Summary
Culturas tridimensionais de amostras de BMPC pacientes e xenoenxertos de câncer de próstata metastático mantêm a heterogeneidade funcional de seus tumores originais resultando em cistos, esferoides e organoides complexos, semelhantes a tumores. Este manuscrito fornece uma estratégia de otimização e protocolo para a cultura 3D de amostras derivadas de pacientes heterogêneos e sua análise utilizando IFC.
Abstract
Cultura tridimensional (3D) de organoides de tumores de pacientes humanos e modelos de xenoenxerto derivados do paciente (PDX) de câncer de próstata, referidos como organoides derivados do paciente (PDO), são um recurso inestimável para estudar o mecanismo de câncer de próstata tumorigênese e metástase do câncer de próstata. Sua principal vantagem é que eles mantêm a heterogeneidade genômica e funcional distinta do tecido original em comparação com as linhas celulares convencionais que não. Além disso, culturas 3D de PDO podem ser usadas para prever os efeitos do tratamento medicamentoso em pacientes individuais e são um passo para a medicina personalizada. Apesar dessas vantagens, poucos grupos utilizam rotineiramente esse método em parte devido à ampla otimização das condições culturais pdo que podem ser necessárias para diferentes amostras de pacientes. Demonstramos anteriormente que nosso modelo de Metástase Óssea do câncer de próstata PDX, PCSD1, recapitulou a resistência da metástase óssea do paciente doador à terapia antiandgênica. Usamos organoides PCSD1 3D para caracterizar mais os mecanismos de resistência antiandrogênica. Seguindo uma visão geral dos estudos publicados atualmente dos modelos PDX e PDO, descrevemos um protocolo passo a passo para a cultura 3D de PDO usando esferas de membrana de porão de domed ou flutuante (por exemplo, Matrigel) em condições de cultura otimizadas. Também são descritas imagens de pontos vivos e processamento celular para histologia. Este protocolo pode ser ainda mais otimizado para outras aplicações, incluindo mancha ocidental, co-cultura, etc. e pode ser usado para explorar características do PDO cultivado cultivado em 3D relativos à resistência a medicamentos, tumorigênese, metástase e terapêutica.
Introduction
Organoides culturais tridimensionais têm chamado a atenção por seu potencial de recapitular a arquitetura in vivo, funcionalidade celular e assinatura genética de seus tecidos originais1,2,3,4,5. Mais importante, organoides 3D estabelecidos a partir de tecidos tumorais pacientes ou modelos de xenoenxerto derivados do paciente (PDX) oferecem oportunidades inestimáveis para entender mecanismos de sinalização celular sobre tumorigênese e determinar os efeitos do tratamento medicamentoso em cada população celular6,7,8,9,10,11,12,13. Drost et al.5 desenvolveram um protocolo padrão para o estabelecimento de organoides de próstata humano e rato, que tem sido amplamente adotado no campo da urologia. Além disso, foram dedicados esforços significativos para maior caracterização de organoides 3D e para compreender os mecanismos detalhados de tumorigênese e metástase4,12,14,15. Além do protocolo previamente estabelecido e amplamente aceito para culturas de organoides 3D, descrevemos aqui um protocolo passo a passo para a cultura 3D do PDO usando três métodos de doming diferentes em condições culturais otimizadas.
Neste manuscrito, os organoides 3D foram estabelecidos como um modelo ex vivo de câncer de próstata metastático ósseo (BMPC). As células utilizadas para essas culturas vieram da série DeSone câncer de próstata San Diego (PCSD) e foram derivadas diretamente de tecidos tumores metastáticos do câncer de próstata paciente (PCSD18 e PCSD22) ou modelos de tumor derivados do paciente (PDX) (amostras chamadas PCSD1, PCSD13 e PCSD17). Como a metástase óssea espontânea das células cancerígenas da próstata é rara nos modelos de camundongos geneticamente modificados16,usamos injeção intra-femoral direta (IF) de células tumorais humanas em rag2 masculino-/-γc-/- camundongos para estabelecer os modelos PDX de câncer de próstata metastáticoósseo 17.
Uma vez que os organoides 3D são estabelecidos a partir de células tumorais heterogêneas ou xenoenxertos derivados do paciente, é essencial confirmar sua identidade como células tumorais de próstata e determinar seus fenótipos nas culturas organoides 3D. A química da imunofluorescência (IFC) permite a visualização da expressão proteica in situ em cada célula, muitas vezes indicando as funções potenciais para populações específicas de células2,4. Em geral, os protocolos IFC para uma grande maioria das amostras, incluindo tecidos e células, são simples e totalmente otimizados. No entanto, a densidade celular e o número de organoides podem ser significativamente menores do que o da cultura convencional. Portanto, o protocolo IFC para organoides requer etapas adicionais para garantir o processamento adequado e incorporação em parafina para todos os organoides nas amostras. Descrevemos etapas adicionais para um processo de preincorporação de agarose e dicas para rotular a localização de organoides seccionados no slide que aumenta a taxa de sucesso do IFC em organoides especialmente quando as amostras de organoides têm menor densidade celular do que o desejado.
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Protocol
Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Conselho de Revisão Institucional (UCSD) da Universidade da Califórnia em San Diego (UCSD). O IRB #090401 Aprovação foi recebido do Conselho de Revisão Institucional (IRB) da UCSD para coletar amostras cirúrgicas de pacientes para fins de pesquisa. Um consentimento informado foi obtido de cada paciente e um espécime cirúrgico de metástase do câncer de próstata foi obtido a partir do reparo ortopédico de uma fratura patológica no fêmur. Os protocolos animais foram realizados o #S10298 protocolo aprovado pelo Comitê de Assistência e Uso de Animais Institucionais (UcSD) da Universidade da Califórnia em San Diego (UCSD). Células de tecido tumoral mecanicamente e enzimático dissociado foram injetadas intra-femoralmente em Rag2masculino de 6 a 8 semanas-/-;γc-/- camundongos como descrito anteriormente17. O volume do tumor de xenoenxerto foi determinado usando um sistema de imagem de bioluminescência in vivo e medidas de pinça. Após o crescimento do tumor até 2,0 cm (o tamanho máximo permitido aprovado pelo IACUC), o tumor foi colhido para o estabelecimento de organoides 3D.
NOTA: A Figura 1 mostra o fluxo de trabalho para a criação de Organoides 3D e um número de protocolo para cada etapa dos procedimentos experimentais.
1. Processamento de tecidos tumorais derivados do paciente (PDX)
NOTA: Este é um passo inicial para o estabelecimento organoide para um tumor derivado de um modelo de rato xenoenxerto. Este protocolo é adaptado de uma publicação anterior de Drost et al.5 e modificamos as condições da mídia para incluir suplementação soro a mídia organoide.
- Processe o espécime tumoral como descrito abaixo.
- Mince amostras de tumor escaneie amostras de tumor escaneie 1-3 mm3 pedaços de tamanho e digerir as amostras com 10 mL de solução de dissociação celular por 45 min à temperatura ambiente.
- Para interromper a digestão, adicione 20 mL de mídia completa DMEM às amostras.
- Filtre a suspensão através de um filtro de célula de 70 μm. Use uma flange de êmbolo estéril para empurrar qualquer tecido restante na parte superior do filtro celular de 70 μm.
- Centrífuga a 300 x g por 5 min a 4 °C.
- Lave a pelota celular três vezes com mídia completa adDMEM fresca. Combine o volume de mídia para lavagem e resuspensão com o volume de mídia sugerido na Tabela 3. Por exemplo, para uma condição de cultura de placa de poço 24, o volume para a lavagem deve ser de 500 μL.
NOTA: Como mostrado na Tabela 3,o protocolo é aplicável a diferentes condições culturais. - Determine contagem final de células usando tinantes azuis trypan e um hemocímetro.
- Após a obtenção da contagem de células, suspenda novamente a pelota celular em 80 μL de 2% de FBS em PBS por 2 x 106 células tumorais.
- Adicione 20 μL do Coquetel de Esgotamento celular do rato por 2 x 106 células tumorais. Misture bem e incuba por 15 min a 2-8 °C.
- Ajuste o volume para 500 μL com 2% de FBS em tampão PBS por 2 x 106 células tumorais.
NOTA: Até 1 x 107 células tumorais em 2,5 mL de suspensão celular podem ser processadas em uma coluna de LS. - Carregue as colunas LS no separador da coluna magnética e coloque um tubo cônico de 15 mL em um rack por baixo para coletar o fluxo-through.
- Enxágüe cada coluna com 3 mL de 2% FBS em tampão PBS. Descarte o tubo cônico com o fluxo de lavagem e substitua por um novo tubo cônico estéril de 15 mL.
- Adicione a suspensão celular (até 2,5 mL de 1 x 107 células tumorais) na coluna. Coletar fluxo-through que será o enriquecido com células tumorais humanas.
- Lave a coluna duas vezes com 1 mL de 2% FBS no buffer PBS.
NOTA: É importante realizar etapas de lavagem assim que a coluna estiver vazia. Além disso, tente evitar formar bolhas de ar.
- Aliquot o volume apropriado de suspensão celular a um tubo de 1,5 mL para a cultura desejada configurada(Tabela 3).
- Centrífuga o tubo de 1,5 mL a 300 x g e 4 °C para 5 min.
- Remova cuidadosamente e descarte o supernatante.
2. Processamento de tecidos tumorais primários pacientes
NOTA: Este é um passo inicial para o estabelecimento organoide.
- Siga toda a etapa 1, exceto o processo de esgotamento das células do camundongo, o que não é necessário para o processamento de tecidos tumorais primários do paciente.
3. Formando uma cúpula redonda anexada na placa
NOTA: Este manuscrito descreve três maneiras de fazer uma cúpula a partir de uma mistura da pelota celular e da membrana do porão (por exemplo, Matrigel) como mostrado na Figura 1 e Figura 2. Nos passos 2-4, as células e a membrana do porão devem ser mantidas no gelo para evitar a solidificação da membrana do porão.
- Resuspender a pelota celular no volume apropriado da membrana do porão (por exemplo, 40 μL) para uma placa de 24 poços configurada(Tabela 3).
- Pipette para cima e para baixo suavemente para garantir que as células sejam resuspensas bem na membrana do porão.
- Pipette o volume apropriado (Tabela 3) da mistura de membrana do porão celular (e opcional 10 μL de mídia completa adDMEM) no centro da placa de cultura do tecido pré-aquecido.
- Inverta a placa e coloque imediatamente a placa de cabeça para baixo na incubadora de cultura celular CO2 situada em 5% CO2, 37 °C para 15 min. Isso impede que as células se acomodem e aderem ao fundo da placa, permitindo que a membrana do porão se solidifique.
- Pipette o volume apropriado (Tabela 3) de médio pré-aquecido contendo 10 μM Y-27632 dicloridor em cada poço.
- Coloque a placa do lado direito dentro da incubadora de cultura celular CO2 (5% CO2, 37 °C).
- Troque a mídia a cada 3-4 dias. Após 5-7 dias, use o meio cultural sem 10 μM Y-27632 dihidrocloreto para manter as culturas.
4. Formando uma cúpula flutuante de uma cúpula redonda anexada na placa
- Após o passo 3.7, desapego a cúpula usando um raspador de celular.
5. Formando contas flutuantes
NOTA: Este protocolo é nomeado como contas flutuantes, uma vez que a mistura de membrana de porão, mídia e organoides parecem contas.
- Corte um pedaço de filme de parafina de 2 polegadas x 4 polegadas.
- Coloque o filme de parafina na parte superior dos divots de um rack vazio de uma caixa de ponta de 1000 μL.
- Pressione suavemente o filme parafina para rastrear os divots usando um dedo indicador enluvado, mas sem quebrar o filme parafina.
- Pulverize a parafina com 70% de etanol e ligue a lâmpada UV no capô da cultura celular para esterilizar o filme de parafina preparado por pelo menos 30 min.
- Prepare uma mistura de células e 20 μL de membrana do porão. A densidade de sementes pode ser de 50.000 - 250.000 células por cúpula.
- Pipeta a mistura de células processadas a partir da etapa 1 ou 2, e 20 μL de membrana do porão no molde do divot formado no filme de parafina preparado.
- Resuspender a pelota celular na membrana do porão e pipeta a suspensão celular na parafina preparada filmada divots.
- Coloque as contas solidificadas e o filme de parafina em uma placa de 6 poços. Uma bem em uma placa de 6 poços pode caber até 5 contas.
- Pipette 3-5 mL de meio pré-aquecido contendo 10 μM Y-27632 dicloridor em cada poço enquanto escova suavemente contas fora do filme parafina.
NOTA: Como volume mínimo, recomenda-se 3 mL. Para um número máximo de contas (N=5) por poço, recomenda-se 5 mL de médio. - Coloque a placa dentro de uma incubadora co2 (5% CO2, 37 °C).
- Troque a mídia organoide a cada 3-4 dias. Após 5-7 dias, use o meio cultural sem 10 μM Y-27632 dihidrocloreto para manter as culturas.
6. Na costura de imagem de organoides vivo usando microscópio8
NOTA: Certos microscópios são incapazes de alcançar o perímetro externo da placa celular (parede de borda); portanto, sugerimos usar os poços próximos ao perímetro da placa celular quando a costura da imagem.
- Coloque a placa de cultura celular em uma posição ascendente no suporte da placa no microscópio Keyence.
- Coloque a lente no centro da cúpula alvo.
- Configure o processo de costura automática selecionando o número dos quadros. Por exemplo, 3 x 3 ou 5 x 5 podem ser escolhidos para gerar 9 imagens ou 25 imagens no total.
- Pressione o botão de captura para iniciar o processo de imagem.
- Abra o software do visualizador de imagens e carregue um grupo de imagens tiradas pelo passo 4.
- Clique em Costura de Imagem para criar uma imagem costurada de alta resolução.
NOTA: A captura de imagens em série 9 ou 25 pode ser realizada por configuração manual ou automática para focar as células.
7. Processamento organoide para histologia: o método de rotação de agarose
NOTA: Este protocolo é adaptado de uma publicação anterior de Vlachogiannis et al.7. Adicionamos um passo envolvendo a incorporação de agaroses para incorporar com sucesso todas as populações de organoides.
- Remova a mídia existente do poço. Tenha cuidado para não aspirar as cúpulas da membrana do porão.
- Adicione um volume igual (igual ao volume de mídia removido da etapa 1) de solução de recuperação celular e incubar por 60 min a 4 °C.
- Desalojar a cúpula da membrana do porão usando uma pipeta e esmague a cúpula da membrana do porão usando uma ponta de pipet. Colete a solução de cúpula dissociada e recuperação celular em um tubo de 1,5 mL.
- Centrífuga a 300 x g e 4 °C por 5 min.
- Remova o supernatant (solução de recuperação celular). Salve todos os supernatantes em tubos separados até o final, quando a presença de organoides for confirmada na etapa final de peloção.
- Adicione o volume desejado (Tabela 3) de PBS frio e delicadamente pipette para cima e para baixo para perturbar mecanicamente a pelota.
- Centrífuga a 300 x g e 4 °C por 5 min.
- Remova o supernatant (PBS).
- Fixe a pelota em um volume combinado (por exemplo, 500 μL para uma pelota da condição de cultura da placa de poço 24, Tabela 3) de 4% PFA por 60 min em temperatura ambiente.
- Após a fixação, centrífuga sem 300 x g e 4 °C por 5 min.
- Retire o supernatant (PFA).
- Lave com volume combinado (por exemplo, 500 μL para uma pelota da condição de cultura da placa de 24 poços, Tabela 3) de PBS e centrífuga em 300 x g e 4 °C por 5 min.
- Prepare a garose quente (2% agarose na PBS).
NOTA: Aqui, as pelotas de células para seções congeladas podem ser diretamente resuspensas em 200 μL de composto OCT sem mais passos no Protocolo 7. - Resuspender a pelota de célula em 200 μL de agarose (2% na PBS).
- Imediatamente após a adição de agarose, retire delicadamente a pelota celular da parede do tubo de 1,5 mL usando a agulha de 25 G presa à seringa de 1 mL. Como mostrado na Figura 3,se a pelota celular não estiver fisicamente separada da parede do tubo de 1,5 mL, então há o risco de perder toda ou parte da pelota celular durante o processo de incorporação de agarose.
- Espere até que a agarose de 2% na PBS seja completamente solidificada.
- Desadere o bloco de agarose solidificado do tubo de 1,5 mL usando uma agulha de 25 G presa à seringa de 1 mL.
- Transfira o bloco de agarose separado contendo a pelota celular para um novo tubo de 1,5 mL.
- Encha o tubo com 70% de EtOH e prossiga ainda mais usando o protocolo convencional para desidratação tecidual e incorporação de parafina.
8. Histologia e citoquímica imunofluorescente (IFC) de organoides
- Selecione os slides para histologia ou IFC.
- Antes de início do processo de coloração, descubra onde as células estão localizadas no slide e desenhe um círculo ao redor das células do slide usando um marcador.
- Desenhe o perímetro ao redor da borda ou pensionista do slide e onde os círculos estão localizados no slide em um notebook de laboratório para registrar suas localizações.
- Realizar a coloração desejada.
NOTA: Durante este processo, círculos marcados desaparecem, uma vez que o fabricante regular não é resistente aos produtos químicos. Mesmo alguns marcadores permanentes de histologia podem ser apagados durante o processo de coloração. - Após o processo de coloração, coloque o slide sobre o desenho no notebook de laboratório para encontrar os locais das células no slide.
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Representative Results
Os organoides 3D foram criados com sucesso a partir de um modelo de xenoenxerto derivado do paciente (PcD) de câncer de próstata metastático ósseo (BMPC), bem como diretamente do tecido do câncer de próstata metastático do paciente(Figura 4). Resumidamente, nossos modelos PDX de BMPC foram estabelecidos por injeção intra-femoral (IF) de células tumorais em rag2 masculino-/- c-/- camundongos e, em seguida, tumores PDX foram colhidos e processados como descrito neste manuscrito. Como mostrado na Figura 4,os tecidos tumorais PDX da série PCSD resultaram em organoides 3D com fenótipos diferenciais que se manifestavam como cistos, esferoides e organoides de maior complexidade que se formaram utilizando esse protocolo.
Uma imagem costurada de 25 imagens de ampliação de alta resolução de 10x mostrou uma cúpula inteira de membrana do porão e organoides(Figura 5). Usando software de análise de imagem, é opção de classificar as células ou aglomerados de células maiores que um determinado tamanho ou selecionar manualmente esferoides ou cistos.
As etapas para a incorporação das culturas organoides e dicas para rotular a localização de organoides seccionados no slide aumentam o sucesso de realizar IFC nos organoides especialmente quando as amostras de organoides têm uma densidade celular menor do que o desejado. A Figura 6 mostra um exemplo de IFC em uma seção de parafina de 5 μm de espessura de organoides visando citoqueratina 5 (CK5, marcador de células epiteliais basais), citoqueratina 8 (CK8, marcador de células epiteliais luminais) e DAPI.
Figura 1: Estabelecimento e caracterização para organoides cultivados em 3D derivados de tecidos tumorais pacientes ou tecidos tumorais derivados do paciente (PDX). Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 2: Metodologias para formar uma mistura de pelotas celulares e membrana do porão. Uma cúpula anexada (a), uma cúpula flutuante (b) e contas flutuantes (c). Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 3: Um passo fundamental para a incorporação de agarose bem sucedida. Um processo para desprender a pelota celular da parede do tubo de 1,5 mL. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 4: Fenótipos diferenciais de organoides de uma série de tumores PCSD PDX, que inclui células individuais, cistos, esferoides e organoides de maior complexidade. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 5: Exemplo de uma imagem costurada bruta do total de 25 imagens de alta resolução e sua aplicação para uma análise de acompanhamento para contar o número de células ou medir a área de células/aglomerados celulares. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 6: Imagem mostrando organoides PCSD1 manchados de CK5 e CK8 IFC (espessura de 5 μm de seção de parafina). Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
| Componente de estoque | Concentração Final | Vol (mL) necessário para solução de 500 ml |
| HEPES de 1000 mM | 10 mM | 5 |
| Glutamax de 200 mM | 2 mM | 5 |
| 100x Pen-Strep | 1x | 5 |
| adDMEM/F12 +/+/+ | 485 |
Tabela 1: adDMEM/F12 +/+/+ Preparação. Esta tabela foi publicada anteriormente por Drost et al.5.
| Componente de estoque | Concentração Final | Vol (μL) necessário para solução de 50 mL | Vol (μL) necessário para solução de 25 mL |
| 50x B27 | 50x diluído | 1000 | 500 |
| N-Acetilcysteine de 500 mM | 1,25 mM | 125 | 62.5 |
| 0,5 mg/mL EGF | 5 ng/mL | 0.5 | 0.3 |
| 100 ug/mL Noggin | 100 ng/mL | 50 | 25 |
| R-Spondin 1 | Meio condicionado de 10% | 5000 | 2500 |
| 5 mM A83-01 | 500 nM | 5 | 2.5 |
| 0,1 mg/mL FGF10 | 10 ng/mL | 5 | 2.5 |
| 50 μg/mL FGF2 | 5 ng/mL | 5 | 2.5 |
| Prostaglandina E2 de 10 mM | 1 μM | 5 | 2.5 |
| 1M nicotinamida | 10 mM | 500 | 250 |
| 30 mM SB202190 | 10 μM | 16.7 | 8.4 |
| Fbs | 10% | 5000 | 2500 |
| 1 μM DHT | 1 nM | 50 | 25 |
| adDMEM/F12 +/+/+ | Traga até 50 ml | Traga até 25 mL | |
| 100 mM Y-27632 Dicloridor | 10 μM | 5 | 2.5 |
Tabela 2: Componentes para Mídia Humana C/S + 10 % FBS. Esta tabela foi publicada anteriormente por Drost et al.5.
| Placa de Cultura | Densidade de sementes (células) | Volume de membrana do porão (μL) | Médio (μL) |
| 48 bem | 25,000-50,000 | 20 | 250 |
| 24 bem | 50,000-250,000 | 40 | 500 |
| 6 poço | 50,000-250,000 | 40 | 2,000 |
Tabela 3: Densidade de semeade, volume de membrana do porão e volume médio necessário para uma cúpula. Esta tabela é modificada a partir de uma publicação anterior de Drost et al.5.
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Discussion
Organoides 3D derivados da metástase óssea paciente células cancerígenas de próstata ainda são relativamente raras. Aqui, descrevemos estratégias e protocolo otimizado para obter organoides derivados de pacientes 3D (PDOs) de BMPC. Além disso, são descritos protocolos para proteger os organoides em amostras com menor densidade celular para análise ifc e IHC. Fenótipos diferenciais na forma de cisto, esferoides e organoides mais complexos indicam que esse protocolo fornece condições culturais que permitem que populações de células tumorais heterogonosas em pacientes mantenham seu fenótipo celular e estrutura. Assim, as condições culturais aqui descritas, que foram adaptadas a partir de Drost et al.5 modificados com suplementação de soro FBS, tem se mostrado ideal para as culturas das células derivadas do BMPC pacientes, de modo que mantenham sua heterogeneidade intra-sujeita e intersujeita (manuscrito em preparação).
Nosso protocolo otimizado é prático para uma configuração experimental com múltiplos pontos finais de material inicial limitado desde tecidos tumorais primários ou PDX para criar culturas de organoides 3D. Em geral, o estabelecimento de organoides 3D de tecidos tumorais primários pacientes é menos bem sucedido do que o estabelecimento de organoides 3D de tecidos tumorais PDX. Portanto, recomenda-se ter uma densidade de sementes maior (até quatro vezes maior) das células para o estabelecimento de organoides 3D a partir de tecidos tumorais primários pacientes do que de tumores PDX). Um método para aumentar o rendimento celular durante o processamento do tecido tumoral é recuperar qualquer sobra de tecido tumoral na parte superior de 70 μm de filtro celular, passando a suspensão celular filtrada através do filtro novamente.
Três métodos diferentes para formar uma cultura organoide 3D(Figura 2) podem ser usados e facilmente adaptados dependendo da análise do ponto final de acompanhamento. Por exemplo, se alguém deseja ter as imagens costuradas após a criação de organoides 3D, uma cúpula anexada é altamente recomendada, uma vez que o processo de costura de imagem requer um movimento serial de objetivo microscópico para adquirir o número desejado de imagens (9 ou 25). Este processo resulta em uma vibração sutil para o suporte da placa de cultura celular. Ambos os tipos da cúpula flutuante se moverão livremente devido à vibração ao adquirir a imagem. Além disso, ambos os tipos de cúpulas flutuantes podem ser facilmente transferidos de um poço para o outro, tornando-as adequadas para a cocultura com células aderentes após a criação de culturas organoides 3D e as células adeptos nos poços separados. A cúpula anexada e a cúpula flutuante liberadas de serem anexadas têm sido mostradas para reter organoides por até 10 semanas. Curiosamente, uma cúpula flutuante do método de contas flutuantes tem sido mostrada para reter organoides por até 4 meses. O método de contas flutuantes para produzir esferas de membrana de porão introduzidas em nosso protocolo envolve mais passos e habilidades, mas pode ser considerado para uma cultura de longo prazo. Paralelamente, apesar de seu uso para estabelecimento de organoides 3D de diferentes tumores e metástase, o papel do método de doming e a forma da membrana do porão na formação organoides não foram profundamente determinados. Nesse sentido, o método de filme parafina pode ser considerado para uso quando os outros dois métodos não tiveram sucesso.
Para todos os três métodos diferentes, este protocolo recomenda o uso de um menor volume de mídia e um maior volume de membrana de porão para o processo de resuspensão porque as cúpulas durarão mais tempo na cultura. Uma cúpula é formada com uma proporção de 1:4 de mídia e membrana do porão. Note-se que este método aumenta a formação de bolhas enquanto encane a suspensão celular para cima e para baixo, uma vez que o volume adicional de mídia não contorna a viscosidade da membrana do porão. Portanto, recomenda-se configurar tubos de 1,5 mL de tal forma que haja uma pelota de celular por cada cúpula em vez de ter uma pelota de celular para várias cúpulas em um tubo de 1,5 mL. Ao fazê-lo, a formação de bolhas em um tubo para uma cúpula não afetará seriamente outras cúpulas. Se a duração da condição cultural foi previamente otimizada e é conhecida por ser curta (até um mês), a membrana do porão pode ser diluída mais para contornar a questão da viscosidade da membrana do porão. Uma resuspensão de pelotas de célulapara vários poços pode ser preparada em um tubo, utilizando um maior volume de mídia para o volume desejado de membrana do porão para minimizar a perda celular e a variabilidade.
Para minimizar a formação de bolhas durante o processo de pipetagem, a pipetette um volume menor do que o volume real das células, mídia e mistura de membrana do porão. Por exemplo, para uma cúpula dentro de 24 placas de poço, 40 μL de membrana do porão e até 10 μL de mídia completa adDMEM são misturados com a pelota celular. Neste caso, a pipeta pode ser definida para lidar com um volume de 40 μL em vez de 50 μL enquanto pipetting para cima e para baixo, a fim de minimizar a formação de bolhas. Para este segundo método, a resuspensão da pelota celular para vários poços pode ser preparada em um tubo para minimizar a perda celular e a variabilidade. O status líquido da membrana do porão comercialmente disponível é muitas vezes variável. Portanto, novos lotes de membrana do porão precisam ser testados para o processo de doming. Se a membrana do porão for mais viscosa do que o normal, então até 10 μL adicionais de mídia completa adDMEM (detalhes escritos no passo 1) podem ser adicionados para diluir a mistura de pelotacelular e membrana do porão.
Aqui, apresentamos um protocolo para estabelecer, imagem e processo cultivado organoide 3D com dicas detalhadas para a conclusão bem sucedida dos procedimentos desejados. A mídia cultural para organoides 3D introduzidos em nosso manuscrito é especificamente para células derivadas da próstata. No entanto, outros detalhes descritos em nosso protocolo são aplicáveis a diferentes tipos de tecidos tumorais e locais metastáticos.
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Disclosures
Sanghee Lee e Christina A.M. Jamieson são os editores convidados da JoVE Methods Collection.
Acknowledgments
Este estudo contou com o apoio da Fundação de Caridade Leo e Anne Albert e da Fundação JM. Agradecemos aos membros do Centro de Câncer da Universidade da Califórnia de San Diego Moores, Dr. Jing Yang e Dr. Kay T. Yeung por nos permitirem o uso de seu microtome e Randall French, Departamento de Cirurgia para perícia técnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Pipettman | Gilson | F123602 | |
| 1 mL Syringe | BD Syringe | 329654 | |
| 1.5 mL tube | Spectrum Lab Products | 941-11326-ATP083 | |
| 25G Needle | BD PrecisionGlide Needle | 305122 | |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | Alfa Aesar | J61899 | |
| 70% Ethanol (EtOH) | VWR | BDH1164-4LP | |
| A83-01 | Tocris Bioscience | 2939 | |
| Accumax | Innovative Cell Technologies, Inc. | AM105 | |
| adDMEM | Life Technologies | 12634010 | |
| Agarose | Lonza | 50000 | |
| Antibody -for Cytokeratin 5 | Biolegend | 905901 | |
| Antibody for Cytokeratin 8 | Biolegend | 904801 | |
| B27 | Life Technologies | 17504044 | |
| Bioluminescence imaging system, IVIS 200 | Perkin Elmer Inc | IVIS 200 | |
| Cell Culture Plate - 24 well | Costar | 3524 | |
| Cell Culture Plate - 48 well | Costar | 3548 | |
| Cell Culture Plate - 6 well | Costar | 3516 | |
| Cell Dissociation Solution, Accumax | Innovative Cell Technologies, Inc. | AM105 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Cell Scraper | Sarstedt | 83.180 | |
| Cell Strainer | Falcon (Corning) | 352350 | |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | 3546 | |
| DAPI | Vector Vectashield | H-1200 | |
| DHT | Sigma-Aldrich | D-073-1ML | |
| dPBS | Corning/Cellgro | 21-031-CV | |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| FBS | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| FGF10 | PeproTech | 100-26 | |
| FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
| Forceps | Denville Scientific | S728696 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-0420401 | |
| Magnetic Column Seperator: QuadroMACS Separator | Miltenyi | 130-090-976 | |
| Marker | VWR | 52877-355 | |
| Matrigel (Growth Factor Reduced) | Mediatech Inc. (Corning) | 356231 | |
| Matrigel (High Concentration) | BD (Fisher Scientific) | CB354248 | |
| Microscope Imaging Software, Keyence | BZ-X800 (newest software) BZ-X700 (old software) | ||
| Microscope, Keyence | BZ-X700 (model 2016-2017)/BZ-X710 (model 2018-2019) | ||
| Mouse Cell Depletion Kit | Miltenyi | 130-104-694 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-100G | |
| Noggin | PeproTech | 120-10C | |
| OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Parafilm | American National Can | N/A | |
| Pen-Strep | Mediatech Inc. (Corning) | 30-002-CI-1 | |
| Pipette tipes for 1 mL (Blue Tips) | Fisherbrand Redi-Tip | 21-197-85 | |
| Plunger (from 3 mL syringe) | BD Syringe | 309657 | |
| Prostaglandin E2 | Tocris Bioscience | 2296 | |
| R-Spondin 1 | Trevigen | 3710-001-01 | |
| SB2021190 | Sigma-Aldrich | S7076-25MG | |
| Small Table Top Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002426 | |
| Water Bath | Fisher Sci | 2320 | |
| Y-27632 Dihydrochloride | Abmole Bioscience | M1817 |
References
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