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Biology

총 내부 반사 형광 현미경 검사법에 의해 살아있는 세포에 있는 세포 표면 수용체의 올리고머화 역학 은 수 및 밝기 분석과 결합됩니다

Published: November 6, 2019 doi: 10.3791/60398
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 1,2
1Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC), Madrid, Spain, 2Centro di Imaging Sperimentale, Ospedale San Raffaele, Milan, Italy, 3Unit of Gynecological Oncology Research, European Institute of Oncology IRCCS, Milan, Italy

Summary

우리는 살아있는 세포의 혈장 막에서 리간드 결합에 의해 유도된 mEGFP 태그-수용체 올리고머의 평균 올리고머 상태의 측정을 위한 이미징 접근법을 기술한다. 이 프로토콜은 총 내부 반사 형광(TIRF) 현미경 검사법과 숫자 및 밝기(N&B) 분석을 기반으로 합니다.

Abstract

수용체 올리고머화의 중요성과 보편성에도 불구하고, 클러스터링 이벤트를 검출하고 군집의 정도를 측정하는 몇 가지 방법이 적용 가능하다. 여기에서, 우리는 살아있는 세포의 막에 있는 mEGFP 꼬리표 수용체 동종 복합체의 평균 올리고메릭 상태를 결정하기 위하여 화상 진찰 접근을 기술합니다. 이 프로토콜은 총 내부 반사 형광(TIRF) 현미경 검사법과 숫자 및 밝기(N&B) 분석을 기반으로 합니다. N&B는 형광 상관분광법(FCS) 및 광자 계수 히스토그램(PCH)과 유사한 방법으로, 형광의 형광 강도의 변동에 대한 통계적 분석을 기반으로 조명 안팎으로 확산되는 형광 의 강도에 대한 통계적 분석을 기반으로 합니다. 관찰 시간 동안 볼륨을 볼 수 있습니다. 특히, N&B는 올리고머 혼합물에서 평균 단백질 수에 대한 정보를 얻기 위해 PCH를 단순화한다. 강도 변동 진폭은 불소의 분자 밝기와 조명 부피 내의 평균 형광부 수에 의해 설명됩니다. 따라서 N&B는 진폭 분포의 첫 번째 및 두 번째 모멘트, 즉 평균 강도와 분산만 고려합니다. 이것은, 동시에, 방법의 강도와 약점이다. 두 순간만 고려되기 때문에 N&B는 혼합물에서 알 수 없는 올리고머의 어금니 분율을 확인할 수 없지만 혼합물의 평균 올리고머화 상태만 추정합니다. 그럼에도 불구하고, 단순히 형광 강도의 시간 변동을 모니터링함으로써, 픽셀 단위로 라이브 셀의 이미지의 상대적으로 작은 시간계 (다른 모멘트 방법에 비해)에 적용 될 수있다. 픽셀당 유효 시간을 몇 마이크로초로 줄여 초 단위로 수집할 수 있으므로 빠른 올리고머화 역학에 필요합니다. 마지막으로, 넓은 세포 지역 뿐만 아니라 하위 세포 구획을 탐구할 수 있습니다.

Introduction

우리는 살아있는 세포의 혈장 막에 수용체 분자의 평균 올리고메상태를 결정하기 위한 총 내부 반사 형광 수 및 밝기(TIRF-N&B) 이미징 접근법을 설명하며, 수용체 어셈블리를 연결하는 것을 목표로 합니다. 단백질의 생물학적 기능에 역학(그림 1).

세포외 리간드 결합시, 수용체는 그들의 형태, 올리고머화, 잠재적인 공동 수용체 및 막 조성에 따라 세포내 신호 변환을 개시한다. 수용체 올리고머화의 중요성과 보편성에도 불구하고, 세포 신호의 주요 사건으로 인식1,2,3,4,5,6, 7,몇 가지 방법은 클러스터링 이벤트를 감지하고 실험적으로 클러스터링의 정도를 측정 할 수 있습니다8,9. 공초점 부피(x,y, y , 300 nm, z □900 nm)는 이미지 복원알고리즘(10)에의해 최적화된 후에도 분자 상호작용 및 점양내측정을 입증하기 위해 충분히 해결된다. 단백질 올리고머의 하위 단위 조성은 손바닥11,STORM12및 STED13과같은 20-70 nm의 초고해상도 방법에서도 순수한 공간적 기준으로 해결할 수 없다. 또한 시간해상도(이미지당 분 순)는 초 범위에서 역학을 따를 수 없습니다. 단 하나 분자 단계 표백은 단백질 올리고머의 stoichiometry를 움직이지 않는 경우에만 해결합니다 14.

단일 이미지 내에서 형광 태그가 지정된 단백질의 밀도와 올리고머화를 측정하는 가장 다양한 방법 중 하나는 공간 샘플링에 의존하는 공간 강도 분포 분석(SpIDA)입니다. 화학적으로 고정된 세포와 살아있는 세포 모두에 적용가능하며, 표준 형광 현미경검사법 15를사용하여 세포의 관심 있는 여러 영역의 분석을 동시에 허용한다. 또는 형광 상관 분광법(FCS)16,광자 계수 히스토그램(PCH)17및 수 및 밝기(N&B)18,19,양적 올리고머에 적합한 모멘트 방법 측정. 이러한 방법은 형광이 조명 부피안팎으로 확산될 때 관찰할 수 있는 형광 강도 변동을 분석합니다. 강도 변동의 진폭은 조명부피 17(도 2)내에서 형광포(θ)의 분자 밝기 및 평균 형광포(n)에 의해 고유하게 설명될 수 있다. 전형적으로, 불소의 확산 계수 및 조명 부피 내의 평균 분자 수(G(0) 값과 반비례)는 FCS20에의해 수득될 수 있다. 그러나, 확산 시간은 질량의 입방 루트로만 스케일링되기 때문에, FCS는 분자질량(21)의변화를 검출하기에 충분히 민감하지 않다. 실제로, 단색 FCS는 막 수용체의 이각을 검출할 수 없습니다. PCH는 다른 올리고머의 혼합물을 정확하게 해결합니다. 진폭 분포의 두 개 이상의 순간을 사용하여 동일한 조명 볼륨을 차지하는 서로 다른 밝기의 분자를 감지합니다. 스캐닝 FCS22 및 분자 밝기(pCOMB) 접근법(23)의 흥미로운 쌍 상관관계접근법(23)과같은 개발, 생물학적 시스템에서 형광 상관 방법의 적용 범위를 확장하기 위해도입된 24 , 셀의 넓은 영역에서 빠른 측정 기능이 부족한 단일 지점 방법을 유지하므로 각 픽셀에서 많은 연속 관찰이 필요하고 몇 초 안에 데이터 수집이 필요합니다.

N&B는 형광 분포의 진폭의 첫 번째 및 두 번째 모멘트, 즉 평균 강도, , 및 분산,σ2 (그림 2)18,19를 고려하는 PCH의 단순화된 버전입니다. 그리고, 그 때문에, 혼합물에서 알 수없는 올리고머의 어금니 분율을 결정할 수 없지만 혼합물의 평균 올리고머화 상태를 추정할 뿐입니다. 그럼에도 불구하고 N&B는 형광 강도의 시간 변동을 모니터링하기만 하면 PCH보다 상대적으로 작은 라이브 셀 이미지로 작업할 수 있는 장점이 있습니다. N&B는 픽셀당 시간을 몇 마이크로초로 줄여주므로 넓은 세포 영역에 걸쳐 빠른 올리고머화 역학을 따를 수 있으므로 래스터 스캐닝 현미경 검사법(예: 공초점, 2광자) 및 밀리초에서 시간 배율로 이미지를 수집할 수 있습니다. 카메라 기반 현미경 검사법(예: TIRFM)에서

몇몇 보고는 확장한 세포 지구를 화상 진찰에 의하여 단백질 클러스터에 있는 소단위의 수를 정량화하는 N&B의 기능을 설명했습니다. Paxillin-EGFP 클러스터는 CHO-K1세포(25)의접착 부위에서 검출되었고, 병원성 Httex1p 펩티드의 세포내 응집은 COS-7 세포26에서기재되었다. N&B는 ErbB수용체(27)의리간드 구동 올리고머화, 및헬라세포(28)에서KLB(KLB) 및 FGFR1c상에서의 리간드 FGF21의 효과를 따르기 위해 적용되었다. TIRF 이미징과 N&B 분석의 조합은 다이너민-2가 전체세포막(29)에걸쳐 주로 테트라메어임을 보여주기 위해 사용되었다. 우리는 uPAR 및 FGFR1 세포막 수용체30,31의리간드 구동 이각을 증명하기 위해 래스터 스캐닝 및 TIRF 이미지 모두에 N&B를 적용했습니다.

N&B, FCS 및 PCH와 같은 형광 상관 방법은 개방 부피에서 파티클의 점령 수가 푸아송 분포를 따른다는 개념을 기반으로 합니다. 형광단이 방출하는 광자만 검출할 수 있기 때문에, 측정된 형광 강도에 대한 평균 값은 이미지의 픽셀에서 시간 대, 조명 부피, n 및 이들의 평균 형광피의 수의 산물이다. 분자 밝기, θ17:

여기서 θ는 분자가 조명 부피의 중심에 있을 때 분자당 시간 단위(종래로 초당 초당)로 방출되는 광자의 수로 표현된다.

밝기는 주어진 획득 설정에서 각 형광포의 속성이며 강도는 모든 형광단의 모든 기여도의 합계입니다. 생물학적 경연 대회에서, 밝기는 함께 변동하는 형광단의 수의 증가와 함께 증가하여 형광 태그가 지정된 단백질의 올리고머화 상태에 대한 정보를 제공합니다. 주어진 픽셀에서의 변동 진폭은 형광 신호의 분산으로부터 측정되며,σ2:

여기서 강도의 제곱 및 강도 평균의 제곱은 각 프레임의 각 픽셀의 개별 강도 값에서 계산됩니다.

여기서 K는 타임계의 총 프레임 수입니다. 실험적으로, 전체 이미지 계열에 대해 평균 강도 값을 중심으로 단일 이미지의 각 픽셀에서 개별 강도 값의 분산을 설명하는 분산을 계산할 필요가 있다. 분산에는 서로 다른 기원의 모든 변동이 포함됩니다. 제1 근사치에서, 배루 볼륨에서 확산 입자로 인한 분산,σ20,검출기 샷 노이즈,σ2d에의한 분산으로부터 분리될 수 있다. 두 분산은 독립적입니다. 따라서 총 분산은 합계로 지정됩니다.

검출 량안팎의 분자 변동으로 인한 차이는 분자 밝기 및 강도에 선형적으로 의존합니다.

eq. 1에 따라 eq. 6 재배치:

형광 상관 분광법의 일반적인 개념에 따르면, 방정식 7은 변동수에 의한 차이가 입자 밝기의 제곱에 따라 달라지도록 합니다.

그런 다음 검출기 변동에 의한 분산은 검출된 강도의 선형 함수이며, 검출기가 포화 한계19이하로 작동한다는 가정 하에 :

광자 계수 검출기의 경우 =1및 c=0이므로 검출기 분산은 평균 강도와 같습니다.

라이브 셀의 실제 측정에 이러한 개념을 적용하기 위해 Gratton 및동료(18)는 각 픽셀에 대해 평균 강도에 대한 분산의 비율로 명백한 밝기 B를 정의합니다.

B는 실험적으로 측정되는 파라미터입니다. 이 작품에서, HeLa 세포의 혈장 막에 있는 FGFR1 수용체의 시계열 심상 심자는 TIRF 현미경 검사법에 의해 포착되고 평균 명백한 밝기, B는, N&B 분석에 의해 결정됩니다. 이어서, FGF2를 첨가한 후, 연속적인 타임시리즈는 정준 리간드로 수용체의 자극 후 막 표면에서 수용체 분자의 자가 조립의 변화를 따르도록 포획된다.

그러나 TIRF 현미경의 검출기는 EMCCD 카메라이므로 명백한 밝기에 대한 발현은19로수정해야합니다.

여기서 오프셋은 검출기 설정의 특성인 검출 전자의 강도 오프셋입니다. 아날로그 검출기의 분산 및 평균 강도는 각각 다음을 통해 제공됩니다.

여기서 G는 디지털 레벨(DL/광자)의 아날로그 이득인 경우, S는광자19당디지털 레벨이 일정한 강도(시간적 변동 없음)를 가진 광원에 대한 강도 대 분산 플롯의 경사에 의해 주어집니다. γ 계수는 픽셀 검출 볼륨의 형상과 관련이 있다. Hassleret al. 32에따르면, γ 계수는 검출카메라(19)의최대 이득에서 작동하는 TIRF 이미징에 대해 0.3과 동일하다. 오프셋, S 및 G 매개 변수는 카메라와 현미경의 특성입니다. 명백한 밝기 B는 eq. 12 및 13에 따라 eq. 11을 재배열하여 얻어집니다.

실험적으로, θ는 레이저 강도와 시스템의 검출 효율의 복잡한 기능이다. 그럼에도 불구하고 B/S는 θ에 선형적으로 종속되므로 지정된 감지 모드에 대한 θ의 상대값을 결정하는 것만 중요합니다.

여기서 θ'는 θ에 비례합니다. 그러나 내부 참조를 사용하여 보정이 수행됩니다.

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Protocol

1. 견본 준비

  1. 1일차. 유리 바닥 접시에 100,000-200,000 세포 / mL의 농도에서 완전한 배지에 종자 HeLa 세포. 씨앗 6-8 접시를 복제합니다.
    참고: 이 예에서, 배지는 10% 열 불활성화 된 태아 소 혈청 (FBS), 1 mM 나트륨 피루브, 100 U/ 100 μg 페니실린 / 스트렙토 마이신으로 보충됩니다. 여러 가지 복제 요리가 준비됩니다.
  2. 2-3일차. 세포가 하위 합류에있을 때, 단백질 플라스미드와 요리의 절반을 트랜스 펙하고 두 번째 절반은 세럼이없는 배지에서 참조 플라스미드 (단량체 및 디머)를 사용합니다.
    참고: 형질감염은 페놀 레드없이 항생제, 0.1% 소 혈청 알부민 및 25 mM HEPES 완충액으로 보충된 무혈청 배지로 만들어집니다.
  3. 3-4일차. 형질 감염된 세포가 접시의 바닥에 부착되어 있고 세포막이 형광인지 확인하십시오. 자란 세포나 형광이 매우 낮은 접시를 버리십시오.
    참고: 세포가 자라지 않도록하십시오. 세포는 잘 분포되어야하며 접시의 유리 영역에 부착해야합니다(그림 1A). 사전 코팅 된 유리 바닥 접시는 세포 접착을 선호하는 데 사용할 수 있습니다. 세포 배양은 어떤 실험든지 전에 mycoplasma 오염을 위해 시험됩니다. 이 예에서, 세포는 (A207K) mEGFP-FGFR1 플라스미드로 형질감염되고 기준 세포는 표준 프로토콜을 사용하여 GPI-(A207K) mEGFP 및 GPI-(A207K) mEGFP-(A207K)로 형질감염된다. 라이브 세포 현미경 검사의 경우, 표시기없는 매체가 권장됩니다. 25 mM HEPES 버퍼는 이미징 중에 pH 변화를 방지하기 위해 추가됩니다.

2. TIRF 이미징 — 레이저 라인 정렬 및 TIRF 조명 최적화

  1. 실험 4시간 전에, 37°C에서 현미경의 온도 인큐베이터를 활성화한다.
  2. 현미경, 컴퓨터 및 카메라를 켜고 카메라가 적절한 작동 온도에 도달할 때까지 기다립니다.
    참고: 본 연구에 사용된 카메라의 작동 온도는 -75°C입니다.
  3. 목표에 오일을 약간 떨어뜨립니다. 샘플 접시를 제자리에 놓습니다. 인큐베이터의 문을 닫고 접시의 온도가 평형 (~ 10 분)하자.
  4. 에피소레전램프와 488nm 레이저를 켭니다.
  5. 에피플루오레시콘트 모드를 선택하여 샘플을 탐색하고, 안구에서 초점을 맞출 세포를 검색합니다.
    참고: 형광램프를 사용하여 안구를 수색하는 것은 필수가 아닙니다. 대신 적합한 레이저 라인을 사용할 수 있습니다.
  6. 현미경 카메라(Band Pass Ex 490/20 (500) Band Pass Em 525/50 또는 이와 유사한 현미경 카메라를 통해 녹색 방출을 수집하기 위한 적절한 필터를 선택합니다.
  7. epifluoresccence 모드에서 안구에서 카메라 포트(그림 1의카메라 #1)로 전환하고 초점을 구체화하고 TIRF 모드로 변경합니다. 에피플루오레전및TIRF 모드는 현미경의 브랜드에 따라 다른 명명법의 이름을 지정할 수 있습니다.
    참고: 커버슬립 인터페이스에 형광 마커가 없는 경우 레이저에 초점을 맞추거나 정렬하는 데 문제가 있을 수 있습니다. 레이저를 제대로 정렬하려면(좋은 TIRF에 필수적) 커버슬립에 초점을 맞춥니다. 커버슬립이 초점이 맞춰져 있는지 여부를 확인하는 것은 종종 매우 어렵습니다. 제안으로, 세포의 가장자리에 초점을 맞춥니다.
  8. TIRF 현미경의 지시에 따라 자동 정렬을 활성화합니다.
    참고: 간단히, 2.4에서 2.8까지의 단계에 대해, 먼저 안구를 통해 세포를 찾아 서 그들에 초점을 맞춘 다음, TIRF 현미경의 카메라 포트에 방출을 보내, 현미경 컴퓨터 화면에 세포를 다시 초점을 맞추고 레이저 정렬 절차를 활성화. 정렬은 조명이 전도가 되는 임계 각도를 찾는 것으로구성됩니다(그림 3). 상용 현미경은 약간 다른 정렬 프로토콜을 가질 수 있으며 또한 완전히 자동화 될 수 있습니다. 다른 사람들은 임계 각도 조건의 시각화를 용이하게하기위한 작은 카메라가있을 수 있습니다.
  9. 적합한 조명 깊이를 선택하고 에바네센트 필드의 방향을 최적화합니다(그림3).
    참고: 침투 깊이는 모든 컨트롤 및 샘플에 대해 일정하게 유지됩니다.

3. TIRF 이미징: 타임시리즈 캡처

  1. 256 x 256픽셀 이상의 ROI(관심 영역)를 정의합니다.
    참고: 이 설정에서 캡처는 카메라만 직접 제어하는 소프트웨어에서 카메라 #2 수행됩니다(그림 1 범례 참조).
  2. 노출을 1ms로 설정하고 EM 게인을 1,000으로 설정합니다(eq. 12 및 13의 G 계수입니다). 이러한 속도로, 조정하거나 레이저 전력을 증가시킬 필요가있을 수 있습니다. 여기서 레이저 파워는 0.5 mW입니다.
    참고: 카메라의 종류와 단백질의 확산 계수에 의해 부과되는 한계, 형광 강도 및 배경에 따라 레이저 전력을 설정하는 일반적인 기준은 검출기를 포화시키고, 광표백을 최소화하고, 캡처하는 것이 아닙니다. 가능한 한 빠른 S/N에서 확인할 수 있습니다. EM 게인은 항상 카메라의 최대값으로 설정됩니다(소개 참조).
  3. 초기 조건에서 첫 번째 평가판 시퀀스를 실행하고 S/N 값을 대략적으로 추정합니다. 조건은 첫 번째 시간계열의 첫 번째 프레임에서 측정된 S/N = 2-3 이상에서 허용됩니다.
  4. 카메라 #2 연결하는 방출 분할 시스템의 슬라이더를 사용하여 이미지의 측면을 마스킹합니다(그림1B, 그림 4A-B).
    참고: 이 설정에서 멀티 채널 이미징 커넥터는 동시에 두 개의 공간적으로 동일한 이미지를 수집 할 수 있도록 #2 카메라에 설치됩니다. 이 시스템에는 다양한 배기가스 배출 필터를 장착할 수 있는 슬라이드가 장착되어 있습니다. 슬라이더 중 하나는 이미지의 측면을 커버하기 위해 검은 색 마스크를 마운트합니다. 마스크된 영역은 각 열계의 내부 보정에 사용되어 카메라 파라미터(eq. 12 및 eq. 13)를 결정합니다. 이러한 방식으로 독립적인 교정 단계가 필요하지 않으며, 중요한 것은 각 타임시리즈의 캡처와 병행하여 교정이 수행된다는 것입니다. 이 시스템이 없는 경우, 카메라는 게시된프로토콜(33)을적용하여 보정될 수 있다.
  5. 카메라 파일 자동 저장 옵션을 선택합니다.
  6. 이미지 시리즈의 수집을 시작합니다. 최소 S/N 비율이 2인 700프레임을 획득합니다.
    참고: 분석에 필요한 프레임 수는 광표백에 대한 샘플 안정성과 데이터의 분산에 따라 달라집니다. 따라서 N&B 분석 중에 각 시간계의 품질이 평가됩니다.
  7. 현미경에서 접시를 꺼내지 않고 리간드를 추가하십시오.
  8. 밝은 형광 막이있는 세포를 선택하고 운동 실행의 첫 번째 연재를 신속하게 시작합니다.
    참고: 리간드의 첨가가 신속하게 이루어지면, 이 첫 번째 캡처는 리간드 역학의 포인트 = 0시간을 설정한다. 이 소프트웨어는 캡처의 정확한 시간을 등록합니다.
  9. 두 번째 셀을 검색하고 역학의 두 번째 시간 점을 획득합니다.
    참고: 포인트 방문 루틴은 x, y, z 전동 단계가 장착 된 일부 현미경에서 사용할 수 있습니다. 이들은 세포 접시에 다중 위치의 암기를 허용하고, 다른 세포에 이미지 시리즈 사이 시간의 더 일정한 간격을 유지하는 데 도움이 될 수 있습니다.
  10. 운동 실행의 각 시간 지점에 대한 새 셀을 캡처합니다.
    참고: 캡처 한 후 셀이 부분적으로 포토블리백화되어 다시 이미지화 할 수 없습니다. 그 때문에, 역학은 많은 세포의 타임시리즈를 결합하여 수득되며, 각각 다른 시점에서 포착된다.
  11. 각 새 접시에 대해 2.3단계에서 3.9단계까지 프로토콜을 반복합니다.
    참고: 참고 요리의 경우, 리간드에 사용되는 것과 동등한 차량(PBS+0.01% 소 혈청 알부민을 보충)을 추가합니다.

4. 숫자 및 밝기 (N&B): 타임 시리즈의 품질 확인

  1. 변환 및 로 저장합니다. 카메라 소프트웨어로 획득한 파일을 TIFF(이 예제의 .sif 파일).
  2. 가져오기. N&B 그래픽 사용자 인터페이스(GUI) MATLAB을 활성화하여 분석 소프트웨어 루틴의 TIFF 파일.
    참고: 맞춤형 Matlab 실행 가능한 N&B 루틴이 여기에 사용됩니다(https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia N&B 분석). 가져온 을 여는 것입니다. TIFF 파일, 루틴은 평균 강도 이미지, 평균 강도 프로파일을 생성하고 계열 프레임별 프레임별 검사할 수있다(보충 도 1). 다른 소프트웨어는 N&B 분석(예: SimFCS 소프트웨어)에 사용할 수 있습니다.
  3. 평균 강도 프로파일이 10% 이상의 광표백을 보여주는 시리즈를 폐기하고, 획득 하는 동안 세포막 왜곡 또는 번역이 명백한 계열이 있었다.
  4. 초점이 다른 자르기 프레임.
    참고: 이미지 시리즈 내의 단일 또는 다중 프레임을 삭제하기 위해 자르기 도구가 루틴에 구현됩니다. 이 작업은 프레임 간 시간이 중요하지 않은 반면 픽셀 거주 시간(노출 시간)은 토론 참조이기 때문에 허용됩니다.
  5. 500개 이상의 시간 프레임을 가진 해석 전용 계열에 대해 유지합니다.

5. 숫자 및 밝기 (N&B): 카메라 파라미터 결정(오프셋, σ 및 S)

  1. 일상적인 보정 카메라를 활성화합니다.
  2. 검출기 노이즈 영역에서 20 x 50픽셀 이상의 영역을 선택합니다(그림4).
    참고: 루틴은 값의 히스토그램 (또한 정의 된 디지털 수준, DL)에서 유래하고 디지털 수준 대 주파수의 로거 리헴 플롯을 반환합니다.
  3. 로그 주파수 대 디지털 레벨 플롯에서 선형 빨간색 커서를 이동하여 가우시안 과 곡선의 선형 부분을 구분합니다.
    참고: 빨간색 커서는 곡선의 두 섹션을 분할하고 카메라 응답의 가우시안 함수의 중심인 오프셋, 가우시안 맞춤의 σ 및 카메라 레스폰의 선형 부분의 경사인 S 팩터를 반환하는 루틴을 활성화합니다. e(그림 4C-D).

6. 숫자 및 밝기 (N&B): 선택한 관심 영역(ROI)에서 B 값 계산

  1. B 키를 활성화합니다.
    참고: 이 동작은 평균 강도이미지(도 5,제1 열)와 각 개별 B-값이 이미지의 관련 픽셀에 연관되는 B-이미지를 생성한다(보충도 1).
  2. 최소 비닝(2 2)을 적용하여 데이터의 분산을 줄이고 B-I 히스토그램을생성한다(도 5,제2 컬럼).
    참고: B-I 히스토그램은 이미지의 모든 픽셀과 픽셀 강도의 B-값의 분포를 나타냅니다. Y = B/S; X = ( - 오프셋)/S(보조그림 1 및 eq. 11 및 15).
  3. 대화형 사각형 커서를 사용하여 B-I 히스토그램을 검사합니다.
  4. 분석에 대한 정사각형 ROI를 선택합니다(그림5,세 번째 열).
    참고: 커서는 평균 강도 이미지에서 모바일 마스크를 동기화하여 정사각형 커서 영역 내에서 선택된 픽셀을 강조 표시합니다(추가그림 1). 이 검사를 통해, 매우 낮은 강도의 배경 및 영역을 분석에서 제외할 수 있다.
  5. 선택한 ROI의 B 맵을생성합니다(그림 5,네 번째 열).
  6. 선택 영역에 연결된 B 값의 ASCII 파일을 저장합니다.
  7. 그래픽 소프트웨어에서 ASCII 파일을 가져와 데이터의 주파수 분포를 계산하고 평균 B-값 ± S.E(그림5,다섯 번째 열)를 얻습니다.
    참고: 데이터가 균일한 경우 B-값의 주파수 분포는 가우시안 분포와 근사합니다.
  8. eq. 15를 적용하여 운동 실행의 각 시점에서 각 셀에 대해 평균 밝기 = - 1 [(개수/분자)]을 도출합니다. 다음에 따라 데이터를 정규화합니다.

    여기서 리간드 첨가 후 시간 "t"로 측정된 평균 B-값이며, 시간 t=0에서 측정된 평균 B-값(리간드 첨가 후 10-20s)이다.
    참고: 결과의 정상화는 다른 일에 수행되는 실험의 직접 비교를 할 수 있습니다. 레이저 전력 및 기술적 변동으로 인해 측정된 밝기의 차이를 보정합니다.
  9. 정규화된 평균 밝기와 획득 시간을 플롯하여 운동 실행을 빌드합니다(그림6).

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Representative Results

동일한 배양 접시에 시드된 두 개의 대표적인 HeLa-mEGFP-FGFR1 세포에 대한 결과는 도 5 및 보충표 1에나타내었다. 두 세포를 FGF2 리간드를 첨가한 후 0분(도5A,위) 및 7분(도5A,하단)에 포획하였다.

도 5는 또한 순수한 단량체, GPI-mEGFP(도5B,상단) 또는 공유 연결된 디메릭 플루오로폴레, GPI-mEGFP-mEGFP(그림5B,하단)를 발현하는 두 가지 대표적인 HeLa 세포의 결과를 나타낸다. ), 세포막에 노출되고 동일한 실험 조건하에서 포획하였다.

평균 명백한 밝기, B, HeLa-mEGFP-FGFR1 세포에서 1.070 ±0.001 S.E.에서 1.141 ±0.001 S.E.로 증가, 반면 기준 단모약체(그림 5B,상단) 및 디메릭(그림 5B,하단) 샘플 반환 B 각각 1.070 ±0.001 S.E. 및 1.141 ±0.001 S.E. 따라서, 비교하여, FGFR1 수용체는 주로 세포막 표면에서 단조로운 형태로 존재하지만, 그 정식 리간드 FGF2를 사용하여 자극시 우세한 다이메 상태를 향해 진행된다. 평균적으로, 두 개의 대표적인 세포에서 FGFR1 분자의 유행 상태는 명백하게 다르다.

동일한 접시에 여러 셀에 분석을 적용함으로써, 각각 상이한 시점에서 포획된 각 기량은, 시간의 함수로서 평균 밝기를 얻어진다(도6A). 그림 6A의 운동 실행은 세포 표면에서 몇 분 동안 지속되는 느린 이분화 과정을 설명합니다. FGF2-유도 된 FGFR1 이분 및 수용체의 후속 내재화는 공지된메커니즘(34); 따라서, 결과는 FGFR1 신호 변환에 대한 현재의 개념과 완전한 동의를 하고, 미묘한 결정까지 세포막 단백질의 올리고머화를 연구하기 위한 TIRF-N&B 접근법의 잠재력을 확인한다. 모노머 디머 다이내믹스.

결과의 정규화 된 평균 밝기 분석은 동일한 수용체에 대한 상이한 리간드의 효과를 비교하기에 적합한 도구입니다. 그림 6B에한 가지 예가 제공됩니다. 프로토콜은 동일한 표준을 사용하여 반복되었고 비정식 FGFR1 리간드, NCAM-Fc(50 μg/mL)로 세포를 자극하였다. 이 경우, 운동 프로필은 올리고머 혼합물에서 수용체의 빠르고 순환적인 전이를 드러내며, 이는 또한 이광액의 밝기 값에 도달한다. 정규화된 평균값 3이 반복적으로 관찰됩니다. 그러나 N&B 분석의 한계(강도 변동과 시간 변동의 두 순간만 고려)는 의심할 여지 없이 트리메라 형태의 형성을 입증할 수 없습니다. 동일한 정규화 된 평균 밝기는 수용체의 더 큰 올리고머 및 단량체의 다양한 조합의 결과일 수 있습니다. 그러나, 결과는 명확하게 동일한 수용체에 두 리간드의 효과의 시공간적 차이를 보여줍니다.

Figure 1
그림 1: 실험 프로토콜의 개요. (A)세포는 유리 바닥 접시에 도금되고 형광 태그 수용체로 형질전환된다. (B)타임시리즈 이미지는 TIRF 100x 1.46 오일 대물및 인큐베이터 챔버가 장착된 상용 TIRF 현미경으로 캡처됩니다. 이 상용 설정에서 소프트웨어는 내장 된 EMCCD 카메라 #1 N & B 시계열을 획득하는 데 필요한 매우 짧은 노출 시간에 작동하도록 허용하지 않습니다. 이것은 노출 시간이 포획될 수 있는 분자 확산의 범위를 제한하기 때문에 중요한 점입니다. 노출 시간이 짧을수록 분석할 수 있는 분자 확산이 빠릅니다. 0.5 에서 1 ms에 이르는 노출은 막 단백질 확산을 위해 충분히 빠릅니다. 따라서, 제2 EMCCD 카메라(#2)는 현미경 소프트웨어를 우회하여 카메라 소프트웨어 하에서 직접 작동하도록 현미경의 추가 포트에 추가된다. 이 적응된 구성에서 현미경 소프트웨어 및 카메라 #1 TIRF 정렬에만 사용됩니다. 그런 다음 TIRF 타임계는 카메라 #2 사용하여 1ms와 같은 매우 짧은 노출 시간 및 최대 EM 게인에서 실행됩니다. 또한 카메라 #2 124nm의 픽셀 크기를 가지며 이미지의 오버샘플링 및 비닝을 허용합니다(프로토콜 섹션 6.2 참조). 다른 TIRF 현미경의 특성에 따라 이미징 속도를 얻기 위한 다른 구성이 가능하지만, sCMOS 카메라의 사용은 이미지35에서무작위가 아니기 때문에 바람직하지 않다. (C)캡처 후, 타임 시리즈는 품질 검사로 검사됩니다. 포토블리싱이 10% 이상인 경우 계열은 프레임 수대의 평균 프레임 강도를 플로팅하여 결정할 수 있으므로 삭제됩니다. 시리즈는 또한 취득 도중 세포막의 명백한 왜곡 또는 번역이 있던 경우에 폐기됩니다. (D)각 픽셀의 평균 강도가 저장됩니다. (e)명백한 밝기를 나타내는 B-I 히스토그램, B, 이미지의 각 픽셀에서 생성된다. (F)B-I 히스토그램은 배경 위에 있는 ROI를 선택하는 데 사용됩니다. (G)B-값의 주파수 분포는 평균 B-값 ± S.E. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: N&B 원리. N&B는 "K" 이미지의 타임스택 시리즈를 획득하는 동안 조명 부피를 내보내고 나갈 때 발생하는 형광 변동을 측정하여 형광의 평균 올리고머화 상태를 정량화합니다. 변동의 진폭은 변동 신호,σ2및 평균 강도 값의 차이 사이의 비율을 계산함으로써 통계적으로 특징지어진다. 가장 간단한시나리오(A)에서조명 볼륨이 비어 있을 때(즉, 형광단 없음) 비율은 계측기 노이즈를 설명합니다. 플루오로포어(B,C)로 인해 형광 신호가 변동하는경우, "엑스트라" 차이는 분자 밝기, θ(분자당 검출된 광자 개수 및 초당 검출됨)에 정비례하며, 확산 분자의 수입니다. (B)에서, 8 단모성 확산 형광소가 있고(C),2 개의 테트라메릭 올리고머와 동일한 형광류 확산이 있다. 이러한 두 경우에서 평균 강도는 동일하지만 표준 편차 및 밝기는 변동의 진폭이 다르기 때문에(1θ, 4θ)가 다릅니다. θ = 0형광이 움직이지 않거나 결석한 경우. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: TIRF 현미경 검사법. N&B는 다광자, 연속 파또는 펄스 단일 광자 레이저, 아날로그 또는 광자 계수 검출기가 장착된 래스터 스캐닝 현미경과 동일하게 잘 실행되지만, TIRF 현미경 검사법은 분자 역학의 빠른 시간 이미징에 이상적입니다. 다른 이미징 기술로는 달성할 수 없는 속도, 해상도 및 신호/잡음 비(S/N)로 셀 표면 근처에서 발생하는 이벤트입니다. (A)TIRF 현미경 검사법은 각진 여기 레이저 빛이 커버 슬립의 유리 물 인터페이스 바로 아래에있는 형광단만 을 자극하는 총 내부 반사의 원리를 채택한다. 레이저는 굴절의 임계 각도보다 크거나 동일한 입사각으로 시편을 조사하는 반면 여기 레이저 광은 완전히 반사됩니다. 반사는 에바네센트 파라고 불리는 표본에서 매우 얇은 전자기장을 생성합니다. 시편의 작은 조명 섹션에 의해 방출되는 생성된 형광광은 슬라이드 에 수직으로 배치된 현미경 목표를 통해 수집됩니다. (B)패널은 표면으로부터의 거리가 증가함에 따라 기하급수적으로 감소하는 전도장 대 깊이의 상대적 강도의 주어진 파장에서 대표적인 예를 보여 주며, 높은 축 분해능 형광을 제공합니다. 이미지. 측면 해상도는 목표물의 수치 조리개와 배율및 감지 카메라의 픽셀 크기에 의해 설정됩니다. 셀 내부는 조명되지 않으며 세포 내 자가 형광신호에 기여하지 않습니다. 다각형 TIRF 현미경을 통해 다양한 침투 깊이를 선택할 수 있습니다. 그들은 여기 파장에 따라 일반적으로 단일 색상 TIRF 이미지에 대한 250 nm 깊이70 nm에서 간다 규모를 제공합니다. 이 프로토콜에 대해 선택된 전도 조명 깊이는 110 nm이며, 낮은 레이저 전력사용의 필요성과 침투 깊이의 감소와 함께 급격히 감소하는 형광 신호의 강도 사이의 절충의 결과입니다. 많은 세포 내 소포 및 형광단의 세포 내 인구를 조명 할 수있는 지나치게 큰 전단장을 피하는 것이 중요합니다. 따라서 샘플 유형에 따라 높은 신호 대 잡음 비, 낮은 여기 전력, 짧은 노출 시간, 짧은 침투 깊이 등 최적의 조합을 찾기 위해 여러 침투 깊이를 탐색해야 합니다. 이 최적화가 완료되면 모든 컨트롤 및 샘플에 대해 침투 깊이가 일정하게 유지됩니다. (C)HeLa-GPI-mEGFP 셀의 대표적인 에피플루오레시션 및 TIRF 이미지는 에바네센트 필드의 깊이 및 방향의 소프트웨어 유도 최적화 후. 다중 각도 TIRF 현미경은 또한 에바네센성 필드의 방향을 최적화할 수 있습니다. 이 단계는 산란을 최소화하는 데 권장됩니다 (즉, 강도의 급격한 증가와 덜 선명한 이미지), 사용되는 특정 현미경의 지시에 따라 수행 될 수있다. 이 프로토콜에서 현미경 소프트웨어는 에바네센트 필드의 방향에 대한 자동 최적화를 포함한다. 수동 최적화의 경우 게시된 프로토콜36,37을참조하십시오. (D)TIRF 조명의 최적화 후 전형에서 mEGFP-FGFR1 구재를 발현하는 대표적인 세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 시계열 캡처 및 단일 광자에 대한 카메라 반응 보정. (A)자른 센서 모드에서 HeLa-mEGFP-FGFR1 셀에 캡처된 700프레임 타임시리즈 중 첫 번째 프레임의 예. 카메라 칩은 TIRF 현미경에 설치된 듀얼 뷰 커넥터를 사용하여 부분적으로 마스크(빨간색 사각형)가됩니다(그림 1B). 내부 보정 영역은 평균 강도이미지(B)에서인식되고 디지털레벨(D)에비해 로그 주파수를 플로팅하여 카메라 파라미터를 추정하기 위한처리(C)로인식된다. EMCCD 카메라와 같은 아날로그 감지 시스템은 광자 수 대신 광전류의 펄스를 감지하고 광자 펄스 높이 분포는 준지수입니다. 분포의 첫 번째 부분은 증폭기 및 아날로그 - 디지털 컨버터로 인해 이며 가우시안 판독 소음 (신호 녹음에 의해 도입 된 분산)에 기여한다. 분포의 가장 인구가 많은 채널(즉, 가장 빈번한 값)은 오프셋(eq. 13)입니다. 로그 플롯에서 수직 커서를 사용하여 분포의 첫 번째 부분은 250 DL 이상의 지수 제2 부분과 분리되며, 이는 단일 광자에 대한 평균 카메라 응답을 나타냅니다(경사는 eq. 12의 S 계수임). 이러한 파라미터를 측정하면 수집 중에 기록된 광자의 밀도를 추정할 수 있습니다. 개수(DL)는 의사 색상 배율에 있습니다. 픽셀 크기 = 124 nm; 이미지 포맷 = 256x256 픽셀, 에바네센트 필드의 침투 깊이 ~ 110 nm; 보정 ROI #1 = 19x256 픽셀; 보정 ROI #2 = 5x256 픽셀입니다. DL = 디지털 레벨. 노출 = 1 ms 및 EMGain (eq. 12, 13 및 14의 G 계수) = 1000. 배경이 있는 광자 계수 모드에서 작동하는 카메라는 S=1(eq. 12)과σ2d 및 오프셋(eq. 13)을 가진 아날로그 검출기와 동일하며 아날로그시스템(18)과동일한 방식으로 측정된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: FGFR1 올리고머화의 N&B 분석. (A)mEGFP-FGFR1을 발현하고 20 ng/mL FGF2를 첨가한 후 0분(위) 및 7분(아래)에서 포획된 동일한 접시에 있는 두 개의 HeLa 세포로부터의 대표적인 결과, 및(B)참조를 발현하는 2개의 HeLa 세포가 GPI-mEGFP(상단)를 발현한다. 및 GPI-mEGFP-mEGFP (하단). 전체 분석 시퀀스는 (왼쪽에서 오른쪽으로) 표시: 타임계의 평균 강도; 색상 코드가 이미지에서 동일한 B 값을 갖는 픽셀 수를 나타내는 형광 강도의 함수로서 모든 B-값의 플롯과 직사각형 커서는 관심 영역(ROI), 배경(BG) 및 매우 낮은 영역을 구분합니다. 강도(LI)를 참조하십시오. 움직이지 않는 형광소는 변동이 없는 경우 θ = 0이 없기 때문에 B 값 = 1을 제공합니다. 선택한 ROI 및 관련 B 분포 히스토그램의 B 맵. B-값 분포는 가우시안 함수(파선 적색 선)가 장착되어 평균 명백한 밝기, B(전체 빨간색 선) 및 분포통계(보충 표 1)B 값 = B'=B/S(eq. 15)를 계산합니다. 강도 = (( - 오프셋)/S; M = 단량체; D = 이분; 스케일 바 = 10 미크론. 원시 데이터 타임 시리즈 보충 영화 1, 보충 영화 2, 보충 영화 3,및 보충 영화 4. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
도 6: 리간드 활성화에 의해 유도된 FGFR1 올리고머화의 역학. 대표적인 운동실행은 20 ng/mLFGF2(A)또는 50 μg/mL NCAM-Fc(B)로 자극후 HeLa-mEGFP-FGFR1 세포의 정규화된 평균밝기(eq. 16)에 의해 기술된다. 동일한 접시에 있는 세포는 증가된 시점에서 포착되었고, 명백한 평균 밝기, B±S.E., B-분포 히스토그램으로부터 계산하였다. 이 수치는 자마이 외 세포 과학 저널 (2019)31의허가를 받아 조정됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 7
그림 7: 빠른 역학 및 데이터 해석. HeLa-mEGFP-FGFR1 세포가 NCAM-Fc(50 μg/mL) 또는 FGF2(20 ng/mL)로 자극된 복제 운동 실행으로부터 얻은 모든 정규화된 평균 밝기 값의 산란 플롯. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Supplemental Figure 1
추가 그림 1: MatLab의 분석 루틴의 화면 스냅샷입니다. 초기 분석 단계를 보여주는 N&B 그래픽 사용자 인터페이스(GUI) MATLAB 루틴의 화면 스냅샷: 업로드 시계열; 평균 강도 이미지를 계산하고, 강도 프로파일을 계산하고, B 맵 및 B-I 히스토그램을 계산합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

매개 변수 GPI-mEGFP GPI-mEGFP-mEGFP mEGFP-FGFR1 (시간 = 0') mEGFP-FGFR1 (시간 = 10')
가우시안 평균 B 값 1.070 1.141 1.070 1.141
평균 B 값에 S.E. 0.001 0.001 0.001 0.001
B-보분포의 S.D. 0.059 0.067 0.077 0.075
95% 평균 B 값의 신뢰 구간 1.069 ~ 1.071 1.139 ~ 1.143 1.069 ~ 1.072 1.139 ~ 1.143
B값의 95% 신뢰 구간의 S.D. 0.058 ~ 0.060 0.065 ~ 0.069 0.075 ~ 0.079 0.073 ~ 0.078
피팅 구속 S.D. > 0 S.D. > 0 S.D. > 0 S.D. > 0
S.E. 표준 오류; S.D. 표준 편차

보충 표 1: 명백한 밝기 분석. 도 5에서 B 분포의 통계 및 가우시안 피팅 파라미터가 수행되었다. 최소 정사각형 가우시안 맞춤은 X 범위가 자동으로 선택되고 최대 반복 = 1000을 사용하여 표준 편차 > 0의 제한하에 얻어졌습니다. R 정사각형: mEGFP-FGFR1 단량체 = 0.9957, mEGFP-FGFR1 디머 0.9940; GPI-mEGFP = 0.9985; GPI-mEGFP-mEGFP = 0.9970.

Supplemental Movie 1
보조 영화 1: 도 5에나타낸 HeLa-mEGFP-FGFR1 세포의 시계열은 FGF2 자극 후 0분(PBS에서 0.01% BSA로 보충된 PBS에서 20 ng/mL) 후에 발생한다. 800 프레임 시리즈는 7fps에서 압축되지 않은 재현됩니다. 이미지 형식 = 256 x 256 픽셀; 픽셀 크기 = 124 nm; 내부 보정 영역은 어두운 측면 밴드로 식별됩니다. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오 (다운로드 오른쪽 버튼을 클릭하십시오).

Supplemental Movie 2
보조 영화 2: 그림 5에 나타난 HeLa-mEGFP-FGFR1 셀의 시간 = FGF2 자극 후 7분 (0.01% BSA로 보충된 PBS에서 20 ng/mL) 800 프레임 시리즈는 7fps에서 압축되지 않은 채 재현됩니다. 이미지 형식 = 256 x 256 픽셀; 픽셀 크기 = 124 nm; 내부 보정 영역은 어두운 측면 밴드로 식별됩니다. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오 (다운로드 오른쪽 버튼을 클릭하십시오).

Supplemental Movie 3
보조 영화 3: 차량을 첨가한 후 HeLa-GPI-mEGFP 셀의 도 5에 도시된 시계열(PBS는 0.01% BSA로 보충됨). 1,000프레임 시리즈는 7fps로 압축되지 않은 재현됩니다. 이미지 형식 = 256 x 256 픽셀; 픽셀 크기 = 124 nm; 내부 보정 영역은 어두운 측면 밴드로 식별됩니다. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오 (다운로드 오른쪽 버튼을 클릭하십시오).

Supplemental Movie 4
보조 영화 4: 차량을 첨가한 후 HeLa-GPI-mEGFP-mEGFP 셀의 도 5에 도시된 시계열(PBS0.01% BSA로 보충됨). 1,000프레임 시리즈는 7fps로 압축되지 않은 재현됩니다. 이미지 형식 = 256 x 256 픽셀; 픽셀 크기 = 124 nm; 내부 보정 영역은 어두운 측면 밴드로 식별됩니다. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오 (다운로드 오른쪽 버튼을 클릭하십시오).

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Discussion

N&B는 셀 모델 및 라벨링 전략의 선택에 몇 가지 예방 조치가 필요합니다. 이미지 캡처 시간 동안 안정적으로 부착된 상태로 유지되는 라이브 셀에만 적용할 수 있습니다. 전체 셀 강성 변위로 인한 추가 변동은 적절한 이미지 복원 접근법38로처리될 수 있습니다. 그러나, 일반적으로 세포가 움직일 때, 세포막은 또한 변형되고, 구조 변형, 큰 추가 편광을 일으키, 막 단백질의 분석에 심각한 한계를 소개합니다. 이 작업에서, 형광 구조체는 구성FGFR1이 무시할 수 있기 때문에 HeLa 세포주에서 발현된다. 구성 단백질의 존재는 피하는 조건, 그렇지 않으면 형광 및 비 형광 수용체 올리고머의 혼합 인구는 가능성이 형성 할 것이다. 결과적으로, 형광태그가 붙은 단백질 집단의 밝기만을 기반으로 하는 N&B 분석은 평균 올리고머 상태에 대한 신뢰할 수 없는 추정치를 반환합니다. 이러한 양상은 FGF2 리간드의 존재 시 FGFR1 이광과 같은 밝기가 2의 인자에 의해서만 증가하는 수용체 이광 이벤트를 검출하기 위해 N&B를 적용할 때 특히 중요하다. 이러한 경우, 혼합 이이퍼의 존재는 N&B가 감지할 수 있는 이광 이벤트를 완전히 숨길 수 있다. 비형광 구성 형태를 가진 형광 올리고머의 오염은 태그가 붙은 단백질이 크게 과발현되지 않는 한 형광의 검출에 기초한 모든 접근법의 잠재적인 함정 중 하나입니다. 그러나, 단백질 과발현의 조건에서 올리고머화 연구는 그들의 기능적 중요성에 대한 우려를 제기한다. 과도 형질 감염된 세포는 형광의 가변 수준을 가질 가능성이 (즉, 단백질 농도) 및 단백질 농도에 평균 밝기의 독립성을 테스트하는 데 유용, N&B는 광범위한 범위에 적용 될 수 있기 때문에 검출기의 선형 응답 조건하에서 농도를 조절할 수 있습니다(밝기, eq. 1의 정의 참조).

또 다른 제약조건은 살아있는 세포에서 안정한 형광포를 사용하여 수용체의 세포치오메트릭 라벨링이다. 헤일로 태그, 형광 단백질 (FP) 또는 다른 공유 형광 태그는 세포에 있는 단백질의 분자 당 결합된 형광단의 정확한 수를 얻기 위하여 적당한 레이블입니다. N&B 분석의 복잡성을 줄이기 위해 형광 단백질 또는 후광 태그를 사용하여 1대 1 형광부피소공-단백질 라벨링을 생성합니다. 선택의 FP는 성숙한 형태로 단조로울 수 있어야 하며, 그렇지 않으면 FP 태그가 있는 수용체의 인공 올리고머화를 유도할 수 있는 무시할 수 있는 자기 연관 경향을 갖는다. 이 프로토콜에서는, 이러한 단일 포인트 돌연변이가 앞서 도시된바와같이 mEGFP 자가 집적 경향을 폐지하기 때문에 (A207K) mEGFP를사용한다. 라벨링 전략에 관계없이, 형광 태그가 붙은 단백질은 선택된 세포 모델에서 생물학적 활성의 보존을 검사해야 하며, 태그가 부착된 분자의 기능은 올리고머화 사건을 연결하기 위해 필수적입니다. 수용체 신호. 우리의 모델에서, 우리는 수용체 리간드 FGF231로형질감염된 세포를 자극한 후 형광(A207K)mEGFP-FGFR1의 자가포스포릴화를 입증하였다.

N&B는 조명 부피에서 분자의 확산을 기반으로 합니다. 디지털 카메라 검출에서 노출 시간(즉, 아날로그 검출에서 픽셀 거주 시간, t거주자)은초점 볼륨에서 하나의 구성만 캡처할 수 있을 정도로 짧아야 합니다. 이는 노출 시간 동안 조명된 부피를 입력하거나 빠져나갈 확률이 매우 작다는 것을 말합니다. 노출 시간은 불소가 조명된 부피에서 소비하는 평균 시간인 형광포피의 체류시간(θD)보다짧아야 합니다. 따라서 N&B 실험을 시작하기 전에, 첫 번째 근사치에서 세포 외 국소화 및 분자 질량에 의존하는 표적 단백질의 체류 시간 (또는 확산 계수)에 대한 몇 가지 개념을 가질 필요가 있다. 프레임 속도는 카메라가 이미지를 획득한 다음 해당 이미지를 완전히 판독하는 데 필요한 시간의 역이며, 노출 시간과 결합된 총 픽셀 수 와 판독 속도에서 대략 계산되는 경우가 많습니다. 프레임 속도가 빠를 필요는 없지만 프레임 속도의 합계와 다음 프레임의 캡처를 준비하는 시간의 합계인 사이클시간(t cycle)이분석에 영향을 줄 수 있습니다. 이러한 제약 조건은 일반화 될 수 있습니다: t주기 > > θD >>> t거주자. 주기 시간이 너무 빠르면 분자가 해당 시간의 한 프레임에서 다음 프레임으로 현저하게 이동하지 않고 움직이지 않는 것으로 나타납니다(B = 1). 그러나 분석에 수백 개의 프레임이 필요하기 때문에, 사이클링은 세포 변위와 세포막의 왜곡을 피하기 위해 가능한 한 빨리 설정됩니다(픽셀 수의 이미지 형식 증가 또는 감소). 시리즈 인수 하는 동안. 이 프로토콜의 예에서 가장 느린 사이클 시간은 22ms이므로 11초에서 500프레임을 획득할 수 있습니다.

분자 밝기는 절대 양이 아닙니다. 이는 형광단(단면 및 양자 수율)의 분자 특성, 실험 설정(검출기 및 광학)뿐만 아니라 레이저 파워와 같은 여기 조건에 의존한다. 따라서 TIRF-N&B 접근법은 명백한 밝기를 산출하며, 그 때문에 단발성 올리고머 상태로 참조 구도를 표현하는 "기준 셀 모델"을 설정하는 것이 기본입니다. 상기 기준 구성은 연구 하에 단백질의 동일한 형광포압 태그를 전달한다[여기, (A207K)mEGFP] 및 동일한 세포실(여기, 혈장 막)에서 국소화된다. 이 작품에서 우리는 글리코실포스파디올리노시톨(GPI)을 사용하여 고정-(A207K)mEGFP 구성체를 반복적으로 동일한 형광로폴로 표시된 세포 표면 수용체에 대한 신뢰할 수 있는 단일성 밝기 표준으로 입증한30, 31.

한 가지 주요 단점은 동일한 세포가 운동 실행 중에 반복적으로 빛에 노출될 때 발생가능성이 매우 높은 형광표백의 발생이며, 올리고머화 상태의 과소 평가로 이어집니다. 이를 방지하기 위해, 밝기 역학은 상이한 시점에서 각각 포획된 상이한 셀의 평균 밝기를 결합하여 수득된다(도6). 이것은 페트리 접시에서 각 세포는 역학의 다른 시점이고 페트리 접시는 전체 운동 실행을 나타낸다는 것을 말하는 것입니다.

비정식 리간드에 의해 유도된 FGFR1 올리고머라이징과 같이 올리고머화 역학이 빠르고 복잡할 때, NCAM31,정규화된 평균 밝기대 시간의 프로파일이 가변적이고 불안정할 수있다(도 6B ). 이러한 경우 매번 새로운 셀을 이동하고 집중해야 하기 때문에 정확한 시점에서 셀의 복제 접시를 읽고 ROI를 선택하고 시간계를 캡처및 검사/폐기해야 하므로 재현성을 결정할 수 없습니다. 따라서, 재현성은 밝기 변화의 운동 프로파일 유사성 및 진폭의 관점에서 평가될 수 있다.

결과에 대한 개요는 그림 7에표시됩니다. 산란플롯은 동일한 접시의 셀에서 측정된 평균 밝기만 보여 주며 각 캡처 시간을 무시합니다. 이 플롯에서 수용체의 올리고머화 상태에 대한 두 리간드에 의해 유발된 주요 차이는 모든 운동 정보가 제거되더라도 분명하게 남아 있다. 그러나, 두 세트의 실험(FGF2-대 NCAM 유도 올리고머화)에 대해, 그림 7에서 각 실행의 평균 ±S.D.를 결정하는 종래의 접근법은 FGF2에 의해 자극된 FGFR1 분자가 명확하게 자극되기 때문에 오해의 소지가 있는 결론을 초래할 것이다. NCAM은 평균 ± S.D. 값으로 잘 표현되지 않을 불안정하고 순환적인 올리고머 FGFR1 혼합물을 유도하는 반면, 두 개의 잘 정의된 상태로 의한 수송.

요약하자면, 실험적인 관점에서 N&B는 빠른 수집 모듈과 전용 소프트웨어가 장착된 현미경에만 접근할 수 있어야 합니다. 관심 있는 단백질은 다양한 단일형 형광 단백질 또는 유기 형광성 으로 태그될 수 있지만 정량적 측정은 여러 가지 조건이 필요합니다: stoichiometric 라벨링, 기준 밝기 표준, 검출기 보정 및 포토블리싱이 없습니다. 이러한 맥락에서, N&B 접근법은 살아있는 세포에서 단백질의 시공간적 올리고머화를 해독하는 강력한 도구이다. 또한, 통계적가중치(41)를 해결하기 위한 원시 데이터 리샘플링의 최근 진보와 형광 상호 상관분광법을 상호 상관N&B(42)와 결합하여 N의 적용가능성을 개선하고 개선하고 있다. 단백질 올리고머화 및 상호 작용 연구에 대한 & B 접근법.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgments

CNIC는 시엔시아, 이노베이션 y 유니버시다데스 및 프로 CNIC 재단의 지원을 받으며, 세베로 오초아 우수 센터(SEV-2015-0505)입니다. 우리는 또한 유럽 지역 개발 기금 (FEDER) "우나 마네라 드 헤이서 유로파"에 의해 지원됩니다. UC는 아소시아지오네 이탈리아나 리카르카 술 칸크로, 국제 암 연구 협회(현재 전 세계 암 연구로 알려짐), 이탈리아 보건부의 지원을 인정합니다. A.T.는 2011-2012년 "프로게토 프로게토 프로페셔널이바노 베치"와 함께 자신의 작품을 부분적으로 지원한 것에 대해 "폰다지오네 방카 델 몬테 디 롬바르디아"를 인정합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Colour Fast TIRF Leica AM TIRF MC inverted microscope, with smi-automatic TIRF alignment. The microscope is equipped with a diode 488 nm laser, a 100x 1.46 oil TIRF objective, Ex/Em Bandpass filters at 490/20 and 525/50, temperature/CO2 incubator and Andor DU 8285 VP EMCCD camera. The microscope is operated by Leica LIF software. Leica Microsystems, Wetzlar, Germany
Albumin from Bovine Serum 98% minimun Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA A7906-100G
DMEM without Phenol Red with 25 mM HEPES GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA 21063029 Used serum free for microscopy
DMEM high-glucose GlutaMAX I GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA 10566-016 Used for complete medium
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10x (PBS) Biowest, Nuaillé, France X0515-500
Emission splitting system Photometrics DV2 TeledynePhotometrics, Tucson, AZ, USA
Fetal Bovine Serum, qualified, Brazil GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA 10270106 10% inactivated supplement for complete medium
Glass bottom 35 mm sterile 1.5 dishes MatTek, Ashland, MA, USA P35G-0.170-14-C uncoated, glass thickness 0.17 microns
GraphPad Prism GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA
Human cervical carcinoma (HeLa), serum-free animal component (AC) cells Millipore-Sigma ECACC, Darmstadt, Germany CB_08011102
iXonEM+ 897 EMCCD (back-illuminated) ANDOR camera controlled by ANDOR Solis software Oxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, UK This camera, installed in an additional port of the microscope, is used for acquiring the N&B time series
Matlab Executable N&B routine Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain download at https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia
MatLab v.2018b The MathWorks, Inc. Natick, MA, USA https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Penicillin:Streptomycin for tissue culture 100x Biowhittaker Inc. Walkersville, MD, USA LONZA 17-602E supplement for medium at Penicillin/Streptomycin 100 U/100µg.
pN1-mEGFP-FGFR1 expression vector Unit of Gynecological Oncology Research, European Institute of Oncology IRCCS, Milan, Italy Zamai et al., 2019
pN1-N-Gly-mEGFP-GPI expression vector Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain Hellriegel et al., 2011
pN1-N-Gly-mEGFP-mEGFP-GPI expression vector Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain Hellriegel et al., 2011
Recombinant FGF2 PeproTech EC, Ltd., London, UK Ligand solution: 20 ng/mL of FGF2 in PBS supplemented with 0.01%BSA.
Sodium pyruvate GIBCO ThermoFisher Scientific 11360070 1 mM supplement for medium
TransIt-LT1 Transfection Reagent MirusBio LLC, Madison, WI, USA MIR 2300
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA 25200056
Type F Immersion liquid 10 mL Leica Microsystems, Wetzlar, Germany 11513 859
UltraPure BSA (50 mg/mL) ThermoFisher Scientific AM2618 0.1% supplement for medium without phenol red used for transfections

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References

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생물학 문제 153 수용체 클러스터 N&B 수 및 밝기 모멘트 분석 단백질 올리고머 세포막 TIRF 현미경 검사법
총 내부 반사 형광 현미경 검사법에 의해 살아있는 세포에 있는 세포 표면 수용체의 올리고머화 역학 은 수 및 밝기 분석과 결합됩니다
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Zamai, M., Trullo, A., Arza, E.,… More

Zamai, M., Trullo, A., Arza, E., Cavallaro, U., Caiolfa, V. R. Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis. J. Vis. Exp. (153), e60398, doi:10.3791/60398 (2019).

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