Summary
Denna artikel beskriver en metod för odling och analysera glomerular parietal epitelial cell utväxter av inkapslade glomeruli isolerade från musen njure. Denna metod kan användas för att studera vägar som är involverade i parietal epitelial cell spridning och migration.
Abstract
Parietal epitelial cell (PEC) aktivering är en av de viktigaste faktorerna som deltar i utvecklingen och utvecklingen av glomerulosclerosis. Hämning av vägar som deltar i parietal epitelial cell aktivering kan därför vara ett verktyg för att dämpa utvecklingen av glomerular sjukdomar. Denna artikel beskriver en metod för att odla och analysera parietala epitelial cell utväxt av inkapslade glomeruli isolerade från musen njure. Efter dissekering isolerade mus njurar, vävnaden mals, och glomeruli isoleras genom siktning. Inkapslade glomeruli samlas in, och enda glomeruli odlas i 6 dagar för att få glomerular utväxt av parietal epitelceller. Under denna period kan parietal epitelial cell spridning och migration analyseras genom att bestämma cellnummer eller yta av utväxta celler. Denna analys kan därför användas som ett verktyg för att studera effekterna av ett förändrat genuttryck hos transgena- eller knockout-möss eller effekterna av odlingsförhållanden på parietala epitelaliska tillväxtegenskaper och signalering. Med denna metod kan viktiga vägar som är involverade i processen för parietal epitelial cell aktivering och därmed i glomeruloskleros studeras.
Introduction
Glomerular sjukdomar är en viktig grupp av njursjukdomar och utgör en viktig orsak till slutstadiet njursjukdom (ESRD). Tyvärr är specifika behandlingsalternativ begränsade och progression till ESRD är oundviklig. Glomerular sjukdomar definieras av närvaron av glomerular skada och kan grupperas i inflammatoriska och icke-inflammatoriska sjukdomar. Även om den ursprungliga förolämpningen är annorlunda, nyligen genomförda studier har visat att en gemensam cellulär mekanism leder till glomerular epitelial cell hyperplasi och i slutändan till glomeruloskleros i alla glomerular sjukdomar, oavsett den underliggande orsaken1,2,3,4.
Närmare bestämt visade det sig att glomerulosclerotic lesioner huvudsakligen består av aktiverade parietala epitelceller5,6. Under fysiologiska förhållanden, parietala epitelceller är platt quiescent epitelceller som kantar Bowman kapsel av glomerulus. Eventuella glomerära skador antingen på grund av genetiska mutationer (t.ex. podocyter specifika eller mitokondriella cytopatier), inflammation eller hyperfiltrering (t.ex., orsakad av minskad njurmassa, hypertoni, fetma eller diabetes mellitus) kan utlösa aktivering av parietala epitelceller. Aktiverade parietala epitelceller förökar sig och deponerar extracellulär matris som resulterar i bildandet av cellulära halvmånar eller sklerotiska lesioner5,,7,8. Progression av dessa processer resulterar i förlust av njurfunktion9. Därför är parietal epitelial cell aktivering en viktig faktor i utvecklingen och utvecklingen av glomeruloskleros i både inflammatoriska och icke-inflammatoriska glomerular sjukdomar1,2,3,4,10.
De molekylära processer som förmedlar parietal epitelial cell aktivering är fortfarande i stort sett okänd. Nyligen genomförda studier visar att aktiverade parietala epitelceller de novo express CD44, en receptor som är viktig för aktivering av olika vägar som är involverade i cellulär spridning och migration. Dessutom, hämning av CD44 visade sig hämma parietal epitelial cell aktivering och dämpa utvecklingen av halvmåne bildning och glomeruloskleros i djurmodeller av inflammatoriska samt icke-inflammatoriska glomerular sjukdomar11,12.
Som parietal epitelial cell aktivering är en viktig aktör för utveckling av glomeruloskleros och halvmåne bildning, hämning av dessa celler kan bromsa utvecklingen av glomerular sjukdomar. Förtydligande av de molekylära vägar som driver parietal epitelial cell aktivering kan leda till utveckling av specifika terapeutiska interventioner som försvaga bildandet av hyperplastiska och glomerulosclerotic skador i glomerular sjukdom.
I experimentella djurmodeller är det ofta svårt att bevisa en direkt effekt av ett förändrat genuttryck (knock-out-modeller eller transgena musmodeller) eller läkemedelsbehandling på parietala epitelceller. I en konventionell knock-out mus de observerade in vivo förändringar kan förklaras av direkta förändringar i parietal epitelceller. Men eftersom genuttrycket också ändras i andra celltyper i musen, kan man inte utesluta indirekta effekter som medierats av andra celltyper. Utvecklingen av villkorliga cre-lox möss som drivs av promotorer främst verksamma inom parietal epitelceller har gett en lösning i vissa fall13. Icke desto mindre är villkorliga transgena modeller komplexa och även om fler villkorade linjer blir tillgängliga, finns det ännu inte något villkorat substitut för många av de konventionella knock-out- eller transgena muslinjerna.
För att studera de direkta effekterna på parietala epitelceller har vår grupp utvecklat en ex vivo-analys med hjälp av enstaka inkapslade glomeruli isolerade från musnjurar för att mäta och analysera parietal epitelial cellproliferation och migration. Denna metod kommer att göra det möjligt för oss att bestämma parietal epitelial cell specifika effekter och att hitta ansvariga vägar för parietal epitelial cell aktivering och test behandlingsalternativ för att hämma denna aktivering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök utfördes i enlighet med riktlinjerna från den djuretiska kommittén vid Radboud-universitetet Nijmegen.
Obehandlade, friska vilda möss (WT) möss (n = 4) och cd44-/- (n = 4) möss offrades vid en ålder av 12−16 veckor. Både han- och honmöss användes. Alla möss var på C57Bl/6 bakgrund.
1. Mus njure dissekering
- Offra friska WT möss eller genetiskt modifierade möss genom livmoderhalscancer störning.
- Dissekera hela musnjurar direkt efter att ha offra mössen. För detta, utför en median laparotomy med buksax, skär huden och sedan magmusklerna. Ta bort tarmen och placera den bredvid musen.
- Befria njurarna från att ansluta vävnad och dra ut njuren med hjälp av kirurgiska pincett, skära njurartären, njurlyna och urinledaren med sax.
- Ta bort njurkapslarna från njurarna genom att hålla njurarna med kirurgiska pincett och dra av kapseln med ett annat par pincett.
- Placera njurarna i en 6-brunns cellodlingsplatta (2 njurar/brunn) beredd med 2 ml Hanks balanserade saltlösning (HBSS) per brunn och placera på is.
2. Isolering av glomeruli från mus njure
- Överför njurarna till en 100 mm petriskål och finhacka njurarna i små bitar av 1−2 mm med hjälp av två skalpell. Håll de malda njurbitarna våta med 1−2 ml HBSS.
- Placera de malet njurbitarna ovanpå en 300 μm metallsikt och tryck njuren genom silen med en kolv på en 20 ml-spruta. Skölj silen upprepade gånger med HBSS däremellan och samla in genomströmningen i en ren petriskål med hjälp av en serologisk pipet. Samla också allt som återstår/pinnar till den nedre sidan av sikten, genom att skrapa av det med skalpellen och överför det till det samlade flöde-igenom (njure homogenatet).
- Skölj njurhomogenatet genom en 75 μm sikt med HBSS. Samla genom flödet och skölj därefter detta genomflöde genom en sikt på 53 μm. Tvätta båda sikterna med HBSS för att avlägsna alla mindre strukturer.
OBS: I detta steg sköljs flödet-men endast men inte genom sikten på 75 μm och 53 μm. Tvättning med HBSS är nödvändigt att ta bort skräp och mindre strukturer på sikterna. Därför används normalt 200−300 mL HBSS totalt. - Samla njurstrukturerna/materialet som finns kvar på sikten på 75 μm och 53 μm genom att tvätta siktarnas övre yta med Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) kompletterat med 20% fetala kalvserum (FCS) och överföra materialet till en 6-brunns ultralåg mikroplatta.
OBS: För att tvätta siktens övre yta, skölj sikten i ett lutande läge (>45°) och samla upp njurmaterialet vid siktens kant. Det insamlade materialet är berikat för inkapslade såväl som inkapslade glomeruli, som visar endast några rörformiga fragment. Inkapslade glomeruli är mycket klibbig. För att samla enda glomeruli är det därför viktigt att förhindra glomeruli att hålla sig till ytan av en petriskål eller brunnsplatta. För att undvika anslutning, använd medium med 20% FCS och använd extremt låga fästplattor för detta steg.
3. Odling av glomerular utväxt
- Ta med mikroplattan med ultralåga tillbehör till ett inverterat ljusmikroskop och samla in enkel inkapslad och/eller avkapslad glomeruli med en 20 μL pipett. Undvik pipettering andra strukturer och skräp. Efter att ha samlat en enda glomerulus i pipettspetsen, tillsätt färskt DMEM-medium utan uppsamlat njurmaterial i samma pipettspets till en volym av 20 μL.
- Överför den enda glomerulus med 20 μL DMEM medium till mitten av en brunn av en 24-brunn cell kultur platta och inkubera för 3 h vid 37 °C och 5% (v / v) CO2 för att möjliggöra fastsättning av glomerulus till mitten av brunnen. Flytta försiktigt plattan för att undvika flytande av glomerulus till boarders av brunnen.
- Efter 3 h inkubation är glomerulusen fäst vid mitten av brunnen. Tillsätt försiktigt 500 μl endotelbasalmedium (EBM) kompletterat med ett tillväxtfaktorkit som innehåller hydrokortison, mänsklig endoteltillväxtfaktor, bovin hjärnextrakt och gentamicinsulfat-amphotericin B (Tabell över material) och ytterligare 5% (v/v) FBS och 1% (v/v) penicillin/streptomycin (penna/strep) till varje brunn.
- Odla den enda glomeruli i 6 dagar vid 37 °C, 5% (v/v) CO2.
OBS: Inom 6 dagar bildas utväxt bestående av parietala epitelceller. Om man syftar till att testa effekterna av specifika föreningar eller läkemedel på parietala epitelceller bör det läggas till mediet inom denna sexdagarsperiod.
4. Analys av parietal epitelial cell spridning
- Analysera den glomerular utväxten efter 6 dagar. Ta mikroskopiska bilder med hjälp av ett digitalt inverterat ljusmikroskop.
- Använd ett bildanalysprogram (t.ex.
- För att bestämma ytan av glomerular utväxt, öppna tif. fil av den glomerular utväxten med skala bar i ImageJ. Rita en rak linje på skalfältet och bestäm avståndet i pixlar genom att klicka på analysera och mäta (t.ex. 1 mm = 460 pixel).
- Bestäm skalan genom att klicka på analysera,ange skala och skriv det kända avståndet i pixel (t.ex. 460), skriv också det kända avståndet (t.ex. 1) och längdenhet (t.ex. 1 mm). Klicka på ok.
- Bestäm vilka resultat som ska visas i resultattabellen genom att klicka på analysera och sedan ställa in mått. För att bestämma ytan av glomerular utväxt, aktivera alternativ området och visa etikett. Klicka på ok.
- För att bestämma ytan av glomerular utväxt, rita ett fritt urval runt den glomerular utväxten. Klicka på analysera och sedan mäta, en resultattabell kommer att dyka upp i ImageJ som visar ytan av utväxt i den2tidigare bestämda skalan (se steg 4.4, t.ex.
5. Karakterisering av den glomerular cellen utväxt
OBS: För att bedöma den cellulära sammansättningen av utväxten utförs immunofluorescensfärgning för cellspecifika markörer på de glomerular utväxterna vid t = 6 dagar.
- Ta försiktigt bort mediet och tvätta försiktigt glomeruli två gånger med fosfatbuffertad koksaltlösning (PBS).
- Fixera för 10 min vid rumstemperatur med 2% (w /v) paraformaldehyd (PFA) kompletterat med 4% (w /v) sackaros i PBS och tvätta försiktigt 2x med PBS.
- Inkubera med primärantikroppen med lämplig koncentration (Tabell över material) utspätt i PBS-får serumalbumin (BSA) 1% (v/v) för 1 h vid rumstemperatur.
- Ta bort antikroppslösningen och tvätta försiktigt 3x med PBS.
- Inkubera med sekundär antikropp(Tabell över material)utspätt i PBS-BSA 1% (v/v) i mörker i 45 min vid rumstemperatur.
- Tvätta försiktigt 3x med PBS och montera med 1−2 droppar vattenhaltigt monteringsmedium med 4′,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) för att visualisera kärnor och täcka brunnen med en rund täckslip.
- Ta mikroskopiska bilder med hjälp av ett fluorescerande mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett systematiskt diagram över metoden för att utföra den glomerular utväxtanalysen visas i figur 1. Figur 2A-D visar glomerular utväxter av inkapslade glomeruli vid olika tidpunkter som observerats med hjälp av ljusmikroskopi. Utväxter visas på dag 2, 4 och 6(Figur 2B-D) i kultur efter glomerulus isolering från mus njure. För att bekräfta att de utväxta cellerna är parietala epitelceller har dekapslade glomeruli också isolerats och odlats i 6 dagar enligt figur 2E,F. Decapsulated glomeruli visade ingen cell utväxt under inkubationstiden inom 6 dagar. I figur 3utfördes immunofluorescensfärgning för olika parietala epitelceller, podocyter specifika markörer samt endotel cellmarkörer. Resultaten bekräftar att de växande cellerna verkligen är parietala epitelceller. Figur 4 visar utväxten av isolerade inkapslade glomeruli från cd44-/- vs WT möss efter 6 dagar i kultur. Glomeruli isolerade från cd44-/- möss visade ett minskat antal utväxta celler samt en minskad yta av glomerular utväxt jämfört med glomeruli isolerade från WT möss, vilket tyder på en viktig roll för CD44 i parietal epitelcell aktivering som publicerats tidigare11. I figur 5ges ett exempel, där ytan på de utväxta parietalepilecellerna bestäms med ImageJ.
Figur 1: Schematisk översikt över metoden för att utföra en glomerular utväxt analys för att analysera parietal epitelial cell spridning. (1) Njurar dissekeras från offrade mus och malet i små bitar. (2) Njurvävnaden pressas genom sikten på 300 μm och sköljs genom sikten på 75 μm och 53 μm. (3) Glomeruli som finns kvar ovanpå siktarna samlas upp med medium + 20% (v/v) FCS och överförs till en extremt låg fästplatta. (4) Enstaka glomeruli samlas in med hjälp av ett inverterat ljusmikroskop och överförs till 24-brunnsodlingsplattor. (5) Efter inkubation vid 37 °C, 5% (v/v) CO2 i 6 dagar, kan glomerular utväxt analyseras med hjälp av ett digitalt inverterat ljusmikroskop. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Glomerular utväxt av isolerade inkapslade glomeruli från njurar dissekeras från WT möss. Utväxten av inkapslad glomeruli inkuberad vid 37 °C visas vid olika tidpunkter: (A) 0 dagar, (B) 2 dagar, (C) 4 dagar och (D) 6 dagar. Inkapslade glomeruli isolerades också och odlades vid 37 °C och mikroskopiska bilder togs vid (E) dag 0 och (F) dag 6 visar inga outgrowing celler. Skalstänger:(A,E,F)200 μm, (B) 400 μm,(C,D)1000 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Outgrowing glomerular celler visar uttryck för parietal epitelial cell markör. Immunofluorescens färgning utfördes dag 6 efter isolering av enda inkapslade glomeruli att karakterisera den utväxta epitelial celler. Outgrowing celler färgas positivt för parietal epitelial cell markörer: (A) CD44, (B) SSeCKS, och (C) claudin-1, men visade inte uttryck för (D) podocyte-specifika markör synaptopodin eller (E) den endotel cell-specifika markör CD31, som var uteslutande lokaliserade inuti glomerulus. Skalstaplar:(A,B,D,E)100μm, (C) 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Glomerular utväxt är nedsatt i glomeruli isolerade från CD44 knockout möss. Inkapslade glomeruli isolerades från dissekerade njurar av (A) WT möss och (B) cd44-/- möss. Mikroskopiska bilder togs efter 6 dagar i kultur med hjälp av en digital inverterad ljus mikroskop. Antalet urvuxna parietala epitelceller samt ytan av utväxt ökades i glomeruli från WT möss jämfört med cd44-/- möss, vilket tyder på en viktig roll för CD44 i parietal epitelial cell aktivering. Skala barer: 1000 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Ett exempel på analysen av ytan på den glomerära utväxten som en markör för parietal epitelial cellproliferation med ImageJ (FIJI). (A)Glomerular utväxt av en inkapslad glomerulus av en WT mus efter 6 dagar i kultur vid 37 °C. (B) Först bestäms vågen att analysera ytan i mm2. Här: 1 mm = 460 pixel. (C)När skalan har satts in ritas en markeringslinje runt området för glomerular utväxt. (D) Detta valda område kan sedan mätas (yta i detta exempel = 2,235 mm2). Skala barer: 1000 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med hjälp av protokollet som beskrivs i denna artikel, kan man använda enstaka inkapslade glomeruli att utvärdera parietal epitelial cell spridning som är en följd av parietal epitelial cell aktivering. Denna ex vivo modell kommer att göra det möjligt för oss att studera i detalj de molekylära vägar, som är involverade i parietal epitelial cell aktivering. Den beskrivna metoden bygger på det enkla begreppet njurdissektion och siktning för att isolera och kultur inkapslade glomeruli och att jämföra spridning och/eller migration av parietala epitelceller under olika experimentella förhållanden. De resultat som kan analyseras efter 6 dagar i kultur är till exempel ytan eller diametern på utväxten eller antalet urvuxna celler i en enda kapsulerad glomerulus. En annan ansökan för denna analys kan vara att studera effekterna av läkemedel som inducerar eller hämmar molekylära vägar som kan vara inblandade i parietal epitelial cell aktivering.
Immunofluorescens färgning bekräftade att de outgrowing cellerna efter 6 dagar i kultur är parietal epitelceller som de färgade positivt för parietala epitelial cell markörer (CD44, claudin-1, SSeCKS) men inte uttrycka podocyte-specifika markör synaptopodin, eller endotelcellen CD31. I linje med resultaten av färgning, inga utväxta celler kunde observeras 6 dagar efter isolering och kultur av enda inkapslade glomeruli, vilket tyder på att det finns begränsad kontaminering av andra glomerular celler i cellen utväxt inom denna 6-dagarsperiod. En annan studie analyserade också glomerular utväxt och visade att de snabba prolifererande celler som härrör från den glomerular utväxten är verkligen härstamning från parietal epitelceller14.
Färgningsprotokollet som användes för att analysera de växande cellernas markeringsuttryck kan också anpassas för att testa andra molekyler av intresse. Immunostaining utfördes inuti brunnarna i plattorna där glomeruli var inkuberas i 6 dagar. Dessa brunnar var inte belagda men glomeruli knutna till brunnarna under den första 2−3 h inkubationen. Inkubation på glas skär eller en kammare bildsystem som skulle resultera i bättre bildbehandling var inte möjligt eftersom glomeruli inte fästs helt på ytan och glomerular utväxt var nedsatt. Detta specifika protokoll inrättades nyligen för att studera parietala epithelia cell utväxt från glomeruli av friska WT och cd44-/- möss11. Med denna metod visade det sig att CD44-bristfälliga parietalepitetelceller uppvisar en minskad spridningshastighet, vilket också visas i figur 4. Denna metod kan också användas för möss av andra stammar och även för andra genetiskt modifierade möss. I en tidigare studie användes till exempel en jämförbar metod för att analysera effekterna av glukokortikooidreceptorsignalering15.
Användningen av denna teknik för att isolera glomeruli från möss och analysera cellulära utväxter har många fördelar mot användning av förevigade parietala epitelceller för analys av vägar som deltar i parietal epitelial cell aktivering eller läkemedel som kan påverka processen för epitelial cell spridning. Först i denna metod används primära celler som direkt växer ut ur glomerulus och är bara 6 dagar i kultur. Därför genomgick parietala epitelceller från glomerära utväxter färre förändringar i fenotyp jämfört med förevigade cellinjer, som behöver ytterligare tillväxtpassager för att skapa cellinje16. Dessutom kan den metod som beskrivs här användas för att jämföra effekten av specifik gen knockout på parietal cellproliferation även för vägar som är svåra att slå ut i cellinjer på grund av nedsatt celltillväxt eller effektivitet gen knockout med hjälp av ljuddämpning metoder.
För att anpassa protokollet till andra djurmodeller eller till mänsklig njurvävnad bör siktarnas storlek optimeras för att få bästa resultat. Detta beror på att den glomerular storleken skiljer sig mellan arter och därför storleken på de siktar på vilka glomeruli kan samlas in varierar. Det är också viktigt att isolera intakt inkapslad glomeruli för denna metod. Därför bör glomeruli inte pressas utan sköljas försiktigt genom de mindre siktarna.
Ett annat kritiskt steg i protokollet är insamlingen av den inkapslade glomeruli efter siktning. Här är det viktigt att använda medium med 20% FCS för att undvika fastsättning av glomeruli till varandra. Dessutom bör den lösning som berikas med glomeruli överföras direkt till ultralåga vidhäftningsplattor eftersom, annars, glomeruli direkt kommer att fästa på ytan av vanliga cellodlingsplattor och även på ytan av plaströr vilket gör det svårt att fånga och isolera enstaka glomeruli.
Efter insamling av enda inkapslade glomeruli, bör dessa odlas 3 h i en liten volym av odlingsmedium i mitten av brunnen för att möjliggöra anslutning. Flytande av glomeruli mot boarder av brunnarna bör undvikas för att optimera avläsningen under bildanalys.
För att få bästa resultat med hjälp av det protokoll som beskrivs här, rekommenderar vi att kultur enda glomeruli och utföra avläsningen på dag 6. Vid denna tidpunkt kan en homogen cellulär utväxt bestående av parietala epitelceller observeras. Vid senare tidpunkter blir glomerular utväxt fenotypiskt heterogena som anger utväxt av andra celltyper. Därför verkar protokollet inte vara lämpligt för mycket långa inkubationstider. Man bör komma ihåg att inkubationstider för parietal epitelial cell utväxt kan variera mellan arter eller mellan olika mus stammar. Därför bör odlingstider testas och optimeras för varje musstam eller art. Dessutom bör ursprunget till glomerular utväxt alltid valideras genom färgning för parietal epitelial cell-specifika markörer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av Dutch Kidney Foundation (bidrag 14A3D104) och Nederländernas organisation för vetenskaplig forskning (NWO VIDI-stipendium: 016.156.363).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well cell culture plate | Corning Costar | ||
| anti-CD31 | BD Pharmingen | Endothelial cell marker (used concentration 1:200) | |
| chicken-anti-rat Alexa 647 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) | |
| DAPI-Fluoromount G | Southern Biotech | Mounting medium containing DAPI | |
| Digital inverted light microscope | Westburg, EVOS fl microscope | ||
| donkey-anti-goat Alexa 568 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) | |
| donkey-anti-rabbit Alexa 568 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium | Lonza | ||
| EBM Medium | Lonza | ||
| EBM-MV Single Quots kit | Lonza | containing hydrocortisone, hEGF, GA-1000, FBS and BBE | |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | ||
| Fetal Calf Serum | Lonza | ||
| Fluorescent microscope | Leica Microsystems GmbH | ||
| goat-anti-synaptopodin | Santa Cruz | Podocyte marker (used concentration 1:200) | |
| Hanks'Balanced Salt Solution | Gibco | ||
| ImageJ software | FIJI 1.51n | ||
| petri dish | Sarstedt | size 100 | |
| rabbit-anti-claudin1 | Abcam | Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:100) | |
| rabbit-anti-SSeCKS | Roswell Park Comprehensive Cancer Center,Buffalo, NY, USA | kindly provided by Dr. E. Gelman, Parietal epithelial cell marker | |
| rat-anti-CD44 | BD Pharmingen | Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:200) | |
| scalpel | Dahlhausen | size 10 | |
| Sieves | Endecotts Ltd | size 300 µm, 75 µm, 53 µm, steel | |
| syringe | BD Plastipak | size: 20 ml | |
| Ultra-Low Attachment Microplates | Corning Costar | 6-well plates |
References
- Fatima, H., et al. Parietal epithelial cell activation marker in early recurrence of FSGS in the transplant. Clinical journal of the American Society of Nephrology: CJASN. 7 (11), 1852-1858 (2012).
- Dijkman, H. B., et al. Proliferating cells in HIV and pamidronate-associated collapsing focal segmental glomerulosclerosis are parietal epithelial cells. Kidney International. 70 (2), 338-344 (2006).
- Kuppe, C., et al. Common histological patterns in glomerular epithelial cells in secondary focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 88 (5), 990-998 (2015).
- Dijkman, H., Smeets, B., van der Laak, J., Steenbergen, E., Wetzels, J. The parietal epithelial cell is crucially involved in human idiopathic focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 68 (4), 1562-1572 (2005).
- Smeets, B., et al. Parietal epithelial cells participate in the formation of sclerotic lesions in focal segmental glomerulosclerosis. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 22 (7), 1262-1274 (2011).
- Smeets, B., et al. Tracing the origin of glomerular extracapillary lesions from parietal epithelial cells. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (12), 2604-2615 (2009).
- Smeets, B., Moeller, M. J. Parietal epithelial cells and podocytes in glomerular diseases. Seminars in Nephrology. 32 (4), 357-367 (2012).
- Ryu, M., et al. Plasma leakage through glomerular basement membrane ruptures triggers the proliferation of parietal epithelial cells and crescent formation in non-inflammatory glomerular injury. The Journal of Pathology. 228 (4), 482-494 (2012).
- Eymael, J., Smeets, B. Origin and fate of the regenerating cells of the kidney. European Journal of Pharmacology. 790, 62-73 (2016).
- Smeets, B., et al. Renal progenitor cells contribute to hyperplastic lesions of podocytopathies and crescentic glomerulonephritis. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (12), 2593-2603 (2009).
- Eymael, J., et al. CD44 is required for the pathogenesis of experimental crescentic glomerulonephritis and collapsing focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 93 (3), 626-642 (2018).
- Roeder, S. S., et al. Activated ERK1/2 increases CD44 in glomerular parietal epithelial cells leading to matrix expansion. Kidney International. 91 (4), 896-913 (2017).
- Appel, D., et al. Recruitment of podocytes from glomerular parietal epithelial cells. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (2), 333-343 (2009).
- Yaoita, E., et al. Visceral epithelial cells in rat glomerular cell culture. European Journal of Cell Biology. 67 (2), 136-144 (1995).
- Kuppe, C., et al.
- Ohse, T., et al. Establishment of conditionally immortalized mouse glomerular parietal epithelial cells in culture. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 19 (10), 1879-1890 (2008).
