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数と明るさの分析と組み合わせた全内部反射蛍光顕微鏡による生細胞における細胞表面受容体のオリゴマー化ダイナミクス

Published: November 6, 2019 doi: 10.3791/60398
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 1,2
1Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC), Madrid, Spain, 2Centro di Imaging Sperimentale, Ospedale San Raffaele, Milan, Italy, 3Unit of Gynecological Oncology Research, European Institute of Oncology IRCCS, Milan, Italy

Summary

生細胞の形質膜におけるリガンド結合によって誘導されるmEGFPタグ付き受容体オリゴマーの平均オリゴマー状態の測定のためのイメージングアプローチについて説明する。このプロトコルは、数と明るさ(N&B)分析と組み合わせた全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡に基づいています。

Abstract

受容体オリゴマー化の重要性とユビキタスにもかかわらず、クラスタリングイベントを検出し、クラスタリングの程度を測定するための方法はほとんどありません。ここでは、生細胞の膜におけるMEGFPタグ付き受容体ホモ複合体の平均オリゴマー状態を決定するイメージングアプローチについて説明する。このプロトコルは、数と明るさ(N&B)分析と組み合わせた全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡に基づいています。N&Bは、蛍光相関分光法(FCS)および光子計数ヒストグラム(PCH)に似た方法で、照明の中で拡散する蛍光強度の変動の統計的分析に基づいています。観測時間中の体積。特に、N&BはPCHの簡素化であり、オリゴマー混合物中のタンパク質の平均数に関する情報を得る。強度変動振幅は、蛍光色素の分子輝度と照明体積内の蛍光色素の平均数によって記述される。したがって、N&Bは振幅分布の第1と第2のモーメント、すなわち平均強度と分散のみを考慮します。これは、同時に、方法の強さと弱さである。2つの瞬間しか考慮されないため、N&Bは混合物中の未知のオリゴマーのモル分率を決定することはできませんが、混合物の平均オリゴマー化状態を推定するだけです。それにもかかわらず、蛍光強度の時間変動を監視するだけで、生細胞の画像の比較的小さな時系列(他のモーメント法と比較して)にピクセル単位で適用することができます。ピクセルあたりの有効時間を数マイクロ秒に短縮し、高速オリゴマー化動態に必要な秒からミリ秒までの時間範囲での取得を可能にします。最後に、大きな細胞領域と細胞下コンパートメントを探索することができます。

Introduction

我々は、受容体アセンブリの連結を目指し、生細胞の形質膜における受容体分子の平均オリゴマー状態を決定するための全内部反射蛍光数と輝度(TIRF-N&B)イメージングアプローチを記述する。タンパク質の生物学的機能に対するダイナミクス (図 1)

細胞外リガンド結合の際、受容体は、その立体構造、オリゴマー化、潜在的な共受容体および膜組成に応じて細胞内シグナル伝達を開始する。受容体オリゴマー化の重要性とユビキタス性にもかかわらず、細胞シグナル伝達1、2、3、4、5、6の重要な事象として認識される。 7、クラスタリングイベントを検出し、実験的にクラスタリングの程度を測定できる方法はほとんどありません。共焦点体積(x,y≥ 300 nm,z≥900 nm)は、分子相互作用および動物化測定を証明するために十分に解決されていないが、画像復元アルゴリズム10による最適化後も。タンパク質オリゴマーのサブユニット組成は、PALM11、STORM12、STED13などの20〜70nmのX、y分解能法であっても、純粋に空間的に分解することはできません。さらに、時間分解能 (画像あたりの分単位) は、秒単位のキネティクスに従うことはできません。単分子ステップ漂白は、それらが不動である場合にのみタンパク質オリゴマーのムチオメトリーを解決する。

単一画像内の蛍光タグ付きタンパク質の密度とオリゴマー化を測定する最も汎用性の高い方法の1つは、空間サンプリングに依存する空間強度分布解析(SpIDA)です。これは、化学的に固定された細胞と生細胞の両方に適用可能であり、標準蛍光顕微鏡15を用いて細胞の目的のいくつかの領域の分析を同時に可能にする。あるいは、蛍光相関分光法(FCS)16、フォトン計数ヒストグラム(PCH)17、数と明るさ(N&B)18、19などのモーメント法は、定量的オリゴマーに適している測定。これらの方法は、蛍光体が照明体積の間で拡散する時間内に観察できる蛍光強度変動を分析する。強度変動の振幅は、蛍光色素の分子輝度(ε)と照明音量17内の蛍光色素(n)の平均数によって一意に記述することができる(図2)。典型的には、蛍光体の拡散係数および照明容積内の分子の平均数(G(0)値に逆作用する)は、FCS20によって得ることができる。しかし、拡散時間は質量の立方根のみでスケールするので、FCSは分子量21の変化を検出するのに十分な感受性を持たない。実際には、単色FCSは膜受容体の二量体化を検出できない。PCHは異なるオリゴマーの混合物を正確に解決する。振幅分布の2回以上の瞬間を使用して、同じ照明ボリュームを占める異なる明るさの分子を検出します。分子輝度(pCOMB)アプローチ23の興味深い対相関などの走査FCS22および開発は、生物学的システムにおける蛍光相関法の適用範囲を広げるために導入された24、セルの広い領域での高速測定の能力を欠いている単一点法のままであり、各ピクセルで多くの連続した観測値を必要とし、秒単位でデータを取得する必要があります。

N&B は、蛍光分布の振幅の最初と 2 番目のモーメント、すなわち平均強度、、および分散 σ2 (図 2)18、19 のみを考慮する PCH の簡略化されたバージョンです。そして、そのために、混合物中の未知のオリゴマーのモル分率を決定することはできないが、混合物の平均オリゴマー化状態を推定するだけである。それにもかかわらず、N&Bは、蛍光強度の時間の変動を監視するだけで、PCHよりも比較的小さな時系列の生細胞画像をピクセル単位で操作できるという利点があります。N&B はピクセルあたりの時間を数マイクロ秒に短縮するため、大きなセル領域に対する高速オリゴマー化動態に従うことができ、ラスター スキャン顕微鏡 (共焦点、2 光子など) およびミリ秒で数秒のタイム スケールで画像を取得できます。カメラベースの顕微鏡検査(例えば、TIRFM)で。

いくつかの報告は、拡張細胞領域をイメージングすることによってタンパク質クラスター内のサブユニットの数を定量化するN&Bの能力を実証している。Paxillin-EGFPクラスターはCHO-K1細胞25の接着部位で検出され、かつ病原性Httex1pペプチドの細胞内凝集はCOS-7細胞26に記載した。N&Bは、ErbB受容体27のリガンド駆動オリゴマー化に続いて適用し、HeLa細胞28におけるクロトゴブ(KLB)およびFGFR1cに対するリガンドFGF21の効果を適用した。TIRFイメージングとN&B分析の組み合わせは、ダイナミン-2が主に細胞膜29全体にわたって四量体であることを示すために使用された。我々は、uPARおよびFGFR1細胞膜受容体30、31のリガンド駆動二量体化を証明するために、ラスタースキャンとTIRF画像の両方にN&Bを適用した。

N&B、FCS、PCHなどの蛍光相関法は、オープンボリュームでは粒子の職業数がポアソン分布に従るという概念に基づいています。蛍光体が放出するフォトンのみが検出できるので、画像のピクセルにおける測定された蛍光強度と時間の平均値は、照明体積における蛍光体の平均数の積であり、n、分子輝度, ε17:

ここで ε は、分子が照明ボリュームの中心にある場合に、分子あたりの時間単位あたりの光子の数 (従来は 1 秒あたり) として表されます。

明るさは、所定の取得設定における各蛍光色素の特性であり、強度はすべての蛍光色素からのすべての寄与の合計です。生物学的コンテストでは、一緒に変動するフルオロフォアの数の増加に伴って明るさが増加し、蛍光タグ付きタンパク質のオリゴマー化状態に関する情報が与られます。特定のピクセルの変動振幅は、蛍光シグナルσ2の分散から測定されます。

強度の二乗の平均、および強度の平均の二乗は、各フレームの各ピクセルの個々の強度値から計算されます。

ここで、Kは時系列の合計フレーム数です。実験的には、平均強度値の周囲の単一の画像の各ピクセルにおける個々の強度値の散乱を記述する分散を画像シリーズ全体に対して計算する必要があります。分散には、異なる原点のすべての変動が含まれます。第1近似では、照明体積中の拡散粒子による分散、σ20、検出器ショットノイズによる分散から分離することができる、σ2d。2 つの分散は独立しています。したがって、合計分散は合計で与えられます。

この分散は、検出体積の分子変動に起因して、分子の明るさと強度に直線的に依存します。

eq. 1 に従って eq. 6 を並べ替える:

蛍光相関分光法における典型的な概念によれば、式7は、変動数による分散が粒子輝度の二乗に依存することを示す。

そして、検出器の変動による分散は、検出された強度の線形関数であり、検出器がその飽和限界19以下で動作することを前提とする。

フォトン計数検出器a=1 およびc=0 の場合、検出器の分散は平均強度と等しくなります。

これらの概念を生細胞の実際の測定値に適用するために、Gratton と同僚18は、各ピクセルの見かけの明るさ B を平均強度に対する分散の比率として定義します。

Bは実験的に測定されるパラメータである。本研究では、HeLa細胞の形質膜におけるFGFR1受容体の時系列画像をTIRF顕微鏡で捉え、平均見かけ明るさBをN&B分析により決定する。次いで、FGF2を添加した後、公索リガンドによる受容体の刺激後の膜表面における受容体分子の自己集合の変化に従って連続した時系列が捕捉される。

しかし、TIRF顕微鏡の検出器はEMCCDカメラであるため、見かけの明るさの発現を19として変更する必要があります。

ここで、オフセットは検出器設定の特性である検出エレクトロニクスの強度オフセットです。アナログ検出器の分散と平均強度は、それぞれ次のように求められています。

ここで、Gはデジタルレベル(DL/フォトン)のアナログゲインであり、S、フォトン19あたりのデジタルレベルは、一定の強度(時間的変動なし)を持つ光源の強度対分散プロットの傾きによって与えられます。γ因子は、画素検出ボリュームの形状に関連する。Hassler et al.32によれば、γ因子は、検出カメラ19の最大ゲインで動作するTIRFイメージングに対して0.3に等しい。オフセット、SおよびGパラメータは、カメラおよび顕微鏡の特性である。見かけの明るさBは、eq. 12および13に従ってeq. 11を並べ替えることによって得られる。

実験的には、εはレーザー強度とシステムの検出効率の複雑な関数です。それにもかかわらず、B/Sはεに直線的に依存しているため、特定の検出モードのεの相対値を決定することが重要です。

ここでε'は ε に比例します。それでも、キャリブレーションは内部参照を使用して実行されます。

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Protocol

1. サンプル調製

  1. 1日目。ガラス底皿の100,000-200,000細胞/mLの濃度で完全な培地中の種子HeLa細胞。シード6-8は料理を複製します。
    注:この例では、培地は10%熱不活性化胎児ウシ血清(FBS)、1mMピルビン酸ナトリウム、100 U/100 μgペニシリン/ストレプトマイシンで補充される。いくつかの複製料理が用意されています。
  2. 2-3日目。細胞が亜コンフルエンスの場合、タンパク質プラスミドで食器の半分をトランスフェクトし、後半を参照プラスミド(モノマーおよびダイマー)で、無血清培地でトランスフェクトする。
    注:トランスフェクションは、フェノールレッドなしで、抗生物質、0.1%ウシ血清アルブミンおよび25 mM HEPES緩衝液を補充した血清フリー培地で行われる。
  3. 3-4日目。トランスフェクトされた細胞が皿の底に付着し、細胞膜が蛍光を発していることを確認します。過剰に生えた細胞や非常に低い蛍光を持つ料理を廃棄します。
    注:細胞が過剰に成長しないようにしてください。細胞は十分に分布し、皿のガラス領域に付着する必要があります(図1A)。プレコーティングされたガラス底の皿は細胞の付着を支持するために使用することができる。細胞培養は、実験の前にマイコプラズマ汚染について試験される。この例では、細胞は(A207K)mEGFP-FGFR1プラスミドでトランスフェクトされ、基準細胞は標準プロトコルを用いてGPI-(A207K)mEGFPおよびGPI-(A207K)mEGFP-(A207K)mEGFPプラスミドでトランスフェクトされる。生細胞顕微鏡では、インジケーターフリーの培地をお勧めします。イメージング中のpH変化を防ぐために25 mM HEPESバッファが追加されます。

2. TIRFイメージング — レーザーラインのアライメントとTIRF照明の最適化

  1. 実験の4時間前に、顕微鏡の温度インキュベーターを37°Cで活性化する。
  2. 顕微鏡、コンピュータ、カメラの電源を入れ、カメラが適切な作業温度に達するのを待ちます。
    注:本研究で使用したカメラの動作温度は-75°Cです。
  3. 目的に油を少し滴置きます。サンプル皿を所定の場所に置きます。インキュベーターのドアを閉め、皿の温度を平衡化させます(約10分)。
  4. エピ蛍光ランプと488 nmレーザーをオンにします。
  5. エピ蛍光コントラストモードを選択してサンプルを探索し、眼から焦点を合わせる細胞を検索します。
    注:眼のトラフを細胞を探索するための蛍光灯の使用は必須ではありません。代わりに適切なレーザーラインを使用することができます。
  6. 顕微鏡カメラ(バンドパスEx 490/20(500)バンドパスEm 525/50、または同様の)を介して緑色の放出を収集するための適切なフィルタを選択します。
  7. エピ蛍光モードで眼からカメラポート(図1のカメラ#1)に切り替え、フォーカスを調整してTIRFモードに変更します。エピ蛍光およびTIRFモードは、顕微鏡のブランドに応じて異なる命名法で命名することができる。
    注:カバースリップインターフェースに蛍光マーカーがない場合は、レーザーの焦点合わせや位置合わせに問題がある可能性があります。レーザーを適切に位置合わせするには(良好なTIRFに不可欠)、カバースリップに焦点を当てます。カバースリップに焦点が合っているかどうかを判断することは非常に困難な場合がよくあります。提案として、セルの端に焦点を当てます。
  8. TIRF顕微鏡の指示に従って自動整列を有効にします。
    注:簡単に説明すると、2.4から2.8までのステップでは、まず眼を通して細胞を見つけて焦点を当て、次にTIRF顕微鏡のカメラポートに発光を送り、顕微鏡コンピュータ画面に細胞を再焦点を合わせ、レーザーアライメントの手順を有効にします。アライメントは、イルミネーションがエバネッセントになる臨界角度を見つけることです(図3)。商業顕微鏡はわずかに異なるアライメントプロトコルを有し、また完全に自動化される可能性があります。他の人は、臨界角条件の視覚化を容易にするための小さなカメラを持っているかもしれません。
  9. 適切な照明深さを選択し、エバネッセントフィールドの方向を最適化します(図3)。
    注:浸透深さは、すべてのコントロールとサンプルに対して一定に保たれます。

3. TIRFイメージング:時系列のキャプチャ

  1. 256 x 256 ピクセル以上の対象領域 (ROI) を定義します。
    注:この設定では、カメラのみを直接制御するソフトウェアの下でカメラ #2でキャプチャが行われます (図 1 の凡例を参照)。
  2. 露出を 1 ミリ秒、EM ゲインを 1,000 に設定します(これは eq. 12 および 13 の G 係数です)。このような速度では、レーザーパワーを調整または増加させる必要があるかもしれません。ここでレーザーパワーは0.5 mWです。
    注:カメラの種類とタンパク質の拡散係数、蛍光強度、背景によって課される制限に応じて、レーザーパワーを設定するための一般的な基準は、検出器を飽和させ、光漂白を最小限に抑え、次のようにキャプチャすることではない。合理的なS/Nで可能な限り速く。EM ゲインは常にカメラの最大値に設定されます(「はじめに」を参照)。
  3. 初期条件下で最初のトライアル シーケンスを実行し、S/N 値を大まかに見積もります。条件は、最初の時系列の最初のフレームで測定された S/N = 2-3 以上で許容されます。
  4. カメラ #2を顕微鏡に接続する発光分割システムのスライダーを使用して、画像の側面をマスクします(図1B、図4A-B)
    注:このセットアップでは、マルチチャンネルイメージングコネクタをカメラ#2に設置し、2つの空間的に同一の画像を同時に取得できるようにします。システムは異なった放出フィルターを取付けるためのスライドが装備されている。スライダの 1 つは、イメージの側面を覆うために黒いマスクを取り付けます。マスクされた領域は、各時系列の内部キャリブレーションに使用され、カメラパラメータ(eq. 12およびeq. 13)を決定する。このようにして、独立したキャリブレーションステップは不要であり、重要なことに、キャリブレーションは各時系列のキャプチャと並行して行われます。このシステムがない場合、カメラは公開されたプロトコル33を適用して較正することができる。
  5. カメラファイルの自動保存オプションを選択します。
  6. 画像シリーズの取得を開始します。最低S/N比2で最低700フレームを取得します。
    注:分析に必要なフレームの数は、光脱白に対するサンプルの安定性とデータの分散によって異なります。したがって、各時系列の品質は、N&B 分析中に評価されます。
  7. 顕微鏡から皿を取り出さずに、リガンドを加えます。
  8. 明るい蛍光膜を持つ細胞を選択し、すぐに運動学的実行の最初の時系列を開始します。
    注:リガンドの添加が迅速に行われる場合、この最初の捕捉は、リガンド動態の点=0時間を設定する。ソフトウェアは、キャプチャの正確な時間を登録します。
  9. 2 番目のセルを検索し、動力学の 2 番目の時間ポイントを取得します。
    注:ポイント訪問ルーチンはX,Y,Z電動段階が装備されているいくつかの顕微鏡で利用できる。これらは、細胞皿上の複数の位置の暗記を可能にし、異なる細胞上の画像系列間のより一定の時間間隔を維持するのに役立ちます。
  10. キネティックランの各時点の新しいセルをキャプチャします。
    注:キャプチャ後、セルは部分的にフォトブリーチされ、再画像化することはできません。このため、動力学は、多くの細胞の時系列を組み合わせることによって得られ、それぞれが異なる時点で捕捉される。
  11. 新しい料理ごとに、手順 2.3 から 3.9 のプロトコルを繰り返します。
    注:参考料理の場合は、リガンドに使用した車両と同等の量の車両(0.01%ウシ血清アルブミンを添加)を追加します。

4. 数値と明るさ(N&B):時系列の品質チェック

  1. 変換して 名前を付けて保存します。カメラ ソフトウェア (この例では .sif ファイル) で取得したファイルを TIFF します。
  2. インポート。N&B グラフィカル ユーザー インターフェイス (GUI) MATLAB をアクティブにして、分析ソフトウェア ルーチン内の TIFF ファイルを作成します。
    注:カスタマイズされた Matlab 実行可能 N&B ルーチンがここで使用されます (https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologiaでの N&B 分析)。インポートした を開く。TIFFファイルは、ルーチンが平均強度画像、平均強度プロファイルを生成し、フレームごとにシリーズフレームを検査することを可能にする(補足図1)。その他のソフトウェアは、N&B分析(SimFCSソフトウェアなど)に利用できます。
  3. 平均強度プロファイルが10%以上の光脱白を示す廃棄系列と、取得時に明らかな細胞膜歪みまたは翻訳があったシリーズ。
  4. 明らかに焦点が合っていないフレームをトリミングします。
    注:トリミング ツールは、イメージ シリーズ内の 1 つまたは複数のフレームを破棄するルーチンに実装されています。この操作は、フレーム間の時間が重要でないのに対し、ピクセルの住み込み時間 (露出時間) が重要であるために許可されます (ディスカッションを参照)。
  5. 少なくとも 500 時間枠の解析系列のみを保持します。

5. 数値と明るさ(N&B):カメラパラメータ(オフセット、σ、S)の決定

  1. ルーチンキャリブレーションカメラをアクティブにします。
  2. 検出器ノイズ領域で少なくとも20 x 50ピクセルの領域を選択します(図4)。
    注:ルーチンは、値のヒストグラム(デジタルレベル、DLも定義)を生成し、周波数対デジタルレベルの対数プロットを返します。
  3. 対数周波数対デジタルレベルプロットで、線形赤カーソルを移動してガウスと曲線の直線部分を区切ります。
    注:赤いカーソルは曲線の2つのセクションを分割し、カメラ応答のガウス関数の中心であるオフセット、ガウスフィットのσ、およびカメラのリコンポーズの直線部分の傾きであるS因子を返すルーチンをアクティブにします。e (図 4C-D)

6. 数値と明るさ (N&B): 選択した対象地域 (ROI) における B 値の計算

  1. Bキーをアクティブにします。
    注:このアクションは、平均強度イメージ(図5、最初の列)と、個々のB値が画像内の関連ピクセルに関連付けられているBイメージを生成します(補足図1)。
  2. 最小ビン分割(2 2)を適用してデータの分散を減らし、B-Iヒストグラムを生成します(図5、2列目)。
    注:B-I ヒストグラムは、画像のすべてのピクセルとピクセル強度の B 値の分布を表します。Y = B/S;X = ( - オフセット)/S (補足図 1および eq. 11 および 15)。
  3. インタラクティブな正方形カーソルを使用して、B-Iヒストグラムを検査します。
  4. 分析用の正方形 ROI を選択します (図 5、3列目)。
    注:カーソルは、平均強度イメージ上のモバイル マスクを同期し、正方形のカーソル領域内で選択されているピクセルを強調表示します (補足図 1)。この検査により、非常に強度の低い背景や領域を解析から除外することができる。
  5. 選択した ROI の B マップを生成します (図 5、4列目)。
  6. 選択範囲に関連付けられた B 値の ASCII ファイルを保存します。
  7. グラフィックソフトウェアにASCIIファイルをインポートしてデータの周波数分布を計算し、平均B値±S.E(図5、5列目)を取得します。
    注:データが均質な場合、B値の周波数分布はガウス分布に近似します。
  8. eq. 15 を適用して、キネティックランの各時点における各セルの平均輝度 = - 1 [(カウント/分子)]を各セルに導出します。次の方法に従ってデータを正規化します。

    ここで、リガンド添加後の時間「t」で測定した平均B値、及び時間t=0(リガンド添加後10〜20s)で測定した平均B値である。
    注:結果の正規化により、異なる日に行われる実験の直接比較が可能になります。レーザーパワーや技術的な変動による測定された明るさの違いを補正します。
  9. 正規化平均輝度と集録時間をプロットして、運動ランを構築します(図6)。

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Representative Results

同じ培養皿に播種された2つの代表的なHeLa-mEGFP-FGFR1細胞の結果を図5および補足表1に示す。2つの細胞は、FGF2リガンドを添加した後、時間0分(図5A、上)および7分(図5A、下)で捕捉した。

図5はまた、純粋なモノマー、GPI-mEGFP(図5B、上)、または共有結合二量体蛍光色素、GPI-mEGFP-mEGFP(図5B、底部)のいずれかを発現する2つの代表的なHeLa細胞の結果を示す。)を細胞膜で露出し、同じ実験条件下で捕捉する。

HeLa-mEGFP-FGFR1細胞の平均見かけ輝度Bは、1.070 ± 0.001 S.E.から1.141 ± 0.001 S.E.に増加するのに対し、参照モノメリック(図5B、上)および二量体(図5B、下)サンプルはBを返す値はそれぞれ 1.070 ± 0.001 S.E. と 1.141 ± 0.001 S.E.したがって、比較すると、FGFR1受容体は、開始時に細胞膜表面の単量体形態を主に存在するが、その正規リガンドFGF2による刺激時に優勢な二量体状態に向かって進行する。その後平均して、2つの代表細胞におけるFGFR1分子の流行状態は明らかに異なる。

同じ皿の複数の細胞に分析を適用することにより、それぞれが異なる時点で捕捉され、時間の関数としての平均輝度が得られる(図6A)。図 6のキネティックランは、細胞表面で数分間持続する二量体化の遅いプロセスを示しています。FGF2誘導FGFR1二量体化とその後の受容体の内在化は、よく知られた機構34である。したがって、結果はFGFR1シグナル伝達に関する現在の概念と完全に一致し、微妙な決定までの細胞膜タンパク質のオリゴマー化を研究するためのTIRF-N&Bアプローチの可能性を確認するモノマーダイマーダイナミクス。

結果の正規化された平均輝度解析は、同じ受容体に対する異なるリガンドの効果を比較するための適切なツールである。図6Bに 1 つの例を示します。プロトコルは、同じ標準を使用して繰り返し、非正規FGFR1リガンド、NCAM-Fc(50μg/mL)で細胞を刺激した。この場合、運動プロファイルは、オリゴマー混合物中の受容体の速く、周期的な遷移を明らかにし、これもダイマーのそれより上の明るさの値に達する。正規化された平均値 3 が繰り返し観察されます。しかし、N&B分析の限界(強度変動と時間の2つの瞬間のみが考慮される)は、間違いなく三量体形態の形成を実証することはできません。同じ正規化された平均輝度は、受容体のより大きなオリゴマーおよびモノマーの様々な組み合わせの結果であり得る。しかし、結果は、同じ受容体に対する2つのリガンドの効果の時空間的な違いを明確に示している。

Figure 1
図 1: 実験プロトコルの概要(A)細胞はガラス底皿にめっきされ、蛍光タグ付き受容体でトランスフェクトされる。(B)時系列画像は、TIRF 100x 1.46オイル目的およびインキュベーターチャンバーを装備した市販のTIRF顕微鏡で撮影されます。この商用セットアップでは、ソフトウェアは、組み込みのEMCCDカメラ#1がN&B時系列の取得に必要な非常に短い露光時間で動作することを許可していません。露光時間は捕捉できる分子拡散の範囲を制限するので、これは重要なポイントです。露光時間が短いほど、分析できる分子拡散が速くなります。0.5~1msの暴露は膜タンパク質拡散に十分に速い。したがって、2台目のEMCCDカメラ(#2)を顕微鏡の追加ポートに追加し、顕微鏡ソフトウェアをバイパスしてカメラソフトウェアの直下で動作します。この適応された構成では、顕微鏡ソフトウェアおよびカメラ#1はTIRFの位置合わせのためにのみ使用される。TIRF時系列は、1ミリ秒などの非常に短い露光時間と最大EMゲインで動作するカメラ#2を使用して取得されます。カメラ#2はまた、画像のオーバーサンプリングとビン分割を可能にする124 nmのピクセルサイズを持っています(プロトコルセクション6.2を参照)。異なるTIRF顕微鏡の特性に応じて、画像化速度を得るための他の構成は可能であるが、sCMOSカメラの使用は推奨されないが、画像35ではノイズがランダムではないからである。(C) キャプチャ後、時系列を品質チェックとして検査します。光脱色が10%を超えると、平均フレーム強度とフレーム数をプロットして決定できるため、系列は廃棄されます。系列は、取得中に細胞膜の明らかな歪みまたは細胞の翻訳があった場合にも廃棄される。(D) 各ピクセルの平均強度が保存されます。(E)見かけの明るさを表すB-Iヒストグラム、B、画像の各画素中に生成される。(F) B-I ヒストグラムは、背景の上にある ROI を選択するために使用されます。(G) B値の周波数分布を分析して平均B値±S.E.を決定します。

Figure 2
図 2: N&B の原則N&Bは、「K」画像の時系列の取得中に照明体積を出入りする際に発生する蛍光変動を測定することにより、蛍光色素の平均オリゴマー化状態を定量化します。変動の振幅は、変動する信号の分散とσ2と平均強度値の比を計算することによって統計的に特徴付けられます。最も単純なシナリオ (A) では、照明音量が空の場合 (すなわち、蛍光度がない)、この比率は計器ノイズを表します。蛍光シグナルが移動性蛍光色素(B,C)によって変動する場合、「余分な」分散は、拡散分子の分子輝度、ε(分子当たりおよび毎秒検出されたフォトン数)に正比例する。(B)において、8個の単量体拡散性蛍光色素および(C)において、2つの四量体オリゴマーと同じフルオロフォア拡散物である。この2つの場合、平均強度は同じですが、変動の振幅が異なるため、標準偏差と明るさが異なります(1ε,4ε)。ε = 蛍光管が不動または不在の場合は 0。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:TIRF顕微鏡N&Bは、マルチフォトン、連続波またはパルス単一光子レーザーとアナログまたは光子計数検出器を搭載したラスター走査顕微鏡と同様に動作しますが、TIRF顕微鏡は分子動力学の高速時間イメージングに最適です。他のイメージング技術では実現できない速度、分解能、信号/ノイズ比(S/N)でセル表面またはその近くで発生するイベント。(A)TIRF顕微鏡は、角度付き励起レーザー光がカバースリップのガラス水界面のすぐ下にある蛍光色素のみを励起する全内部反射の原理を採用しています。レーザーは、励起レーザー光が完全に反射されているのに対し、光率が屈折の臨界角以上の発生角で検体を照射します。反射は、エバネッセント波と呼ばれる標本に非常に薄い電磁界を発生させる。得られた蛍光灯は、試料の小さな照らされた部分によって放出され、スライドの下に垂直に配置された顕微鏡目的を介して収集される。(B) パネルは、エバネッセント場と深さの相対的な強度の所定の波長で代表的な例を示し、表面からの距離の増加に伴って指数関数的に減少し、高い軸分解能蛍光を提供する画像。横向きの解像度は、目的の開口数と倍率、および検出カメラのピクセルサイズによって設定されます。細胞内部は照らされず、細胞内自己蛍光によるシグナルに寄与しません。マルチアングルTIRF顕微鏡は、様々な浸透深さを選択することができます。それらは励起の波長に依存するスケールを提供し、通常単色TIRFイメージのための70 nmから250 nmの深さまで行く。このプロトコルに対して選択されるエバネッセント照明深さは110nmであり、低レーザーパワーを使用する必要性と浸透深さの減少に伴って急激に減少する蛍光信号の強度との間の妥協の結果である。フルオロフォアの細胞内小胞および細胞内集団を多く照らすことができる過度に大きなエバネッセント場を避けることは重要である。したがって、サンプルの種類に応じて、いくつかの浸透深度を探索し、最良の組み合わせを探す必要があります:高信号対雑音比、低励起力、短い露光時間、短い浸透深さ。この最適化が完了すると、すべてのコントロールとサンプルの浸透深さが一定に保たれます。(C)エバネッセント場の深さと方向のソフトウェア誘導最適化後のHeLa-GPI-mEGFP細胞の代表的なエピ蛍光およびTIRF画像。マルチアングルTIRF顕微鏡はまた、エバネッセントフィールドの方向を最適化することができます。このステップは、散乱を最小限に抑えるために推奨される(すなわち、強度の急激な増加と鮮明な画像の少ない)、および使用される特定の顕微鏡の指示に従って行うことができる。このプロトコルでは、顕微鏡ソフトウェアは、エバネッセント場の方向の自動最適化を含む。手動による最適化については、公開されたプロトコル36,37を参照してください。(D)エピ蛍光およびTIRF照明の最適化後にmEGFP-FGFR1構築物を発現する代表的な細胞。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:時系列のキャプチャと単一の光子に対するカメラ応答のキャリブレーション(A) トリミングされたセンサモードのHeLa-mEGFP-FGFR1セルにキャプチャされた700フレームの時系列のうち最初のフレームの例。カメラチップは、TIRF顕微鏡に取り付けられたデュアルビューコネクタを使用して部分的にマスク(赤い長方形)されます(図1B)。内部キャリブレーション領域は、平均強度画像(B)で認識され、対ログ周波数対デジタルレベル(D)をプロットしてカメラパラメータを推定するために処理される(C)。EMCCDカメラなどのアナログ検出システムは、フォトンカウントの代わりに光電流のパルスを検出し、フォトンパルス高さ分布は準指数です。分布の最初の部分は、アンプとアナログデジタルコンバータによるもので、ガウス読み出しノイズ(信号記録によって生じる分散)に寄与します。分布の最も頻繁なチャネル(つまり、最も頻繁な値)はオフセット(eq. 13)です。 対数プロットで垂直カーソルを使用すると、分布の最初の部分が指数 250 DL を超えて分離され、1 つのフォトンに対する平均カメラ応答を表します(傾きは eq. 12 の S 係数です)。これらのパラメータの測定により、集録中に記録されるフォトンの密度を推定できます。カウント (DL) は疑似カラー スケールです。ピクセル サイズ = 124 nm;画像フォーマット= 256x256ピクセル、エバネッセントフィールド~110 nmの浸透深さ。キャリブレーション ROI #1 = 19x256 ピクセル。キャリブレーション ROI #2 = 5x256 ピクセルです。DL = デジタルレベル。露出 = 1 ミリ秒および EMゲイン (eq. 12、13、14 の G 係数) = 1000。なお、バックグラウンドでフォトンカウントモードで動作するカメラは、S=1(eq. 12)およびσ2dおよびオフセット(eq. 13)を有するアナログ検出器と同等であり、アナログシステム18の場合と同じ方法で測定される。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図5:FGFR1オリゴマー化のN&B分析(A)mEGFP-FGFR1を発現する同じ皿内の2つのHeLa細胞からの代表的な結果と、20 ng/mL FGF2を添加した後に0分(上)と7分(下)に捕捉し、(B)参照構造GPI-mEGFP(上)を発現する2つのHeLa細胞および GPI-mEGFP-mEGFP (下)解析シーケンス全体が示しています(左から右):時系列の平均強度。画像内の同じB値を有するピクセル数をカラーコードが表す蛍光強度の関数としてのすべてのB値のプロットは、目的領域(ROI)、背景(BG)および非常に低い領域を区切る長方形カーソル強度(LI)。不動蛍光体は変動がない場合は ε = 0 であるため、B 値 = 1 を与えることに注意してください。選択した ROI と関連する B 分布ヒストグラムの B マップ。B値分布にはガウス関数(赤い破線)が取り付けられ、平均見かけの明るさ、B(完全な赤い線)、分布統計量(補足表1)B値= B'=B/S(eq. 15)が計算されます。強度 = ( -オフセット)/S;M = モノマー;D = ダイマー;スケール バー = 10 ミクロン。補足ムービー 1、補足ムービー 2、補足ムービー 3、および補足ムービー 4の生データ時系列 。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 6
図6:リガンド活性化によって誘導されるFGFR1オリゴマー化の動態。20 ng/mL FGF2(A)または 50 μg/mL NCAM-Fc (B) を用いた刺激後の HeLa-mEGFP-FGFR1 細胞の正規化平均輝度 (eq. 16) によって記述される代表的な運動学的実行 。同じ皿中の細胞を増加した時点で捕捉し、見かけの平均輝度B±S.E.をB分布ヒストグラムから計算した。この図は、ザマイらの許可を得て、細胞科学雑誌(2019)31.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 7
図 7: 高速運動とデータの解釈HeLa-mEGFP-FGFR1細胞がNCAM-Fc(50μg/mL)またはFGF2(20ng/mL)のいずれかで刺激された反復運動ランから得られたすべての正規化平均輝度値の散布図。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Supplemental Figure 1
補足図 1: MatLab の分析ルーチンの画面スナップショット最初の分析ステップを示す N&B グラフィカル ユーザー インターフェイス (GUI) MATLAB ルーチンの画面スナップショット: アップロード時系列;平均強度画像、計算強度プロファイル、計算 B マップおよび B-I ヒストグラムを計算します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

パラメーター GPI-mEGFP GPI-mEGFP-mEGFP mEGFP-FGFR1 (時間 = 0') mEGFP-FGFR1 (時間 = 10')
ガウス平均 B 値 1.070 1.141 1.070 1.141
平均 B 値の S.E. 0.001 0.001 0.001 0.001
B-vaue分布のSD 0.059 0.067 0.077 0.075
平均B値の95%信頼区間 1.069 ~ 1.071 1.139 ~ 1.143 1.069 ~ 1.072 1.139 ~ 1.143
B値の95%信頼区間のS.D. 0.058 ~ 0.060 0.065 ~ 0.069 0.075 ~ 0.079 0.073 ~ 0.078
継ぎ手拘束 S.D. > 0 S.D. > 0 S.D. > 0 S.D. > 0
S.E. 標準エラー。S.D.標準偏差

補足表1:明るさ解析図5のB分布の統計及びガウスフィッティングパラメータを行った。最小二乗ガウス適合値は、X範囲が自動的に選択され、最大反復数 = 1000 で標準偏差 > 0 の制約の下で得られました。R二乗: mEGFP-FGFR1 モノマー = 0.9957, mEGFP-FGFR1 ダイマー 0.9940;GPI-mEGFP = 0.9985;GPI-mEGFP-mEGFP = 0.9970.

Supplemental Movie 1
補足ムービー1:時間におけるHeLa-mEGFP-FGFR1細胞の時系列=FGF2刺激後0分(0.01%BSAを補充したPBSでは20ng/mL)を図5に示す。シリーズ800フレームは7 fpsで非圧縮で再現されます。画像形式 = 256 x 256 ピクセル。ピクセル サイズ = 124 nm;内部キャリブレーション領域は暗い横バンドとして識別されます。このビデオを表示するには、ここをクリックしてください(右クリックしてダウンロードしてください)。

Supplemental Movie 2
補足ムービー2:HeLa-mEGFP-FGFR1細胞の図5に示す時系列は、FGF2刺激後7分(0.01%BSAで補完されたPBSでは20ng/mL)の800フレームを7fpsで非圧縮で再現した。画像形式 = 256 x 256 ピクセル。ピクセル サイズ = 124 nm;内部キャリブレーション領域は暗い横バンドとして識別されます。このビデオを表示するには、ここをクリックしてください(右クリックしてダウンロードしてください)。

Supplemental Movie 3
補足ムービー3:車両を添加した後のHeLa-GPI-mEGFPセルの図5に示す時系列(PBSは0.01%BSAを添加)。シリーズ1,000フレームは7 fpsで圧縮されずに再現されます。画像形式 = 256 x 256 ピクセル。ピクセル サイズ = 124 nm;内部キャリブレーション領域は暗い横バンドとして識別されます。このビデオを表示するには、ここをクリックしてください(右クリックしてダウンロードしてください)。

Supplemental Movie 4
補足ムービー4:車両を添加した後のHeLa-GPI-mEGFP-mEGFP細胞の図5に示す時系列(PBSは0.01%BSAを添加)。シリーズ1,000フレームは7 fpsで圧縮されずに再現されます。画像形式 = 256 x 256 ピクセル。ピクセル サイズ = 124 nm;内部キャリブレーション領域は暗い横バンドとして識別されます。このビデオを表示するには、ここをクリックしてください(右クリックしてダウンロードしてください)。

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Discussion

N&B では、セル モデルとラベリング戦略を選択する際に、いくつかの予防措置が必要です。画像のキャプチャ時間中に安定して付着したままの生細胞にのみ適用できます。セル全体の剛性変位による余分な変動は、適切な画像復元アプローチ38で処理され得る。しかしながら、一般に細胞が移動すると、細胞膜も変形し、構造変形が起き、大きな余分な分散を生じ、膜タンパク質の分析に重大な制限を生じる。この研究では、構成FGFR1は無視できるので、蛍光構築物はHeLa細胞株で発現される。構成タンパク質の存在は避けるべき条件であり、そうでなければ蛍光受容体オリゴマーと非蛍光受容体オリゴマーの混合集団が形成される可能性が高い。その結果、蛍光タグ付きタンパク質集団の明るさのみに基づくN&B分析は、平均オリゴマー状態の信頼性の低い推定を返します。この側面は、FGF2リガンドの存在下でFGFR1二量体化のような明るさが2倍だけ増加する受容体二量体化事象を検出するためにN&Bを適用する際に特に重要である。このような場合、混合ダイマーの存在は、N&Bによって検出可能な二量体化イベントを完全に隠すことができます。非蛍光構成形態を有する蛍光オリゴマーの汚染は、タグ付きタンパク質が大部分が過剰発現されない限り、蛍光の検出に基づくあらゆるアプローチの潜在的な落とし穴の1つである。しかしながら、タンパク質過剰発現の条件におけるオリゴマー化研究は、その機能的意義に対する懸念を提起する。一過性にトランスフェクトされた細胞は、蛍光の可変レベル(すなわちタンパク質濃度)を有する可能性が高く、N&Bは広い範囲に適用できるため、タンパク質濃度の平均輝度の独立性を試験するのに有用である。検出器の線形応答の条件下で濃度(明るさの定義を参照してください、eq. 1)。

もう一つの制約は、生細胞における安定な蛍光性を用いた受容体の表体標識である。ハロタグ、蛍光タンパク質(FP)または他の共有蛍光タグは、細胞内のタンパク質の分子当たりの結合蛍光色素の正確な数を得るために適切な標識である。N&B分析の複雑さを軽減するために、蛍光タンパク質またはハロタグのいずれかを使用して、1対1のフルオロフォアからタンパク質への標識を生成します。選択のFPは、成熟した形態で単量体でなければならない、そうでなければ、FPタグ付き受容体の人工オリゴマー化を誘発する可能性がある無視できる自己関連傾向を有する。このプロトコルでは、この単一点突然変異が前述の31、39、40に示すようにmEGFP自己凝集傾向を廃止するので、(A207K)mEGFPを使用する。標識戦略に関係なく、蛍光タグ付きタンパク質は、オリゴマー化イベントを結び付けるためにタグ付き分子の機能性が不可欠であるため、選択した細胞モデルにおける生物学的活性の保持をチェックする必要があります。受容体シグナル伝達。我々のモデルでは、受容体リガンドFGF231でトランスフェクトされた細胞を刺激した後の蛍光(A207K)mEGFP-FGFR1の自己リン酸化を証明した。

N&Bは、照明量中の分子の拡散に基づいています。デジタルカメラ検出では、露光時間(すなわち、アナログ検出における画素ドウェル時間、tドウェル)は、焦点体積中の粒子の1つの構成のみが捕捉されるほど短くなければならない。これは、露光時間中に蛍光体が照射された体積に出入りする確率が非常に小さいと言うことです。露光時間は、蛍光体が照らされた体積に費やす平均時間である蛍光性滞留時間(ƒD)よりも短くする必要があります。したがって、N&B実験を開始する前に、最初の近似で細胞内局在と分子量に依存する標的タンパク質の滞留時間(または拡散係数)についてある程度の概念を持つ必要があります。フレーム レートは、カメラがイメージを取得し、そのイメージを完全に読み取るのに必要な時間の逆数であり、多くの場合、総ピクセル数と読み出しレートからほぼ計算され、露出時間と組み合わせます。フレーム レートを高速にする必要はありませんが、サイクル時間 (tサイクル) はフレーム レートの合計と次のフレームのキャプチャを準備する時間の合計であり、解析に影響を与える可能性があります。これらの制約は、tサイクル>> ƒ D >> tdwellとして一般化できます。サイクル時間が速すぎると、分子はその時間内に 1 つのフレームから次のフレームに移動せず、不動 (B = 1) として表示されます。ただし、解析には何百ものフレームが必要なため、セルの変位やセル膜の歪みを避けるために、サイクリングはできるだけ速く設定されます(ピクセル数で画像形式を増減する)。シリーズの獲得中。このプロトコルの例では、最も遅いサイクル時間は 22 ミリ秒なので、500 フレームを 11 秒で取得できます。

分子の明るさは絶対量ではありません。これは、蛍光色素の分子特性(断面と量子収率)、実験的なセットアップ(検出器および光学)だけでなく、レーザーパワーなどの励起条件に依存します。したがって、TIRF-N&Bアプローチは明るさを生み出し、単声オリゴメリック状態の基準構造を表現する「参照セルモデル」を設定することが基本です。基準構築物は、研究中のタンパク質の同じ蛍光色素タグを運ぶ[here,、(A207K)mEGFP]と同じ細胞内コンパートメント(ここでは、形質膜)に局在する。本研究では、グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカー(A207K)mEGFPコンストラクトを使用し、同じフルオロフォア30で標識された細胞表面受容体の信頼性の高い単層輝度規格であることを繰り返し実証しています。31.

大きな欠点の1つは、同じ細胞が運動学的な走行中に繰り返し光にさらされたときに起こりそうにくい蛍光色素光脱色の発生であり、オリゴマー化状態の過小評価につながる。これを防ぐために、明るさ動態は、それぞれ異なる時点で捕捉された異なる細胞の平均輝度を組み合わせることによって得られる(図6)。これは、ペトリ皿では、各細胞は動力学の異なる時間ポイントであり、ペトリ皿はキネティックラン全体を表すと言うことです。

非正規リガンドによって誘発されるFGFR1オリゴマー化のようなオリゴマー化ダイナミクスが速く複雑な場合、NCAM31は、正規化された平均輝度対時間のプロファイルが可変かつ不安定になることがある(図6B).このような場合、正確な時点で反復皿を読み取ることで再現性を判断することはできません。これにより、再現性は、明るさ変化の運動プロファイルの類似性および振幅の観点から評価することができる。

結果の概要を図 7に示します。散布図は、同じ皿の細胞で測定された平均輝度のみを示し、各キャプチャの時間を無視します。このプロットでは、受容体のオリゴマー化状態に関する2つのリガンドによって引き起こされる大きな差は依然として明らかであるが、すべての運動情報は除去される。しかし、両方の実験セット(FGF2-対NCAM誘導オリゴマー化)の場合、図7の各実行の平均±S.D.を決定する従来のアプローチは、FGF2によって明確に刺激されたFGFR1分子であるため、誤解を招く結論につながるだろう2つのよく定義された状態にトランジットするのに対し、NCAMは、平均±S.D.値で十分に表されない不安定で周期的なオリゴマーFGFR1混合物を誘導します。

要約すると、実験的な観点から見ると、N&Bは高速集録モジュールと専用ソフトウェアを搭載した顕微鏡へのアクセスのみを必要とします。目的のタンパク質は、様々な単量体蛍光タンパク質または有機蛍光体でタグ付けすることができますが、定量的測定は、化学量論的標識、参照輝度標準、検出器のいくつかの条件を満たす必要があります。キャリブレーションとフォトブリーキングなし。この文脈において、N&Bアプローチは、生細胞内のタンパク質の時空間オリゴマー化を解読するための強力なツールです。さらに、統計的重み付け41を解決するために生データをリサンプリングし、蛍光相互相関分光法と相互相関N&B42を組み合わせることで、Nの適用性を精製・改善する最近の進歩タンパク質オリゴマー化と相互作用研究に対する&Bアプローチ

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Disclosures

著者たちは何も開示する必要はない。

Acknowledgments

CNICは、シエンシア省、イノバシオン・イ・ウニベルシダーデス、プロCNIC財団の支援を受けており、セベロ・オチョア・センター・オブ・エクセレンス(SEV-2015-0505)です。また、欧州地域開発基金(FEDER)「ウナ・マネラ・デ・ハーサー・エウロパ」の支援を受けています。UCは、アソシアツィオーネ・イタリアン・リケルカ・スル・カンクロ、国際がん研究協会(現在は世界がん研究)、イタリア保健省の支援を認めています。A.T.は、PVフェローシップ「プロゲット・プロイリタ・イヴァーノ・ベッキ」2011-2012で彼の作品を部分的にサポートした「フォンダツィオーネ・バンカ・デル・モンテ・ディ・ロンバルディア」を認めます。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Colour Fast TIRF Leica AM TIRF MC inverted microscope, with smi-automatic TIRF alignment. The microscope is equipped with a diode 488 nm laser, a 100x 1.46 oil TIRF objective, Ex/Em Bandpass filters at 490/20 and 525/50, temperature/CO2 incubator and Andor DU 8285 VP EMCCD camera. The microscope is operated by Leica LIF software. Leica Microsystems, Wetzlar, Germany
Albumin from Bovine Serum 98% minimun Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA A7906-100G
DMEM without Phenol Red with 25 mM HEPES GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA 21063029 Used serum free for microscopy
DMEM high-glucose GlutaMAX I GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA 10566-016 Used for complete medium
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10x (PBS) Biowest, Nuaillé, France X0515-500
Emission splitting system Photometrics DV2 TeledynePhotometrics, Tucson, AZ, USA
Fetal Bovine Serum, qualified, Brazil GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA 10270106 10% inactivated supplement for complete medium
Glass bottom 35 mm sterile 1.5 dishes MatTek, Ashland, MA, USA P35G-0.170-14-C uncoated, glass thickness 0.17 microns
GraphPad Prism GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA
Human cervical carcinoma (HeLa), serum-free animal component (AC) cells Millipore-Sigma ECACC, Darmstadt, Germany CB_08011102
iXonEM+ 897 EMCCD (back-illuminated) ANDOR camera controlled by ANDOR Solis software Oxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, UK This camera, installed in an additional port of the microscope, is used for acquiring the N&B time series
Matlab Executable N&B routine Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain download at https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia
MatLab v.2018b The MathWorks, Inc. Natick, MA, USA https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Penicillin:Streptomycin for tissue culture 100x Biowhittaker Inc. Walkersville, MD, USA LONZA 17-602E supplement for medium at Penicillin/Streptomycin 100 U/100µg.
pN1-mEGFP-FGFR1 expression vector Unit of Gynecological Oncology Research, European Institute of Oncology IRCCS, Milan, Italy Zamai et al., 2019
pN1-N-Gly-mEGFP-GPI expression vector Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain Hellriegel et al., 2011
pN1-N-Gly-mEGFP-mEGFP-GPI expression vector Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain Hellriegel et al., 2011
Recombinant FGF2 PeproTech EC, Ltd., London, UK Ligand solution: 20 ng/mL of FGF2 in PBS supplemented with 0.01%BSA.
Sodium pyruvate GIBCO ThermoFisher Scientific 11360070 1 mM supplement for medium
TransIt-LT1 Transfection Reagent MirusBio LLC, Madison, WI, USA MIR 2300
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA 25200056
Type F Immersion liquid 10 mL Leica Microsystems, Wetzlar, Germany 11513 859
UltraPure BSA (50 mg/mL) ThermoFisher Scientific AM2618 0.1% supplement for medium without phenol red used for transfections

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生物学 問題153 受容体クラスター N&B 数と明るさ モーメント分析 タンパク質オリゴマー 細胞膜 TIRF顕微鏡
数と明るさの分析と組み合わせた全内部反射蛍光顕微鏡による生細胞における細胞表面受容体のオリゴマー化ダイナミクス
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Zamai, M., Trullo, A., Arza, E.,… More

Zamai, M., Trullo, A., Arza, E., Cavallaro, U., Caiolfa, V. R. Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis. J. Vis. Exp. (153), e60398, doi:10.3791/60398 (2019).

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