患者BMPC标本和骨转移性前列腺癌异种移植物的三维培养,保持其原始肿瘤的功能异质性,导致囊肿、球形和复杂的肿瘤状有机体。本手稿为异质患者衍生样本的 3D 培养及其使用 IFC 进行分析提供了优化策略和方案。
人类患者肿瘤标本的三维(3D)培养和前列腺癌患者衍生异种移植(PDX)模型,称为患者衍生器官(PDO),是研究前列腺癌的肿瘤发生和转移。它们的主要优点是,与不传统的细胞系相比,它们保持了原始组织独特的基因组和功能异质性。此外,PDO的3D培养物可用于预测药物治疗对个别患者的影响,是向个性化医学迈出的一步。尽管有这些优点,但少数组通常使用此方法,部分原因是 PDO 培养条件的广泛优化,这可能需要不同的患者样本。我们之前已经证明,我们的前列腺癌骨转移PDX模型,PCSD1,重述了供体患者的骨转移对抗雄激素治疗的抵抗力。我们使用 PCSD1 3D 有机体进一步描述抗雄激素抵抗机制。在概述当前发布的 PDX 和 PDO 模型研究之后,我们描述了在优化培养条件下使用圆顶或浮动基底膜(例如 Matrigel)球体(例如 Matrigel)的 PDO 3D 培养的分步协议。介绍了本体缝合成像和细胞处理,用于本体。该协议可进一步针对其他应用进行优化,包括西印、共培养等,并可用于探索与耐药性、肿瘤发生、转移和治疗相关的3D培养PDO特性。
三维培养的有机物已经引起注意,因为他们有潜力重述其原始组织1,2,3,4,5的体内结构,细胞功能和遗传特征。最重要的是,从患者肿瘤组织或患者衍生异种移植(PDX)模型建立的3D类有机体提供了宝贵的机会,以了解细胞信号机制对肿瘤发生,并确定药物治疗对每个细胞群的影响,每个细胞群6,7,8,9,10,11,12,13。Drost等人为建立人类和小鼠前列腺器官制定了标准规程,在泌尿学领域得到了广泛的应用。此外,已作出重大努力,以进一步表征3D有机体,并了解肿瘤发生和转移4,12,14,15的详细机制。除了以前为 3D 有机体培养建立且被广泛接受的协议之外,我们在这里还介绍了 PDO 的 3D 区域性的分步协议,在优化的培养条件下使用三种不同的点胶方法。
在这份手稿中,3D有机体被确立为骨转移性前列腺癌(BMPC)的体外模型。用于这些培养的细胞来自前列腺癌圣地亚哥(PCSD)系列,直接来自患者前列腺癌骨转移肿瘤组织(PCSD18和PCSD22)或患者衍生异种移植(PDX)肿瘤模型(样本命名为PCSD1、PCSD13和PCSD17)。由于前列腺癌细胞的自发性骨转移在基因工程小鼠模型16中很少见,我们利用直接将人类肿瘤细胞注射到雄性Rag2-/—-/-小鼠中建立了骨转移性前列腺癌的PDX模型17。
一旦从异质患者肿瘤细胞或患者衍生的异种移植物中建立3D有机体,确认其作为前列腺肿瘤细胞的身份并确定其在3D器官培养物中的表型至关重要。免疫荧光化学(IFC)允许在每个细胞中原位显示蛋白质表达,通常指示特定细胞群2、4的潜在功能。一般来说,包括组织和细胞在内的绝大多数样品的IFC协议是简单明了的,并且完全优化。然而,细胞密度和器官的数量可以明显低于传统培养物。因此,国际有机物的国际金融委员会协议要求采取额外步骤,以确保样品中所有有机物的正确处理和嵌入石蜡。我们描述了腺苷预嵌入工艺的其他步骤,并介绍了在幻灯片上标记切片有机体的位置的提示,提高了IFC在有机物上的成功率,特别是当有机体样本的细胞密度低于预期时。
从患者骨转移性前列腺癌细胞中提取的3D器官仍然相对少见。在这里,我们描述了成功建立BMPC串行3D患者衍生器官(PDO)的策略和进一步优化的协议。此外,还描述了用于保护具有较低细胞密度的样品中的有机物的协议,用于IFC和IHC分析。囊肿、球形和更复杂的有机体形式的差分表型表明,该协议提供了培养条件,允许患者的异体肿瘤细胞群保持其细胞表型和结构。因此,本文描述的培养条件,?…
The authors have nothing to disclose.
这项研究得到了利奥和安妮·阿尔伯特慈善基金会和JM基金会的支持。我们感谢加州大学圣地亚哥摩尔斯癌症中心的成员,杨静博士和杨凯博士允许我们使用他们的微体和兰德尔法语,外科系的技术专长。
1 mL Pipettman | Gilson | F123602 | |
1 mL Syringe | BD Syringe | 329654 | |
1.5 mL tube | Spectrum Lab Products | 941-11326-ATP083 | |
25G Needle | BD PrecisionGlide Needle | 305122 | |
4% Paraformaldehyde (PFA) | Alfa Aesar | J61899 | |
70% Ethanol (EtOH) | VWR | BDH1164-4LP | |
A83-01 | Tocris Bioscience | 2939 | |
Accumax | Innovative Cell Technologies, Inc. | AM105 | |
adDMEM | Life Technologies | 12634010 | |
Agarose | Lonza | 50000 | |
Antibody -for Cytokeratin 5 | Biolegend | 905901 | |
Antibody for Cytokeratin 8 | Biolegend | 904801 | |
B27 | Life Technologies | 17504044 | |
Bioluminescence imaging system, IVIS 200 | Perkin Elmer Inc | IVIS 200 | |
Cell Culture Plate – 24 well | Costar | 3524 | |
Cell Culture Plate – 48 well | Costar | 3548 | |
Cell Culture Plate – 6 well | Costar | 3516 | |
Cell Dissociation Solution, Accumax | Innovative Cell Technologies, Inc. | AM105 | |
Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
Cell Scraper | Sarstedt | 83.180 | |
Cell Strainer | Falcon (Corning) | 352350 | |
CO2 incubator | Fisher Scientific | 3546 | |
DAPI | Vector Vectashield | H-1200 | |
DHT | Sigma-Aldrich | D-073-1ML | |
dPBS | Corning/Cellgro | 21-031-CV | |
EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
FBS | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
FGF10 | PeproTech | 100-26 | |
FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
Forceps | Denville Scientific | S728696 | |
Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
HEPES | Gibco | 15630-080 | |
LS Columns | Miltenyi | 130-0420401 | |
Magnetic Column Seperator: QuadroMACS Separator | Miltenyi | 130-090-976 | |
Marker | VWR | 52877-355 | |
Matrigel (Growth Factor Reduced) | Mediatech Inc. (Corning) | 356231 | |
Matrigel (High Concentration) | BD (Fisher Scientific) | CB354248 | |
Microscope Imaging Software, Keyence | BZ-X800 (newest software) BZ-X700 (old software) | ||
Microscope, Keyence | BZ-X700 (model 2016-2017)/BZ-X710 (model 2018-2019) | ||
Mouse Cell Depletion Kit | Miltenyi | 130-104-694 | |
N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-100G | |
Noggin | PeproTech | 120-10C | |
OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
Parafilm | American National Can | N/A | |
Pen-Strep | Mediatech Inc. (Corning) | 30-002-CI-1 | |
Pipette tipes for 1 mL (Blue Tips) | Fisherbrand Redi-Tip | 21-197-85 | |
Plunger (from 3 mL syringe) | BD Syringe | 309657 | |
Prostaglandin E2 | Tocris Bioscience | 2296 | |
R-Spondin 1 | Trevigen | 3710-001-01 | |
SB2021190 | Sigma-Aldrich | S7076-25MG | |
Small Table Top Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002426 | |
Water Bath | Fisher Sci | 2320 | |
Y-27632 Dihydrochloride | Abmole Bioscience | M1817 |