रोगी प्रोस्टेट कैंसर बोन मेटास्टेसिस नमूनों और उनके ज़ेनोग्राफ्ट से प्राप्त त्रि-आयामी (3 डी) ऑर्गेनॉइड की स्थापना और विश्लेषण
Summary
रोगी बीएमपीसी नमूनों और हड्डी मेटास्टैटिक प्रोस्टेट कैंसर के विद्वेष की त्रि-आयामी संस्कृतियां उनके मूल ट्यूमर की कार्यात्मक विषमता को बनाए रखती हैं जिसके परिणामस्वरूप अल्सर, स्फेरॉइड और जटिल, ट्यूमर जैसे ऑर्गेनॉइड होते हैं। यह पांडुलिपि विषम रोगी व्युत्पन्न नमूनों की 3 डी संस्कृति और आईएफसी का उपयोग करके उनके विश्लेषण के लिए एक अनुकूलन रणनीति और प्रोटोकॉल प्रदान करती है।
Abstract
मानव रोगियों के ट्यूमर नमूनों से ऑर्गेनॉइड की त्रि-आयामी (3 डी) संस्कृति और प्रोस्टेट कैंसर के रोगी-व्युत्पन्न विद्वेष (पीडीएक्स) मॉडल, जिसे रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड (पीडीओ) के रूप में जाना जाता है, के तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक अमूल्य संसाधन हैं ट्यूमरजीनिस और प्रोस्टेट कैंसर का मेटास्तासिस। उनका मुख्य लाभ यह है कि वे पारंपरिक कोशिका रेखाओं की तुलना में मूल ऊतक की विशिष्ट जीनोमिक और कार्यात्मक विषमता को बनाए रखते हैं जो नहीं करते हैं। इसके अलावा, PDO की 3 डी संस्कृतियों का उपयोग व्यक्तिगत रोगियों पर दवा उपचार के प्रभावों की भविष्यवाणी करने के लिए किया जा सकता है और व्यक्तिगत चिकित्सा की दिशा में एक कदम है। इन फायदों के बावजूद, कुछ समूह नियमित रूप से इस विधि का उपयोग करते हैं क्योंकि विभिन्न रोगी नमूनों के लिए आवश्यक हो सकता है कि PDO संस्कृति की स्थिति के व्यापक अनुकूलन के कारण। हमने पहले दिखाया था कि हमारे प्रोस्टेट कैंसर की हड्डी मेटाटैसिस पीडीएक्स मॉडल, PCSD1, एंटी-एंड्रोजन थेरेपी के लिए दाता रोगी के अस्थि मेटाटैसिस के प्रतिरोध को फिर से तैयार किया गया है। हमने एंटी-एंड्रोजन प्रतिरोध के तंत्र को और अधिक चित्रित करने के लिए PCSD1 3D ऑर्गेनॉइड का उपयोग किया। पीडीएक्स और पीडीओ मॉडल के वर्तमान में प्रकाशित अध्ययनों के अवलोकन के बाद, हम अनुकूलित संस्कृति स्थितियों में गुंबददार या फ्लोटिंग बेसमेंट झिल्ली (जैसे, मातृगेल) क्षेत्रों का उपयोग करके पीडीओ की 3डी संस्कृति के लिए कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। वीवो सिलाई इमेजिंग और हिस्टिलोजी के लिए सेल प्रोसेसिंग में भी वर्णित है। इस प्रोटोकॉल को पश्चिमी दाग, सह-संस्कृति आदि सहित अन्य अनुप्रयोगों के लिए और अनुकूलित किया जा सकता है और इसका उपयोग दवा प्रतिरोध, ट्यूमरजेनेसिस, मेटास्टैसिस और चिकित्सीय से संबंधित 3डी सुसंस्कृत डीडीओ की विशेषताओं का पता लगाने के लिए किया जा सकता है।
Introduction
त्रि-आयामी सुसंस्कृत ऑर्गेनॉइड ने वीवो आर्किटेक्चर, सेलुलर कार्यक्षमता और उनके मूल ऊतकों के आनुवंशिक हस्ताक्षर1,2,3,4,5के आनुवंशिक हस्ताक्षर में अपनी क्षमता के लिए ध्यान आकर्षित किया है। सबसे महत्वपूर्ण बात, रोगी ट्यूमर ऊतकों या रोगी व्युत्पन्न विद्वेष (पीडीएक्स) मॉडल से स्थापित 3 डी ऑर्गेनॉइड ट्यूमरजनी पर सेलुलर सिग्नलिंग के तंत्र को समझने औरप्रत्येक कोशिका जनसंख्या6,7,8,9,10,12,13पर दवा उपचार के प्रभाव ों को निर्धारित करने के लिए अमूल्य अवसर प्रदान करते हैं। ड्रोस्ट एट अल5 ने मानव और माउस प्रोस्टेट ऑर्गेनॉइड की स्थापना के लिए एक मानक प्रोटोकॉल विकसित किया, जिसे यूरोलॉजी के क्षेत्र में व्यापक रूप से अपनाया गया है। इसके अलावा, 3डी ऑर्गेनॉइड के आगे लक्षण वर्णन और ट्यूमरिजन और मेटाटैसिस4,12,14,15के विस्तृत तंत्र को समझने के लिए महत्वपूर्ण प्रयास समर्पित किए गए हैं। 3डी ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों के लिए पहले से स्थापित और व्यापक रूप से स्वीकार्य प्रोटोकॉल के अलावा, हम यहां अनुकूलित संस्कृति स्थितियों में तीन अलग-अलग डोमिंग विधियों का उपयोग करके PDO की 3D संस्कृति के लिए एक कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।
इस पांडुलिपि में, 3 डी ऑर्गेनॉइड को बोन मेटास्टैटिक प्रोस्टेट कैंसर (बीएमपीसी) के एक पूर्व वीवो मॉडल के रूप में स्थापित किया गया था। इन संस्कृतियों के लिए उपयोग की जाने वाली कोशिकाएं प्रोस्टेट कैंसर सैन डिएगो (पीसीएसडी) श्रृंखला से आई थीं और रोगी प्रोस्टेट कैंसर बोन मेटास्टैटिक ट्यूमर ऊतकों (PCSD18 और PCSD22) या रोगी व्युत्पन्न विद्वेष (पीडीएक्स) ट्यूमर मॉडल (PCSD1, PCSD13, और PCSD17 नाम के नमूने) से सीधे प्राप्त की गई थीं। क्योंकि प्रोस्टेट कैंसर की कोशिकाओं के सहज अस्थि मेटाटैसिस आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल16में दुर्लभ है, हम पुरुष Rag2 में मानव ट्यूमर कोशिकाओं के प्रत्यक्ष अंतर-femoral (IF) इंजेक्शन का इस्तेमालकिया-//-चूहोंहड्डी मेटास्टैटिक प्रोस्टेट कैंसर17के PDX मॉडल स्थापित करने के लिए ।
एक बार विषम रोगी ट्यूमर कोशिकाओं या रोगी व्युत्पन्न विद्वेष से 3 डी ऑर्गेनॉइड स्थापित किए जाने के बाद, प्रोस्टेट ट्यूमर कोशिकाओं के रूप में उनकी पहचान की पुष्टि करना और 3डी ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों में उनके फेनोटाइप को निर्धारित करना आवश्यक है। इम्यूनोफ्लोरेसेंस केमिस्ट्री (आईएफसी) प्रत्येक कोशिका में सीटू में प्रोटीन अभिव्यक्ति के दृश्य की अनुमति देता है, जो अक्सर विशिष्ट सेल आबादी2,4के लिए संभावित कार्यों का संकेत देता है। सामान्य तौर पर, ऊतकों और कोशिकाओं सहित अधिकांश नमूनों के लिए आईएफसी प्रोटोकॉल सरल और पूरी तरह से अनुकूलित हैं। हालांकि, सेल घनत्व और ऑर्गेनॉइड की संख्या पारंपरिक संस्कृति की तुलना में काफी कम हो सकती है। इसलिए, ऑर्गेनॉइड के लिए आईएफसी प्रोटोकॉल के लिए नमूनों में सभी ऑर्गेनॉइड के लिए पैराफिन में उचित प्रसंस्करण और एम्बेडिंग सुनिश्चित करने के लिए अतिरिक्त कदम ों की आवश्यकता होती है। हम एक अगारोज प्री-एम्बेडिंग प्रक्रिया और स्लाइड पर अनुभागित ऑर्गेनॉइड के स्थान को लेबल करने के लिए सुझावों का वर्णन करते हैं जो ऑर्गेनॉइड पर आईएफसी की सफलता दर को बढ़ाता है, खासकर जब ऑर्गेनॉइड के नमूनों में वांछित की तुलना में कम सेल घनत्व होता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
रोगी हड्डी मेटाटैसिस प्रोस्टेट कैंसर कोशिकाओं से प्राप्त 3 डी ऑर्गेनॉइड अभी भी अपेक्षाकृत दुर्लभ हैं। यहां, हम बीएमपीसी के सफलतापूर्वक स्थापित धारावाहिक 3डी रोगी व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड (पीडीओ) के लिए ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन को लियो और ऐनी अल्बर्ट चैरिटेबल फाउंडेशन और जेएम फाउंडेशन ने समर्थन दिया था। हम कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय सैन डिएगो मूर्स कैंसर सेंटर के सदस्यों, डॉ जिंग यांग और डॉ Kay टी येंग हमें उनके माइक्रोटोम और रांदल फ्रेंच, तकनीकी विशेषज्ञता के लिए सर्जरी विभाग के उपयोग की अनुमति के लिए शुक्रिया अदा करते हैं ।
Materials
| 1 mL Pipettman | Gilson | F123602 | |
| 1 mL Syringe | BD Syringe | 329654 | |
| 1.5 mL tube | Spectrum Lab Products | 941-11326-ATP083 | |
| 25G Needle | BD PrecisionGlide Needle | 305122 | |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | Alfa Aesar | J61899 | |
| 70% Ethanol (EtOH) | VWR | BDH1164-4LP | |
| A83-01 | Tocris Bioscience | 2939 | |
| Accumax | Innovative Cell Technologies, Inc. | AM105 | |
| adDMEM | Life Technologies | 12634010 | |
| Agarose | Lonza | 50000 | |
| Antibody -for Cytokeratin 5 | Biolegend | 905901 | |
| Antibody for Cytokeratin 8 | Biolegend | 904801 | |
| B27 | Life Technologies | 17504044 | |
| Bioluminescence imaging system, IVIS 200 | Perkin Elmer Inc | IVIS 200 | |
| Cell Culture Plate – 24 well | Costar | 3524 | |
| Cell Culture Plate – 48 well | Costar | 3548 | |
| Cell Culture Plate – 6 well | Costar | 3516 | |
| Cell Dissociation Solution, Accumax | Innovative Cell Technologies, Inc. | AM105 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Cell Scraper | Sarstedt | 83.180 | |
| Cell Strainer | Falcon (Corning) | 352350 | |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | 3546 | |
| DAPI | Vector Vectashield | H-1200 | |
| DHT | Sigma-Aldrich | D-073-1ML | |
| dPBS | Corning/Cellgro | 21-031-CV | |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| FBS | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| FGF10 | PeproTech | 100-26 | |
| FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
| Forceps | Denville Scientific | S728696 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-0420401 | |
| Magnetic Column Seperator: QuadroMACS Separator | Miltenyi | 130-090-976 | |
| Marker | VWR | 52877-355 | |
| Matrigel (Growth Factor Reduced) | Mediatech Inc. (Corning) | 356231 | |
| Matrigel (High Concentration) | BD (Fisher Scientific) | CB354248 | |
| Microscope Imaging Software, Keyence | BZ-X800 (newest software) BZ-X700 (old software) | ||
| Microscope, Keyence | BZ-X700 (model 2016-2017)/BZ-X710 (model 2018-2019) | ||
| Mouse Cell Depletion Kit | Miltenyi | 130-104-694 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-100G | |
| Noggin | PeproTech | 120-10C | |
| OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Parafilm | American National Can | N/A | |
| Pen-Strep | Mediatech Inc. (Corning) | 30-002-CI-1 | |
| Pipette tipes for 1 mL (Blue Tips) | Fisherbrand Redi-Tip | 21-197-85 | |
| Plunger (from 3 mL syringe) | BD Syringe | 309657 | |
| Prostaglandin E2 | Tocris Bioscience | 2296 | |
| R-Spondin 1 | Trevigen | 3710-001-01 | |
| SB2021190 | Sigma-Aldrich | S7076-25MG | |
| Small Table Top Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002426 | |
| Water Bath | Fisher Sci | 2320 | |
| Y-27632 Dihydrochloride | Abmole Bioscience | M1817 |
References
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