Summary
Driedimensionale culturen van patiënt BMPC-specimens en xenografts van botgemetastaseerde prostaatkanker behouden de functionele heterogeniteit van hun oorspronkelijke tumoren, wat resulteert in cysten, sferoïden en complexe, tumorachtige organoïden. Dit manuscript biedt een optimalisatiestrategie en protocol voor de 3D-cultuur van heterogene patiëntafgeleide monsters en hun analyse met behulp van IFC.
Abstract
Driedimensionale (3D) cultuur van organoïden uit tumorspecimens van menselijke patiënten en door patiënten afgeleide xenograft (PDX) modellen van prostaatkanker, aangeduid als patiënt-afgeleide organoïden (BOB), zijn een onschatbare bron voor het bestuderen van het mechanisme van tumorigenese en metastase van prostaatkanker. Hun belangrijkste voordeel is dat ze de kenmerkende genomische en functionele heterogeniteit van het oorspronkelijke weefsel behouden in vergelijking met conventionele cellijnen die dat niet doen. Bovendien kunnen 3D-culturen van BOB worden gebruikt om de effecten van medicamenteuze behandeling op individuele patiënten te voorspellen en zijn een stap in de richting van gepersonaliseerde geneeskunde. Ondanks deze voordelen, weinig groepen routinematig gebruik maken van deze methode voor een deel vanwege de uitgebreide optimalisatie van BOB cultuur voorwaarden die nodig kunnen zijn voor verschillende patiënt monsters. We hebben eerder aangetoond dat ons BOT-metastase PDX-model voor prostaatkanker, PCSD1, de resistentie van de botmetastase van de donorpatiënt tegen anti-androgeentherapie recapituleerde. We gebruikten PCSD1 3D-organoïden om de mechanismen van anti-androgeenweerstand verder te karakteriseren. Naar aanleiding van een overzicht van de momenteel gepubliceerde studies van PDX- en BOB-modellen beschrijven we een stapsgewijs protocol voor de 3D-cultuur van BOB met behulp van koepelvormige of zwevende keldermembraan (bijvoorbeeld Matrigel) bollen in geoptimaliseerde kweekomstandigheden. In vivo worden ook steekbeeldvorming en celverwerking voor histologie beschreven. Dit protocol kan verder worden geoptimaliseerd voor andere toepassingen, waaronder westerse vlek, co-cultuur, enz.
Introduction
Driedimensionale gekweekte organoïden hebben de aandacht gevestigd op hun potentieel om de in vivo architectuur, cellulaire functionaliteit en genetische signatuur van hun oorspronkelijke weefsels1,2,3,4,5, te recapituleren. Het belangrijkste is dat 3D-organoïden die zijn vastgesteld uit tumorweefsels van patiënten tumoren of door de patiënt afgeleide xenograft (PDX)-modellen onschatbare mogelijkheden bieden om mechanismen van cellulaire signalering bij tumorigenese te begrijpen en de effecten van medicamenteuze behandeling op elke celpopulatie te bepalen6,7,8,9,10,11,12,13. Drost et al.5 ontwikkelden een standaardprotocol voor de oprichting van menselijke en muizenprostaatorganoïden, dat op grote schaal is aangenomen op het gebied van urologie. Daarnaast is aanzienlijke inspanning besteed aan verdere karakterisering van 3D-organoïden en om de gedetailleerde mechanismen van tumorigenese en metastasetebegrijpen 4,12,14,15. Naast het eerder vastgestelde en algemeen aanvaarde protocol voor 3D-organoïdenculturen, beschrijven we hier een stapsgewijs protocol voor de 3D-cultuur van bobdo met behulp van drie verschillende domingmethoden in geoptimaliseerde cultuuromstandigheden.
In dit manuscript werden 3D-organoïden opgericht als een ex vivo model van botgemetastase prostaatkanker (BMPC). De cellen die voor deze culturen worden gebruikt, kwamen uit de Prostate Cancer San Diego (PCSD) serie en werden rechtstreeks afgeleid van botuitgezaaide tumorweefsels van patiënten (PCSD18 en PCSD22) of tumormodellen van patiënt afgeleide xenograft (PDX) (monsters genaamd PCSD1, PCSD13 en PCSD17). Omdat spontane botmetastase van prostaatkankercellen zeldzaam is in genetisch gemanipuleerde muismodellen16, gebruikten we directe intra-femorale (IF) injectie van menselijke tumorcellen in mannelijke Rag2-/-γc-/- muizen om de PDX-modellen van botgemetastase prostaatkanker vast te stellen17.
Zodra 3D-organoïden zijn gevestigd uit heterogene tumorcellen van patiënten of door de patiënt afgeleide xenografts, is het essentieel om hun identiteit als prostaattumorcellen te bevestigen en hun fenotypes in de 3D-organoïde culturen te bepalen. Immunofluorescentiechemie (IFC) maakt de visualisatie van eiwitexpressie in situ in elke cel mogelijk, waarbij vaak de potentiële functies voor specifieke celpopulaties2,4worden aangegeven. In het algemeen zijn IFC-protocollen voor een overgrote meerderheid van de monsters, waaronder weefsels en cellen, eenvoudig en volledig geoptimaliseerd. De celdichtheid en het aantal organoïden kunnen echter aanzienlijk lager zijn dan die van de conventionele cultuur. Daarom vereist het IFC-protocol voor organoïden extra stappen om te zorgen voor een goede verwerking en inbedding in paraffine voor alle organoïden in de monsters. We beschrijven extra stappen voor een agarose pre-inbedding proces en tips om de locatie van gesectioneerde organoïden label op de dia die het slagingspercentage van IFC op organoïden verhoogt vooral wanneer de monsters van organoïden hebben een lagere celdichtheid dan gewenst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deze studie werd uitgevoerd in strikte overeenstemming met de aanbevelingen in de Gids voor de Universiteit van Californië San Diego (UCSD) Institutional Review Board (IRB). IRB #090401 Goedkeuring werd ontvangen van de UCSD Institutional Review Board (IRB) om chirurgische specimens te verzamelen van patiënten voor onderzoeksdoeleinden. Een geïnformeerde toestemming werd verkregen van elke patiënt en een chirurgische bot prostaatkanker metastase specimen werd verkregen uit orthopedischherstel van een pathologische fractuur in het dijbeen. Dier protocollen werden uitgevoerd onder de Universiteit van Californië San Diego (UCSD) dierenwelzijn en institutionele animal care and use committee (IACUC) goedgekeurd protocol #S10298. Cellen van mechanisch en enzymatisch gescheiden tumorweefsel van de patiënt werden intra-femmoreel geïnjecteerd in 6 tot 8 weken oude mannelijke Rag2-/-;γc-/- muizen zoals eerder beschreven17. Xenograft tumor volume werd bepaald met behulp van een in vivo bioluminescentie imaging systeem en remklauw metingen. Bij tumorgroei tot 2,0 cm (de maximaal toegestane grootte goedgekeurd door IACUC), werd de tumor geoogst voor 3D organoïden vestiging.
OPMERKING: Figuur 1 toont de workflow voor het vaststellen van 3D-organoïden en een protocolnummer voor elke stap van de experimentele procedures.
1. Verwerking van tumorweefsels van patiëntafgeleide xenograft (PDX)
OPMERKING: Dit is een eerste stap voor organoïde vestiging voor een tumor afgeleid van een xenograft muis model. Dit protocol is aangepast van een eerdere publicatie van Drost et al.5 en we hebben de mediavoorwaarden aangepast om serumsuppletie op organoïde media op te nemen.
- Verwerk het tumormonster zoals hieronder beschreven.
- Hak tumormonsters tot stukken van 1-3 mm3-formaat en vertreer de monsters met 10 mL celdissociatieoplossing voor 45 min bij kamertemperatuur.
- Om de spijsvertering te beëindigen, voeg je 20 mL DMEM complete media toe aan de samples.
- Filter de suspensie door een 70 μm celzeef. Gebruik een steriele zuigerflens om overgebleven weefsel op de bovenkant van 70 μm celzeef te duwen.
- Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min bij 4 °C.
- Was de celpellet drie keer met verse adDMEM complete media. Overeenkomen met het volume van de media voor wassen en opnieuw suspensie met het in tabel 3voorgestelde mediavolume . Bijvoorbeeld, voor een 24 goed plaat cultuur voorwaarde, het volume voor de was moet 500 μL.
OPMERKING: Zoals in tabel 3wordt weergegeven, is het protocol van toepassing op verschillende cultuurvoorwaarden. - Bepaal de uiteindelijke celtellingen met behulp van Trypan blauwe kleurstof en een hemocytometer.
- Na het verkrijgen van celtellingen, opnieuw opschorten celpellet in 80 μL van 2% FBS in PBS per 2 x 106 tumorcellen.
- Voeg 20 μL Muisceluitputtingcocktail toe per 2 x 106 tumorcellen. Meng goed en incubeer gedurende 15 min bij 2-8 °C.
- Pas het volume aan op 500 μL met 2% FBS in PBS-buffer per 2 x 106 tumorcellen.
OPMERKING: Tot 1 x 107 tumorcellen in 2,5 mL celsuspensie kunnen worden verwerkt op één LS-kolom. - Laad de LS-kolommen op de magnetische kolomafscheider en plaats een conische buis van 15 mL op een rek eronder om de doorstroming te verzamelen.
- Spoel elke kolom af met 3 mL van 2% FBS in PBS-buffer. Gooi de conische buis weg met de wasstroom-door en vervang door een nieuwe, steriele conische buis van 15 mL.
- Voeg de celsuspensie (tot 2,5 mL van 1 x 107 tumorcellen) toe aan de kolom. Verzamel flow-through dat zal de verrijkt met menselijke tumorcellen.
- Was de kolom twee maal met 1 mL van 2% FBS in PBS-buffer.
OPMERKING: Het is belangrijk om wasstappen uit te voeren zodra de kolom leeg is. Probeer ook te voorkomen dat de vorming van luchtbellen.
- Aliquot het juiste volume van celvering aan een 1.5 mL buis voor de gewenste opgezette cultuur (Tabel 3).
- Centrifugeer de 1,5 mL buis bij 300 x g en 4 °C gedurende 5 min.
- Verwijder en gooi de supernatant zorgvuldig weg.
2. Verwerking van primaire tumorweefsels van de patiënt
LET OP: Dit is een eerste stap voor organoïde vestiging.
- Volg alle stap 1, behalve het uitputtingsproces van de muiscel, wat niet nodig is voor de verwerking van primaire tumorweefsels van de patiënt.
3. Het vormen van een bijgevoegde ronde koepel op de plaat
OPMERKING: Dit manuscript beschrijft drie manieren om een koepel te maken van een mengsel van de celpellet en het keldermembraan (bijvoorbeeld Matrigel) zoals afgebeeld in figuur 1 en figuur 2. In stap 2-4 moeten de cellen en het keldermembraan op ijs worden gehouden om stolling van het keldermembraan te voorkomen.
- Zet de celpellet opnieuw op in het juiste volume van het keldermembraan (bijvoorbeeld 40 μL) voor een 24-putplaat(tabel 3).
- Pipetteer voorzichtig op en neer om ervoor te zorgen dat de cellen opnieuw goed worden opgehangen in de kelder membraan.
- Pipeter het juiste volume(tabel 3) van het membraanmengsel cel-kelder (en optioneel 10 μL adDMEM complete media) in het midden van de voorverwarmde weefselkweekplaat.
- Keer de plaat om en plaats de plaat meteen ondersteboven in de CO 2-celkweekincubator op 5% CO2, 37 °C gedurende 15 min. Dit voorkomt dat cellen zich vestigen en vasthouden aan de bodem van de plaat, terwijl het keldermembraan stollen.
- Pipeter het juiste volume (tabel 3) van voorverwarmd medium met 10 μM Y-27632 dihydrochloride in elke put.
- Plaats de plaat rechts omhoog in de CO 2-celkweekincubator (5% CO2, 37 °C).
- Verander de media elke 3-4 dagen. Gebruik na 5-7 dagen kweekmedium zonder 10 μM Y-27632 dihydrochloride om de culturen te behouden.
4. Het vormen van een drijvende koepel van een bijgevoegde ronde koepel op de plaat
- Na stap 3.7, los de koepel met behulp van een cel schraper.
5. Vorming van drijvende kralen
OPMERKING: Dit protocol wordt genoemd als drijvende kralen, omdat het mengsel van kelder membraan, media, en organoïden eruit kralen.
- Snijd een 2 inch x 4 inch stuk paraffine film.
- Plaats de paraffinefilm op de bovenkant van de divots van een leeg kantelrek uit een 1000 μL plastic pipettipbox.
- Druk voorzichtig op de paraffinefilm om de divots te traceren met behulp van een gehandschoende wijsvinger, maar zonder de paraffinefilm te doorbreken.
- Spray de paraffinefilm met 70% ethanol en zet de UV-lamp in de celkweekkap aan om de voorbereide paraffinefilm minstens 30 min te steriliseren.
- Bereid een mengsel van cellen en 20 μL keldermembraan. Zaaidichtheid kan 50.000 - 250.000 cellen per koepel zijn.
- Pipeter het mengsel van cellen verwerkt vanaf stap 1 of 2, en 20 μL keldermembraan in de mal van de divot gevormd in de voorbereide paraffinefilm.
- Resuspend de cel pellet in kelder membraan en pipet de cel vering in de voorbereide paraffine gefilmd divots.
- Plaats de gestold kralen en paraffine film in een 6-goed plaat. Een goed in een 6-put plaat kan passen tot 5 kralen.
- Pipetteer 3-5 mL voorverwarmd medium met 10 μM Y-27632 dihydrochloride in elke put terwijl ze kralen voorzichtig van de paraffinefilm borstelen.
LET OP: Als minimum volume wordt 3 mL aanbevolen. Voor een maximum aantal kralen (N=5) per put wordt 5 mL medium aanbevolen. - Plaats de plaat in een CO2-incubator (5% CO2, 37 °C).
- Verander de organoïde media om de 3-4 dagen. Gebruik na 5-7 dagen kweekmedium zonder 10 μM Y-27632 dihydrochloride om de culturen te behouden.
6. In vivo organoïden beeld stiksels met behulp van microscoop8
OPMERKING: Bepaalde microscopen zijn niet in staat om de buitenste omtrek van de celplaat (randwand) te bereiken; daarom raden we aan om de putten dicht bij de omtrek van de celplaat te gebruiken wanneer het beeld wordt gestikt.
- Plaats de celkweekplaat in een opwaartse positie in de plaathouder in de Keyence microscoop.
- Plaats de lens op het midden van de doelkoepel.
- Stel het automatische stikproces in door het aantal frames te selecteren. Voor voorbeelden kan 3 x 3 of 5 x 5 worden gekozen om in totaal 9 afbeeldingen of 25 afbeeldingen te genereren.
- Druk op de opnameknop om het beeldvormingsproces te starten.
- Open de software voor de beeldviewer en laad een groep foto's die zijn gemaakt door stap 4.
- Klik op Afbeeldingsstiksels om een gestikte afbeelding met hoge resolutie te maken.
OPMERKING: Het vastleggen van seriële 9- of 25-afbeeldingen kan handmatig of automatisch worden uitgevoerd om de cellen te scherpstellen.
7. Organoïde verwerking voor histologie: de agarose spin down methode
OPMERKING: Dit protocol is aangepast van een eerdere publicatie door Vlachogiannis et al.7. We hebben een stap toegevoegd met agarose inbedding om alle populaties organoïden succesvol in te bedden.
- Verwijder bestaande media uit de put. Wees voorzichtig niet te zuigen de kelder membraan koepels.
- Voeg een gelijke (gelijk aan het volume van de media verwijderd uit stap 1) volume van cel herstel oplossing en uitbroeden voor 60 min bij 4 °C.
- Verbreek de kelder membraan koepel met behulp van een pipet en verpletteren de kelder membraan koepel met behulp van een pipet tip. Verzamel de gescheiden koepel- en celhersteloplossing in een buis van 1,5 mL.
- Centrifugebij 300 x g en 4 °C gedurende 5 min.
- Verwijder de supernatant (celhersteloplossing). Sla alle supernatants in afzonderlijke buizen tot het einde wanneer de aanwezigheid van organoïden wordt bevestigd in de laatste pelleting stap.
- Voeg het gewenste volume(tabel 3) van koude PBS toe en tpijp voorzichtig op en neer om de pellet mechanisch te storen.
- Centrifugebij 300 x g en 4 °C gedurende 5 min.
- Verwijder de supernatant (PBS).
- Bevestig de pellet in een afgestemd volume (bijvoorbeeld 500 μL voor één pellet uit de 24 putplaatkweekconditie, tabel 3) van 4% PFA voor 60 min bij kamertemperatuur.
- Centrifugebij 300 x g en 4 °C gedurende 5 min.
- Verwijder de supernatant (PFA).
- Was met afgestemd volume (bijvoorbeeld 500 μL voor één pellet uit de 24 putplaatkweekconditie, tabel 3) van PBS en centrifuge bij 300 x g en 4 °C gedurende 5 min.
- Bereid warme agarose (2% agarose in PBS).
OPMERKING: Hier kunnen celpellets voor bevroren secties direct opnieuw worden opgehangen in 200 μL OCT-verbinding zonder verdere stappen in Protocol 7. - De celpellet opnieuw opschorten in 200 μL agarose (2% in PBS).
- Onmiddellijk na het toevoegen van agarose, voorzichtig los de cel pellet van de muur van de 1,5 mL buis met behulp van de 25 G naald bevestigd aan 1 mL spuit. Zoals blijkt uit figuur 3, als de celpellet niet fysiek losstaat van de wand van de 1,5 mL-buis, bestaat het risico dat de celpellet geheel of gedeeltelijk verloren gaat tijdens het inbeddingsproces van agarose.
- Wacht tot de 2% agarose in PBS volledig gestold is.
- Maak het gestolde agaroseblok los van de 1,5 mL buis met behulp van een 25 G naald aan de 1 mL spuit.
- Breng het vrijstaande agaroseblok met de celpellet over op een nieuwe 1,5 mL-buis.
- Vul de buis met 70% EtOH en ga verder met behulp van het conventionele protocol voor weefseluitdroging en paraffine inbedding.
8. Histologie en immunofluorescerende cytochemie (IFC) van organoïden
- Selecteer de dia(s) voor histologie of IFC.
- Voordat u het kleuringsproces initieert, zoekt u uit waar de cellen zich op de dia bevinden en teken u met een markering een cirkel rond de cellen op de dia.
- Teken de omtrek rond de rand of boarder van de dia en waar cirkels zich op de dia bevinden in een laboratoriumnotitieblok om hun locaties vast te leggen.
- Voer de gewenste kleuring uit.
OPMERKING: Tijdens dit proces verdwijnen gemarkeerde cirkels omdat de reguliere maker niet bestand is tegen de chemicaliën. Zelfs sommige histologie permanente markers kunnen worden gewist tijdens kleuring proces. - Plaats na het kleuringsproces de dia over de tekening in het laboratoriumnotitieblok om de locaties van cellen op de dia te vinden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
3D-organoïden werden met succes vastgesteld van een patiënt afgeleid xenograft (PDX) model van botgemetastaseerde prostaatkanker (BMPC) evenals rechtstreeks uit de patiënt botuitgezaaide prostaatkanker weefsel(figuur 4). Kortom, onze PDX-modellen van BMPC werden vastgesteld door intra-femur (IF) injectie van tumorcellen in mannelijke Rag2-/- c-/- muizen en vervolgens PDX tumoren werden geoogst en verwerkt zoals beschreven in dit manuscript. Zoals blijkt uit figuur 4,resulteerden PDX tumorweefsels uit de PCSD-serie in 3D-organoïden met differentiële fenotypes die zich manifesteerden als cysten, sferoïden en hogere complexiteitsorganoïden die zich vormden met behulp van dit protocol.
Een gestikt beeld van 25 hoge resolutie 10x vergroting beelden toonde een hele koepel van kelder membraan en organoïden (Figuur 5). Met behulp van beeldanalyse software, heeft men de mogelijkheid om uit te zoeken van de cellen of cel clusters die groter zijn dan een bepaalde grootte of om handmatig te selecteren sferoïden of cysten.
De stappen voor agarose inbedding van de organoïde culturen en tips om de locatie van gesectioneerde organoïden op de dia label verhogen het succes van het uitvoeren van IFC op de organoïden vooral wanneer de monsters van organoïden hebben een lagere celdichtheid dan gewenst. Figuur 6 toont een voorbeeld van IFC op een 5 μm dikke paraffinesectie van organoïden gericht op cytokeratine 5 (CK5, basale epitheelcelmarker), cytokeratine 8 (CK8, luminale epitheelcelmarker) en DAPI.
Figuur 1: Inrichting en karakterisering voor 3D-gekweekte organoïden die zijn afgeleid van tumorweefsels van patiënten of tumorweefsels van de patiënt. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Methoden om een mengsel van celpellets en keldermembraan te vormen. Een bijgevoegde koepel (a), een drijvende koepel (b) en drijvende kralen (c). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Een belangrijke stap voor succesvolle agarose inbedding. Een proces om de celpellet los te maken van de wand van de 1,5 mL buis. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Differentiële fenotypes van organoïden uit een reeks PCSD PDX-tumoren, waaronder enkele cellen, cysten, sferoïden en hogere complexiteitsorganoïden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Voorbeeld van een ruwe gestikte afbeelding van in totaal 25 afbeeldingen met hoge resolutie en de toepassing ervan voor een follow-upanalyse om het aantal cellen te tellen of het gebied van cellen/celclusters te meten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: Afbeelding met CK5 en CK8 IFC gekleurde PCSD1-organoïden (5 μm dikte paraffinesectie). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Voorraadcomponent | Eindconcentratie | Vol (mL) nodig voor 500 ml oplossing |
| 1000 mM HEPES | 10 mM | 5 |
| 200 mM Glutamax | 2 mM | 5 |
| 100x Pen-Strep | 1x | 5 |
| adDMEM/F12 +/+/+ | 485 |
Tabel 1: adDMEM/F12 +/+/+ Voorbereiding. Deze tabel is eerder gepubliceerd door Drost et al.5.
| Voorraadcomponent | Eindconcentratie | Vol (μL) nodig voor 50 mL oplossing | Vol (μL) nodig voor 25 mL oplossing |
| 50x B27 | 50x verdund | 1000 | 500 |
| 500 mM N-Acetylcysteïne | 1,25 mM | 125 | 62.5 |
| 0,5 mg/mL EGF | 5 ng/mL | 0.5 | 0.3 |
| 100 ug/mL Noggin | 100 ng/mL | 50 | 25 |
| R-Spondin 1 | 10% geconditioneerd medium | 5000 | 2500 |
| 5 mM A83-01 | 500 nM | 5 | 2.5 |
| 0,1 mg/mL FGF10 | 10 ng/mL | 5 | 2.5 |
| 50 μg/mL FGF2 | 5 ng/mL | 5 | 2.5 |
| 10 mM Prostaglandin E2 | 1 μM | 5 | 2.5 |
| 1M Nicotinamide | 10 mM | 500 | 250 |
| 30 mM SB202190 | 10 μM | 16.7 | 8.4 |
| FBS | 10% | 5000 | 2500 |
| 1 μM DHT | 1 nM | 50 | 25 |
| adDMEM/F12 +/+/+ | Breng tot 50 ml | Breng tot 25 mL | |
| 100 mM Y-27632 Dihydrochloride | 10 μM | 5 | 2.5 |
Tabel 2: Componenten voor C/S Human Media + 10 % FBS. Deze tabel is eerder gepubliceerd door Drost et al.5.
| Cultuurplaat | Zaaiendichtheid (cellen) | Keldermembraanvolume (μL) | Medium (μL) |
| 48 goed | 25,000-50,000 | 20 | 250 |
| 24 goed | 50,000-250,000 | 40 | 500 |
| 6 goed | 50,000-250,000 | 40 | 2,000 |
Tabel 3: Zaaidichtheid, keldermembraanvolume en gemiddeld volume dat nodig is voor één koepel. Deze tabel is gewijzigd van een eerdere publicatie door Drost et al.5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
3D-organoïden afkomstig van patiënt botmetastase prostaatkankercellen zijn nog relatief zeldzaam. Hier beschrijven we strategieën en verder geoptimaliseerd protocol om met succes gevestigde seriële 3D-patiënt afgeleide organoïden (PDOs) van BMPC. Daarnaast worden protocollen beschreven om de organoïden te beveiligen in monsters met een lagere celdichtheid voor IFC- en IHC-analyse. Differentiële fenotypes in de vorm van cyste, sferoïden en complexere organoïden geven aan dat dit protocol kweekcondities biedt die het mogelijk maken om tumorcelpopulaties in de heterogonous bij patiënten te behouden om hun cellulaire fenotype en structuur te behouden. Zo is aangetoond dat de hier beschreven cultuuromstandigheden, die zijn aangepast van Drost et al.5, aangepast met FBS-serumsuppletie, optimaal zijn voor de culturen van patiënt BMPC-afgeleide cellen, zodat ze hun intra-subject en inter-subject heterogeniteit (manuscript in voorbereiding) behouden.
Ons geoptimaliseerde protocol is praktisch voor een experimentele set-up met meerdere eindpunten van beperkt uitgangsmateriaal van primaire of PDX tumorweefsels tot het opzetten van 3D-organoïdenculturen. In het algemeen is de oprichting van 3D-organoïden uit primaire tumorweefsels van de patiënt minder succesvol dan de oprichting van 3D-organoïden uit PDX-tumorweefsels. Daarom wordt aanbevolen om een hogere zaaidichtheid (tot vier keer hoger) van cellen te hebben voor de oprichting van 3D-organoïden uit primaire tumorweefsels van de patiënt dan van PDX-tumoren). Een methode om de celopbrengst te verhogen tijdens de verwerking van tumorweefsel is het herstellen van eventuele tumorweefsel overgebleven op de top van 70 μm cel zeef door het passeren van de gefilterde cel suspensie door de zeef weer.
Afhankelijk van de analyse van het eindpunt kunnen drie verschillende methoden worden gebruikt om een 3D-organoïde cultuur te vormen (figuur 2). Bijvoorbeeld, als men wenste om de gestikte beelden te hebben na de oprichting van 3D-organoïden, een bijgevoegde koepel wordt sterk aanbevolen, omdat het beeld stikproces vereist een seriële beweging van microscopische doelstelling om het gewenste aantal beelden te verwerven (ofwel 9 of 25). Dit proces resulteert in een subtiele trilling aan de houder van celkweekplaat. Beide soorten van de drijvende koepel zal vrij bewegen als gevolg van de trillingen tijdens het verwerven van het beeld. Bovendien kunnen beide soorten drijvende koepels gemakkelijk van de ene put naar de andere worden overgebracht, waardoor ze geschikt zijn voor co-cultuur met aanhangende cellen na het opzetten van 3D-organoïde culturen en de aanhangende cellen in de afzonderlijke putten. De bijgevoegde koepel en drijvende koepel die vrijkomt van het bevestigen, hebben aangetoond dat ze tot 10 weken organoïden behouden. Interessant is dat een drijvende koepel van de floating beads methode is aangetoond dat organoïden te behouden voor maximaal 4 maanden. De drijvende kralen methode om kelder membraan bollen geïntroduceerd in ons protocol te produceren omvat meer stappen en vaardigheden, maar kan worden beschouwd voor een lange termijn cultuur. Tegelijkertijd, ondanks het gebruik ervan voor de oprichting van 3D-organoïden van verschillende tumoren en metastase, zijn de rol van de dommethode en de vorm van het keldermembraan op organoïdenvorming niet diep bepaald. In die zin kan de paraffinefilmmethode worden overwogen voor gebruik wanneer de andere twee methoden niet succesvol zijn geweest.
Voor alle drie de verschillende methoden, dit protocol beveelt het gebruik van een lager volume van de media en een hoger volume van de kelder membraan voor de resuspension proces, omdat de koepels langer zal duren in de cultuur. Een koepel wordt gevormd met een 1:4 verhouding van media en keldermembraan. Van belang, deze methode verhoogt de vorming van bellen terwijl pipetteren de cel vering op en neer, omdat het toegevoegde volume van de media niet omzeilen de viscositeit van de kelder membraan. Daarom wordt aanbevolen om 1,5 mL buizen zodanig op te zetten dat er één celpellet per koepel is in plaats van één celpellet voor meerdere koepels in één 1,5 mL-buis. Daarbij zal de vorming van bellen in één buis voor één koepel geen seriële invloed hebben op andere koepels. Als de duur van de kweekconditie eerder is geoptimaliseerd en bekend is dat het kort is (tot een maand), kan het keldermembraan meer worden verdund om het viscositeitprobleem van het keldermembraan te omzeilen. Een cel pellet resuspension voor verschillende putten kan worden voorbereid in een buis, met behulp van een hoger volume van de media om het gewenste volume van de kelder membraan om celverlies en variabiliteit te minimaliseren.
Om de vorming van bellen tijdens het pipetproces te minimaliseren, pipetert een lager volume dan het werkelijke volume van de cellen, media en kelder membraan mengsel. Bijvoorbeeld, voor een koepel binnen 24 put platen, 40 μL kelder membraan en tot 10 μL adDMEM complete media worden gemengd met de cel pellet. In dit geval kan de pipet worden ingesteld om een volume van 40 μL te verwerken in plaats van 50 μL terwijl hij op en neer pait om de vorming van bellen te minimaliseren. Voor deze tweede methode kan de celpellet resuspension voor verschillende putten in één buis worden voorbereid om celverlies en variabiliteit te minimaliseren. De vloeibare status van commercieel verkrijgbare keldermembraan is vaak variabel. Daarom moeten nieuwe partijen keldermembraan worden getest op het domingproces. Als het keldermembraan stroperder is dan normaal, kunnen tot 10 μL adDMEM complete media (details geschreven in stap 1) worden toegevoegd om het mengsel van celpellet en keldermembraan te verdunnen.
Hier presenteren we een protocol om gekweekte 3D-organoïde vast te stellen, te beelden en te verwerken met gedetailleerde tips voor een succesvolle voltooiing van de gewenste procedures. Cultuurmedia voor 3D-organoïden die in ons manuscript worden geïntroduceerd, zijn specifiek voor prostaatcellen. Andere details die in ons protocol worden beschreven, zijn echter van toepassing op verschillende soorten tumorweefsels en gemetastaseerde sites.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Sanghee Lee en Christina A.M. Jamieson zijn de gastredacteuren van JoVE Methods Collection.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door de Leo en Anne Albert Charitable Foundation en JM Foundation. Wij danken de Universiteit van Californië San Diego Moores Cancer Center leden, Dr Jing Yang en Dr Kay T. Yeung voor het toestaan van ons het gebruik van hun microtoom en Randall Frans, Department of Surgery voor technische expertise.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Pipettman | Gilson | F123602 | |
| 1 mL Syringe | BD Syringe | 329654 | |
| 1.5 mL tube | Spectrum Lab Products | 941-11326-ATP083 | |
| 25G Needle | BD PrecisionGlide Needle | 305122 | |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | Alfa Aesar | J61899 | |
| 70% Ethanol (EtOH) | VWR | BDH1164-4LP | |
| A83-01 | Tocris Bioscience | 2939 | |
| Accumax | Innovative Cell Technologies, Inc. | AM105 | |
| adDMEM | Life Technologies | 12634010 | |
| Agarose | Lonza | 50000 | |
| Antibody -for Cytokeratin 5 | Biolegend | 905901 | |
| Antibody for Cytokeratin 8 | Biolegend | 904801 | |
| B27 | Life Technologies | 17504044 | |
| Bioluminescence imaging system, IVIS 200 | Perkin Elmer Inc | IVIS 200 | |
| Cell Culture Plate - 24 well | Costar | 3524 | |
| Cell Culture Plate - 48 well | Costar | 3548 | |
| Cell Culture Plate - 6 well | Costar | 3516 | |
| Cell Dissociation Solution, Accumax | Innovative Cell Technologies, Inc. | AM105 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Cell Scraper | Sarstedt | 83.180 | |
| Cell Strainer | Falcon (Corning) | 352350 | |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | 3546 | |
| DAPI | Vector Vectashield | H-1200 | |
| DHT | Sigma-Aldrich | D-073-1ML | |
| dPBS | Corning/Cellgro | 21-031-CV | |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| FBS | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| FGF10 | PeproTech | 100-26 | |
| FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
| Forceps | Denville Scientific | S728696 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-0420401 | |
| Magnetic Column Seperator: QuadroMACS Separator | Miltenyi | 130-090-976 | |
| Marker | VWR | 52877-355 | |
| Matrigel (Growth Factor Reduced) | Mediatech Inc. (Corning) | 356231 | |
| Matrigel (High Concentration) | BD (Fisher Scientific) | CB354248 | |
| Microscope Imaging Software, Keyence | BZ-X800 (newest software) BZ-X700 (old software) | ||
| Microscope, Keyence | BZ-X700 (model 2016-2017)/BZ-X710 (model 2018-2019) | ||
| Mouse Cell Depletion Kit | Miltenyi | 130-104-694 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-100G | |
| Noggin | PeproTech | 120-10C | |
| OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Parafilm | American National Can | N/A | |
| Pen-Strep | Mediatech Inc. (Corning) | 30-002-CI-1 | |
| Pipette tipes for 1 mL (Blue Tips) | Fisherbrand Redi-Tip | 21-197-85 | |
| Plunger (from 3 mL syringe) | BD Syringe | 309657 | |
| Prostaglandin E2 | Tocris Bioscience | 2296 | |
| R-Spondin 1 | Trevigen | 3710-001-01 | |
| SB2021190 | Sigma-Aldrich | S7076-25MG | |
| Small Table Top Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002426 | |
| Water Bath | Fisher Sci | 2320 | |
| Y-27632 Dihydrochloride | Abmole Bioscience | M1817 |
References
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Tushir, J. S., et al. Unregulated ARF6 activation in epithelial cysts generates hyperactive signaling endosomes and disrupts morphogenesis. Molecular Biology of the Cell. 21 (13), 2355-2366 (2010).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- McCray, T., Richards, Z., Marsili, J., Prins, G. S., Nonn, L. Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture. Journal of Visualized Experiments. (143), 59051 (2019).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
- Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Abou-Kheir, W. G., Hynes, P. G., Martin, P. L., Pierce, R., Kelly, K. Characterizing the contribution of stem/progenitor cells to tumorigenesis in the Pten-/-TP53-/- prostate cancer model. Stem Cells. 28 (12), 2129-2140 (2010).
- Beshiri, M. L., et al. A PDX/Organoid Biobank of Advanced Prostate Cancers Captures Genomic and Phenotypic Heterogeneity for Disease Modeling and Therapeutic Screening. Clinical Cancer Research. 24 (17), 4332-4345 (2018).
- Debnath, J., Brugge, J. S. Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures. Nature Reviews Cancer. 5 (9), 675-688 (2005).
- Lee, S. H., et al. Tumor Evolution and Drug Response in Patient-Derived Organoid Models of Bladder Cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Puca, L., et al. Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nature Communications. 9 (1), 2404 (2018).
- Murrow, L. M., Weber, R. J., Gartner, Z. J. Dissecting the stem cell niche with organoid models: an engineering-based approach. Development. 144 (6), 998-1007 (2017).
- Neal, J. T., et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
- Simmons, J. K., et al.
- Godebu, E., et al. PCSD1, a new patient-derived model of bone metastatic prostate cancer, is castrate-resistant in the bone-niche. Journal of Translational Medicine. 12, 275 (2014).
- Keyence Fluorescence Microscope. , Keyence Corporation. Available from: https://www.keyence.com/ss/products/microscope/bz-x/ (2019).
