial cell marker | |
| rat-anti-CD44 | BD Pharmingen | Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:200) | |
| scalpel | Dahlhausen | size 10 | |
| Sieves | Endecotts Ltd | size 300 µm, 75 µm, 53 µm, steel | |
| syringe | BD Plastipak | size: 20 ml | |
| Ultra-Low Attachment Microplates | Corning Costar | 6-well plates |
References
- Fatima, H., et al. Parietal epithelial cell activation marker in early recurrence of FSGS in the transplant. Clinical journal of the American Society of Nephrology: CJASN. 7 (11), 1852-1858 (2012).
- Dijkman, H. B., et al. Proliferating cells in HIV and pamidronate-associated collapsing focal segmental glomerulosclerosis are parietal epithelial cells. Kidney International. 70 (2), 338-344 (2006).
- Kuppe, C., et al. Common histological patterns in glomerular epithelial cells in secondary focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 88 (5), 990-998 (2015).
- Dijkman, H., Smeets, B., van der Laak, J., Steenbergen, E., Wetzels, J. The parietal epithelial cell is crucially involved in human idiopathic focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 68 (4), 1562-1572 (2005).
- Smeets, B., et al. Parietal epithelial cells participate in the formation of sclerotic lesions in focal segmental glomerulosclerosis. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 22 (7), 1262-1274 (2011).
- Smeets, B., et al. Tracing the origin of glomerular extracapillary lesions from parietal epithelial cells. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (12), 2604-2615 (2009).
- Smeets, B., Moeller, M. J. Parietal epithelial cells and podocytes in glomerular diseases. Seminars in Nephrology. 32 (4), 357-367 (2012).
- Ryu, M., et al. Plasma leakage through glomerular basement membrane ruptures triggers the proliferation of parietal epithelial cells and crescent formation in non-inflammatory glomerular injury. The Journal of Pathology. 228 (4), 482-494 (2012).
- Eymael, J., Smeets, B. Origin and fate of the regenerating cells of the kidney. European Journal of Pharmacology. 790, 62-73 (2016).
- Smeets, B., et al. Renal progenitor cells contribute to hyperplastic lesions of podocytopathies and crescentic glomerulonephritis. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (12), 2593-2603 (2009).
- Eymael, J., et al. CD44 is required for the pathogenesis of experimental crescentic glomerulonephritis and collapsing focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 93 (3), 626-642 (2018).
- Roeder, S. S., et al. Activated ERK1/2 increases CD44 in glomerular parietal epithelial cells leading to matrix expansion. Kidney International. 91 (4), 896-913 (2017).
- Appel, D., et al. Recruitment of podocytes from glomerular parietal epithelial cells. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (2), 333-343 (2009).
- Yaoita, E., et al. Visceral epithelial cells in rat glomerular cell culture. European Journal of Cell Biology. 67 (2), 136-144 (1995).
- Kuppe, C., et al.
- Ohse, T., et al. Establishment of conditionally immortalized mouse glomerular parietal epithelial cells in culture. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 19 (10), 1879-1890 (2008).
