Glomerular Utväxt som en Ex Vivo-analys för att analysera vägar som är inblandade i parietal epitelial cellaktivering
Summary
Denna artikel beskriver en metod för odling och analysera glomerular parietal epitelial cell utväxter av inkapslade glomeruli isolerade från musen njure. Denna metod kan användas för att studera vägar som är involverade i parietal epitelial cell spridning och migration.
Abstract
Parietal epitelial cell (PEC) aktivering är en av de viktigaste faktorerna som deltar i utvecklingen och utvecklingen av glomerulosclerosis. Hämning av vägar som deltar i parietal epitelial cell aktivering kan därför vara ett verktyg för att dämpa utvecklingen av glomerular sjukdomar. Denna artikel beskriver en metod för att odla och analysera parietala epitelial cell utväxt av inkapslade glomeruli isolerade från musen njure. Efter dissekering isolerade mus njurar, vävnaden mals, och glomeruli isoleras genom siktning. Inkapslade glomeruli samlas in, och enda glomeruli odlas i 6 dagar för att få glomerular utväxt av parietal epitelceller. Under denna period kan parietal epitelial cell spridning och migration analyseras genom att bestämma cellnummer eller yta av utväxta celler. Denna analys kan därför användas som ett verktyg för att studera effekterna av ett förändrat genuttryck hos transgena- eller knockout-möss eller effekterna av odlingsförhållanden på parietala epitelaliska tillväxtegenskaper och signalering. Med denna metod kan viktiga vägar som är involverade i processen för parietal epitelial cell aktivering och därmed i glomeruloskleros studeras.
Introduction
Glomerular sjukdomar är en viktig grupp av njursjukdomar och utgör en viktig orsak till slutstadiet njursjukdom (ESRD). Tyvärr är specifika behandlingsalternativ begränsade och progression till ESRD är oundviklig. Glomerular sjukdomar definieras av närvaron av glomerular skada och kan grupperas i inflammatoriska och icke-inflammatoriska sjukdomar. Även om den ursprungliga förolämpningen är annorlunda, nyligen genomförda studier har visat att en gemensam cellulär mekanism leder till glomerular epitelial cell hyperplasi och i slutändan till glomeruloskleros i alla glomerular sjukdomar, oavsett den underliggande orsaken1,2,3,4.
Närmare bestämt visade det sig att glomerulosclerotic lesioner huvudsakligen består av aktiverade parietala epitelceller5,6. Under fysiologiska förhållanden, parietala epitelceller är platt quiescent epitelceller som kantar Bowman kapsel av glomerulus. Eventuella glomerära skador antingen på grund av genetiska mutationer (t.ex. podocyter specifika eller mitokondriella cytopatier), inflammation eller hyperfiltrering (t.ex., orsakad av minskad njurmassa, hypertoni, fetma eller diabetes mellitus) kan utlösa aktivering av parietala epitelceller. Aktiverade parietala epitelceller förökar sig och deponerar extracellulär matris som resulterar i bildandet av cellulära halvmånar eller sklerotiska lesioner5,,7,8. Progression av dessa processer resulterar i förlust av njurfunktion9. Därför är parietal epitelial cell aktivering en viktig faktor i utvecklingen och utvecklingen av glomeruloskleros i både inflammatoriska och icke-inflammatoriska glomerular sjukdomar1,2,3,4,10.
De molekylära processer som förmedlar parietal epitelial cell aktivering är fortfarande i stort sett okänd. Nyligen genomförda studier visar att aktiverade parietala epitelceller de novo express CD44, en receptor som är viktig för aktivering av olika vägar som är involverade i cellulär spridning och migration. Dessutom, hämning av CD44 visade sig hämma parietal epitelial cell aktivering och dämpa utvecklingen av halvmåne bildning och glomeruloskleros i djurmodeller av inflammatoriska samt icke-inflammatoriska glomerular sjukdomar11,12.
Som parietal epitelial cell aktivering är en viktig aktör för utveckling av glomeruloskleros och halvmåne bildning, hämning av dessa celler kan bromsa utvecklingen av glomerular sjukdomar. Förtydligande av de molekylära vägar som driver parietal epitelial cell aktivering kan leda till utveckling av specifika terapeutiska interventioner som försvaga bildandet av hyperplastiska och glomerulosclerotic skador i glomerular sjukdom.
I experimentella djurmodeller är det ofta svårt att bevisa en direkt effekt av ett förändrat genuttryck (knock-out-modeller eller transgena musmodeller) eller läkemedelsbehandling på parietala epitelceller. I en konventionell knock-out mus de observerade in vivo förändringar kan förklaras av direkta förändringar i parietal epitelceller. Men eftersom genuttrycket också ändras i andra celltyper i musen, kan man inte utesluta indirekta effekter som medierats av andra celltyper. Utvecklingen av villkorliga cre-lox möss som drivs av promotorer främst verksamma inom parietal epitelceller har gett en lösning i vissa fall13. Icke desto mindre är villkorliga transgena modeller komplexa och även om fler villkorade linjer blir tillgängliga, finns det ännu inte något villkorat substitut för många av de konventionella knock-out- eller transgena muslinjerna.
För att studera de direkta effekterna på parietala epitelceller har vår grupp utvecklat en ex vivo-analys med hjälp av enstaka inkapslade glomeruli isolerade från musnjurar för att mäta och analysera parietal epitelial cellproliferation och migration. Denna metod kommer att göra det möjligt för oss att bestämma parietal epitelial cell specifika effekter och att hitta ansvariga vägar för parietal epitelial cell aktivering och test behandlingsalternativ för att hämma denna aktivering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Med hjälp av protokollet som beskrivs i denna artikel, kan man använda enstaka inkapslade glomeruli att utvärdera parietal epitelial cell spridning som är en följd av parietal epitelial cell aktivering. Denna ex vivo modell kommer att göra det möjligt för oss att studera i detalj de molekylära vägar, som är involverade i parietal epitelial cell aktivering. Den beskrivna metoden bygger på det enkla begreppet njurdissektion och siktning för att isolera och kultur inkapslade glomeruli och att jämföra spridnin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöddes av Dutch Kidney Foundation (bidrag 14A3D104) och Nederländernas organisation för vetenskaplig forskning (NWO VIDI-stipendium: 016.156.363).
Materials
| 24-well cell culture plate | Corning Costar | |
| anti-CD31 | BD Pharmingen | Endothelial cell marker (used concentration 1:200) |
| chicken-anti-rat Alexa 647 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) |
| DAPI-Fluoromount G | Southern Biotech | Mounting medium containing DAPI |
| Digital inverted light microscope | Westburg, EVOS fl microscope | |
| donkey-anti-goat Alexa 568 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) |
| donkey-anti-rabbit Alexa 568 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium | Lonza | |
| EBM Medium | Lonza | |
| EBM-MV Single Quots kit | Lonza | containing hydrocortisone, hEGF, GA-1000, FBS and BBE |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | |
| Fetal Calf Serum | Lonza | |
| Fluorescent microscope | Leica Microsystems GmbH | |
| goat-anti-synaptopodin | Santa Cruz | Podocyte marker (used concentration 1:200) |
| Hanks'Balanced Salt Solution | Gibco | |
| ImageJ software | FIJI 1.51n | |
| petri dish | Sarstedt | size 100 |
| rabbit-anti-claudin1 | Abcam | Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:100) |
| rabbit-anti-SSeCKS | Roswell Park Comprehensive Cancer Center,Buffalo, NY, USA | kindly provided by Dr. E. Gelman, Parietal epithelial cell marker |
| rat-anti-CD44 | BD Pharmingen | Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:200) |
| scalpel | Dahlhausen | size 10 |
| Sieves | Endecotts Ltd | size 300 µm, 75 µm, 53 µm, steel |
| syringe | BD Plastipak | size: 20 ml |
| Ultra-Low Attachment Microplates | Corning Costar | 6-well plates |
References
- Fatima, H., et al. Parietal epithelial cell activation marker in early recurrence of FSGS in the transplant. Clinical journal of the American Society of Nephrology: CJASN. 7 (11), 1852-1858 (2012).
- Dijkman, H. B., et al. Proliferating cells in HIV and pamidronate-associated collapsing focal segmental glomerulosclerosis are parietal epithelial cells. Kidney International. 70 (2), 338-344 (2006).
- Kuppe, C., et al. Common histological patterns in glomerular epithelial cells in secondary focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 88 (5), 990-998 (2015).
- Dijkman, H., Smeets, B., van der Laak, J., Steenbergen, E., Wetzels, J. The parietal epithelial cell is crucially involved in human idiopathic focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 68 (4), 1562-1572 (2005).
- Smeets, B., et al. Parietal epithelial cells participate in the formation of sclerotic lesions in focal segmental glomerulosclerosis. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 22 (7), 1262-1274 (2011).
- Smeets, B., et al. Tracing the origin of glomerular extracapillary lesions from parietal epithelial cells. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (12), 2604-2615 (2009).
- Smeets, B., Moeller, M. J. Parietal epithelial cells and podocytes in glomerular diseases. Seminars in Nephrology. 32 (4), 357-367 (2012).
- Ryu, M., et al. Plasma leakage through glomerular basement membrane ruptures triggers the proliferation of parietal epithelial cells and crescent formation in non-inflammatory glomerular injury. The Journal of Pathology. 228 (4), 482-494 (2012).
- Eymael, J., Smeets, B. Origin and fate of the regenerating cells of the kidney. European Journal of Pharmacology. 790, 62-73 (2016).
- Smeets, B., et al. Renal progenitor cells contribute to hyperplastic lesions of podocytopathies and crescentic glomerulonephritis. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (12), 2593-2603 (2009).
- Eymael, J., et al. CD44 is required for the pathogenesis of experimental crescentic glomerulonephritis and collapsing focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 93 (3), 626-642 (2018).
- Roeder, S. S., et al. Activated ERK1/2 increases CD44 in glomerular parietal epithelial cells leading to matrix expansion. Kidney International. 91 (4), 896-913 (2017).
- Appel, D., et al. Recruitment of podocytes from glomerular parietal epithelial cells. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (2), 333-343 (2009).
- Yaoita, E., et al. Visceral epithelial cells in rat glomerular cell culture. European Journal of Cell Biology. 67 (2), 136-144 (1995).
- Kuppe, C., et al. Investigations of Glucocorticoid Action in GN. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 28 (5), 1408-1420 (2017).
- Ohse, T., et al. Establishment of conditionally immortalized mouse glomerular parietal epithelial cells in culture. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 19 (10), 1879-1890 (2008).
