Summary
يهدف هذا البروتوكول إلى إنشاء اوبيكييتين (Ub) و اوبيكويتين-أمثال (Ubls) بروتينيه محدده من أجل تحديد التعديلات من هذا النوع من التعديلات بعد الانتقالية (PTMs) ، المرتبطة بحاله معينه مثل العلاج أو النمط الظاهري.
Abstract
اوبيكويتين (ub) و اوبيكويتين (ubl) تعتمد التعديلات بعد الانتقالية من البروتينات تلعب الأدوار التنظيمية البيولوجية الاساسيه داخل الخلية عن طريق التحكم في استقرار البروتين ، والنشاط ، والتفاعلات ، وتوطين الخلايا. فهي تمكن الخلية من الاستجابة للإشارات والتكيف مع التغيرات في بيئتها. التعديلات داخل هذه أليات يمكن ان يؤدي إلى حالات مرضيه شديده مثل امراض الأعصاب والسرطان. والهدف من هذه التقنية الموصوفة هنا هو إنشاء ملفات PTMs التابعة ل ub/ubls ، بسرعة ودقه ، من خطوط الخلايا المستزرعة. وتسمح المقارنة بين الملامح المختلفة التي يتم الحصول عليها من ظروف مختلفه بتحديد التعديلات المحددة ، مثل تلك التي يسببها العلاج علي سبيل المثال. يتم تنفيذ لينتيفيرال الخلية بوساطة لإنشاء خطوط خلايا مستقره التعبير عن اثنين من العلامات (6 له والعلم) الإصدار من المعدل (اوبيكويتين أو ubl مثل SUMO1 أو Nedd8). هذه العلامات تسمح لتنقيه اوبيكويتين التالي من البروتينات اوبيتاميناتيد من الخلايا. ويتم ذلك من خلال عمليه تنقيه من خطوتين: يتم تنفيذ أول واحد في ظروف التعتيم باستخدام علامة 6 له ، والثانية في الظروف الاصليه باستخدام علامة العلم. وهذا يؤدي إلى عزله شديده التحديد ونقيه من البروتينات المعدلة التي يتم تحديدها فيما بعد ونصف الكمية بواسطة اللوني السائل متبوعا بتكنولوجيا الطيف الكتلي (LC-MS/MS) الترادفية. يتيح التحليل المعلوماتي السهل لبيانات MS باستخدام برنامج Excel إنشاء ملفات تعريف PTM عن طريق القضاء علي إشارات الخلفية. وتقارن هذه التوصيفات بين كل حاله من أجل تحديد التعديلات المحددة التي ستدرس بعد ذلك بشكل أكثر تحديدا ، بدءا من التحقق من صحتها بواسطة تقنيات الكيمياء الحيوية القياسية.
Introduction
الطريقة المقترحة هنا مكرسه لدراسة PTMs بوساطة افراد الاسره اوبيكويتين من خلايا الثدييات مثقف من أجل تحديد التغييرات المحتملة المرتبطة بحاله معينه (العلاج ، والتمايز ، الخ). PTMs تمثل الخطوة الاخيره من تنظيم وظائف البروتينات1. في الواقع ، مره واحده التي تنتجها آلات الانتقالية ، ومعظم ان لم يكن جميع البروتينات الخضوع لأنواع مختلفه من PTMs التي تعدل نشاطها ، والتفاعلات الجزيئية ، والموقع داخل الخلايا1. من بين عدد كبير من PTMs هي تلك التي توسط من قبل عائله اوبيكييتين من البروتينات ، اوبيكويتين نفسها وجميع الأمثال اوبيكويتين ، لديها القدرة علي تنظيم جميع البروتينات الخلوية أو جزئيا الخلايا الدهنية2. لأنها هي نفسها البروتينات ، ويمكن ان تكون مترافقة مع بعضها البعض ، وتشكيل سلاسل متجانسة وغير متجانسة من طبولوجيا متنوعة ، كل المرتبطة بوظائف تنظيميه محدده2. هناك حاجه إلى أدوات لمحاولة فك وفهم هذه آلات المعقدة. تم تطوير العديد من النهج في جميع انحاء العالم ، وجود مزاياها وعيوبها الخاصة ، وهنا نقترح واحده مع أداء عاليه مناسبه للخلايا مثقف.
الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي دقتها. في الواقع ، يتم تحسين نقاء البروتينات المعدلة المعزولة بشكل كبير من خلال استخدام التوافقية اثنين من العلامات (6 له والعلم) والاجراء خطوتين ، التالي فانه هو أكثر انتقائية بكثير من الانصهار علامة واحده Ub/ubl3،4. ان وجود العلامة السادسة يتيح الخطوة الاولي لتنقيه الحالة بشكل كامل التالي تجنب اي تنقيه مشتركه للبروتينات التي تحتوي علي النطاقات الملزمة بالبالكامل أو البروتينات الأخرى الملزمة لتلك البروتينات. هذه هي مشكله تقنيه واجهتها العديد من النهج الأخرى علي أساس التقارب تنقيه البروتينات اوبيتامينيد باستخدام اما الأجسام المضادة المحددة5 أو جنبا بالترادف العناصر الملزمة (أنابيب)6. الأهم من ذلك ، فان هذه التقنية ليست متحيزة لصالح تنقيه نوع معين من العرافة ، كما انه يمكن ان يكون الحال بالنسبة لبعض النهج الأخرى ، لأنه تم تحديد كل من أحاديه وأنواع مختلفه من polyubiquitinations7. التالي ، وبمجرد العثور عليها ، سيكون من الممكن دراسة تغيير في الكل بمزيد من التفاصيل عن طريق النهج الكيميائية الحيوية القياسية من أجل التعرف علي النوع الدقيق من الرغبة المطلقة المعنية.
وأخيرا ، ميزه تقنيه أخرى من هذا البروتوكول هو استخدام لينتيفيروسيس ، التي بسهوله وسرعه يخلق مستقره خطوط الخلايا التعبير مع مستوي معقول من التعبيرات معدل الموسومة دون التدخل في السلوك الخلوي العادي.
في حين ان أحد الأدوار الهامه للإبداء هو استهداف البروتينات للتحلل البروتيني ، فمن المعروف الآن ان لديها العديد من الخصائص التنظيمية الأخرى للبروتينات المحتملة داخل الخلايا أو جزئيا1. زادت الرقم من هذا اعمال أكثر بالوجود من كثير [اوبيقوتين] مثل بروتينات, يشكل أسره البروتينات ينظم تقريبا كل خليه اليه1. تعديلاتها يمكن ان يكون لها تاثير جذري علي بيولوجيا الخلية ، ويمكن ان يؤدي أو المشاركة في الحالات المرضية8، مثل السرطان9. التالي ، هناك حاجه إلى أدوات لاستكشاف هذه المناظر الطبيعية الشاسعة وتحديد التعديلات المرتبطة بحاله مرضيه يمكن ان تكون بمثابه أهداف علاجيه جديده.
ويكرس هذا البروتوكول للخلايا في الثقافة لأنها تحتاج إلى ان تكون محوله للتعبير عن الخارجية الموسومة Ub/Ubl. وبمجرد إنشائها ، يمكن استخدام هذه الخطوط الخلوية المستقرة لتوليد ملفات Ubl من الثقافة في 2D أو 3D أو xenografts ، التالي توسيع أفق النماذج التجريبية المختلفة التي يمكن تطبيقها لدراسة لمحات PTMs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. توليد خطوط الخلايا مستقره التعبير عن 6His-العلم-Ubl
ملاحظه: الانتقال المشترك للخلايا 293T مع Pكونتيننت-6HF-Ubl ، pVSVG ودلتا-المساعد.
- اليوم 0: البذور 293T الخلايا في لوحه 6 حسنا للحصول علي 50-70 ٪ التقاء في اليوم التالي.
- اليوم الأول: شارك في transfect 50-70 ٪ متموج الخلايا مع مزيج من 1 ميكروغرام من Pكونتيننت-6HF-Ubl أو Pكونتيننت-GFP ، 1 ميكروغرام من pVSVG و 1 ميكروغرام من ناقلات دلتا المساعد ، وذلك باستخدام كاشف النقل وبروتوكول لإنتاج لينتيفيروس. بعد 6 ح من الانتقال ، تغيير المتوسطة إلى واحده جديده المقابلة للخلايا ان تكون محوله. بذور الخلايا التي سيتم توصيلها في 6 لوحه جيدا من أجل الحصول علي 10-20 ٪ التقاء في اليوم التالي (يوم بدء المحول).
- اليوم 2:24 ساعة بعد التحويل ، واستعاده المتوسطة التي تحتوي علي جزيئات لينتيفيرال وتصفيه باستخدام مرشحات 0.45 μm. إذا لزم الأمر ، أضافه المتوسطة الطازجة في هذه المرحلة من أجل إنتاج دفعه ثانيه من لينتيفيروسيس. استبدلت الوسط الخلايا ان يكون [ترنسفيد] (10-20% التقاء) بالواحدة يحتوي لينتيفيروسيس.
ملاحظه: يمكن الاحتفاظ لينتيفيرال المتوسطة في + 4 درجه مئوية لعده أيام قبل محول الوقود أو تخزينها في-80 درجه مئوية لأشهر. - احتضان الخلايا مع لينتيفيروسيس بين 24 h إلى 72 h في حاضنه القياسية (37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2) ، ومن ثم تغيير المتوسطة لمعيار واحد جديد. إذا كان ذلك ممكنا ، تحقق من التعبير GFP باستخدام مجهر فلوري مقلوب لتقييم كفاءه التوصيل: النسبة المئوية للخلايا المعبرة والمستوي النسبي للتعبير لكل خليه. إذا لم يتم الكشف عن فلوري ، انتظر 2-3 اضافيه أيام كتعبير قد يستغرق وقتا أطول اعتمادا علي نوع الخلايا ليتم محوله.
- إذا كانت السيطرة GFP ايجابيه ، وتنمو جميع الخلايا حتى وجود ما يكفي لتنفيذ السيطرة علي التعبير من 6HF-Ubl بواسطة المناعي ولطخه الغربية باستخدام مكافحه العلم الأجسام المضادة.
2. تنقيه مزدوجة من البروتينات المعدلة
ملاحظه: المخزن المؤقت 1:6 M Guanidinium-HCl ، 0.1 M Na2hpo4/الجناح2PO4، pH 8.0 ، 0.5 ٪ تريتون X-100.
العازلة 2:50 mM الجناح2بو4، 150 mm Nacl ، 1 ٪ Tween20 ، 5 ٪ الجلسرين ، pH 8.0.
العازلة 3:100 mM NH4hco3، pH 8.0.
- تحلل الخلية: مره واحده جاهزه ، وغسل الاطباق الثقافية علي الأقل مره مع المحلول الملحي الفوسفات مخزنه (تلفزيوني) في درجه حرارة الغرفة (RT) والمضي قدما إلى تحلل الخلية أو ، بدلا من ذلك ، فلاش تجميد في N2 السائل وتخزين في-80 درجه مئوية. لتحلل ، أضف 2 مل من المخزن المؤقت 1 لكل طبق 15 سم في RT. استخدام مكشطه خليه لاسترداد جميع لست] في أنابيب الطرد المركزي المخروطية 50 ml (حجم النهائي حوالي 20 مل).
- يتم فصلها ثلاث مرات لمده 30 ثانيه مفصوله وقفه دقيقه 1.
- طارد الطرد المركزي لست] في 15,000 x g لمده 15 دقيقه.
- نقل ماده طافي إلى أنبوب جديد باستخدام مصفاه الخلية (40 μm).
- تحديد تركيز العينات وضبط ، إذا لزم الأمر ، للحصول علي نفس الكمية من البروتينات ونفس الحجم. استخدام كميه إجماليه من البروتين بين 50 و 100 ملغ (10 اطباق مع قطر 15 سم ل MiaPaCa-2 الخلايا).
- أضافه Ni2 +-الخرز NTA ، وذلك باستخدام 2 μl من الخرز لكل 1 ملغ من البروتين.
- تدوير في 30 دوره في الدقيقة خلال 2.5 h في RT.
- بيليه الخرز في 500 x g لمده 5 دقائق.
- غسل الخرز مع 1 مل من المخزن المؤقت 1 ، ونقل العينات إلى أنبوب الطرد المركزي 1.5 mL ، ثم نقل الأنابيب علي الجليد. تنفيذ جميع الخطوات التالية علي الجليد أو في 4 درجه مئوية.
- يغسل مرتين مع 1 مل من الجليد الباردة العازلة 2 تحتوي علي 10 مم ايميدازول.
- إلى الوت ملزمه البروتينات ، أضافه 600 μl من العازلة 2 تحتوي علي 250 mM ايميدازول وتدوير ل 2 ح في 4 درجه مئوية.
- بيليه الخرز بواسطة طرد في 500 x g لمده 1 دقيقه نقل supernatants إلى جديد ، قبل تبريد ، 1.5 mL أنابيب وأضافه 50 μl من مكافحه العلم M2 الأجسام المضادة الخرز مترافق.
- تدوير في 30 دوره في الدقيقة ل 2.5 h في 4 درجه مئوية ، ثم يغسل 2 مرات مع 500 μL من المخزن المؤقت 2 ، ثم 2 مرات مع 500 μL من المخزن المؤقت 3.
- للهلاك النهائي ، أضافه 100 μL من المخزن المؤقت 3 التي تحتوي علي الببتيد العلم في 0.1 ميكروغرام/μL وتدوير في 4 درجه مئوية ل 1.5 h.
- أجهزه الطرد المركزي في 500 x g لمده 1 دقيقه ونقل supernatants إلى أنابيب جديده قبل تبريدها.
- خذ 10 ٪ (10 μL) لتحميل علي SDS-الصفحة وأداء تلطيخ الفضة من هلام للسيطرة علي نوعيه تنقيه. إذا كان تنقيه تبدو جيده ، وتحليل 90 ٪ اليسار من قبل LC-MS/MS.
3-تجهيز بيانات قياس الطيف الكتلي لتوليد لمحات من Ub/Ubls PTMs وتحديد الاختلافات الكبيرة بينها
ملاحظه: النتائج من تحليل MS تحتوي علي العديد من المعلومات بما في ذلك العدد الإجمالي من الببتيدات ، فضلا عن القيم منطقه الذروة (يعني من اعلي 3 الببتيد منطقه10) لكل بروتين المحددة في كل عينات. يمكن معالجه هذه البيانات باستخدام أرقام عدد الببتيد أو قيم منطقه الذروة أو كليهما. لحساب مع مناطق الذروة ، لان هذه القيم عاده ما تكون في نطاق 106، فمن الضروري تقسيمها بهذا الترتيب قبل تطبيق نفس الصيغ علي النحو التالي. وينبغي ان تظهر النتائج التي يتم الحصول عليها مع كل من منهجيات العد ارتباطا قويا كما هو الحال عاده. لكل بروتين محدد ، استخدم الصيغ التالية حيث:
القيم الببتيدات v1 
في عينه اوبيكويتين غير المعالجة (علي سبيل المثال ، Ub-المخدرات)
v2 القيم الببتيدات في Gemcitabine معالجه العينة اوبيكويتين (علي سبيل المثال ، Ub + المخدرات)
القيم الببتيدات k1 في عينه gfp التحكم غير المعالجة (علي سبيل المثال ، gfp-المخدرات)
القيم الببتيدات k2 في Gemcitabine معالجه عينه gfp التحكم (علي سبيل المثال ، gfp + المخدرات).
- التطبيع: تطبيع القيم بين الخلايا المعالجة بالمخدرات والخلايا غير المعالجة ل اوبيكويتين و GFP باستخدام الصيغ التالية. تطبيع v = V وتطبيع k = K.
V1 = v1. (∑ v1 + ∑ v2)/(2. ∑ v1) ؛ V2 = v2. (∑ v1 + ∑ v2)/(2. ∑ v2)
K1 = k1. (∑ k1 + ∑ k2)/(2. ∑ k1) ؛ K2 = k2. (∑ k1 + ∑ k2)/(2. ∑ k2) - أزاله الخلفية: باستخدام الصيغ التالية ، اطرح القيم في نموذج التحكم (GFP) من القيم في نموذج اوبيكويتين للحصول علي قيم معينه (V ' 1 و V ' 2) لكل بروتين تم تحديده في كلا الحالتين.
V ' 1 = V1-K1 إذا V1-K1 ≥ 0; V ' 1 = 0 إذا V1-K1 < 0
V ' 2 = V2-K2 إذا V2-K2 ≥ 0; V ' 2 = 0 إذا V2-K2 < 0 - الاختلاف (Var) من اوبيتاميويشن. للحصول علي درجه (بين-100 و + 100) للتغيرات الايجابيه والسلبية من PTMs الناجمة عن المخدرات ، استخدم الصيغة التالية التي يقسم الفرق بين قيم معينه من العينات المعالجة وغير المعالجة بمجموع جميع القيم ، بما في ذلك تلك الموجودة في السيطرة (لمعاقبه البروتينات التي حددت أيضا في السيطرة GFP) ، وتتضاعف ب100.
Var = (V'2-V ' 1)/(V1 + K1 + V2 + K2) * 100 ؛ -100 < Var < 100 ؛
الاختلافات أدناه-50 (قمع PTM) أو أعلاه 50 (التعريفي PTM) وعاده ما تعتبر كبيره. - الثقة (Conf). استخدم الصيغة التالية للحصول علي قيمه ثقة بين 0 و 100% ،:
Conf = ((V1 + V2)2/(1 + V1 + V2 + K1 + K2)2) * 100-100/(1 + V ' 1 + v ' 2) ؛ = 0 إذا < 0
القيم المذكورة أعلاه 50 عاده ما تعتبر واثقه. - للحصول علي توزيع الطف من قيم الاستقراء/القمع والنظر في كل من الاختلاف والثقة المعلمات ، ضرب Var و
conf القيم باستخدام الصيغة التالية حيث V Var و C conf
= SI (V2 > 0; (V2 * C2) ^ 2)/(10 ^ 6); (V2 * C2) ^ 2)/(10 ^ 6))
ملاحظه: كما قيم منطقه الذروة عاده أكثر دقه من العد الببتيد ، فمن الممكن استخدام برامج معينه والتي هي مكرسه لتفسير هذا النوع من البيانات مثل ساوس (https://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus) ، بعد توصيات الاستخدام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
توصيل خلايا الثدييات الثقافية لإنشاء خلايا GFP و 6HF-Ub التي تعبر عن
لإنتاج لينتيفيروسيس التي سيتم استخدامها في وقت لاحق إلى transduce MiaPaCa-2 الخلايا ، 70 ٪ متموج يشيك-293T الخلايا هي المشتركة مع كميه متساوية من المتجات الثلاثة ، Pكونتيننت-6HF-اوبيكويتين أو GFP/دلتا-المساعد/pvSvG. بعد 24 ساعة من الإنتاج ، يتم استرداد المتوسطة التي تحتوي علي جزيئات لينتيفيرال وتصفيتها. فمن الممكن في هذه المرحلة للسيطرة علي كفاءه النقل عن طريق التحقق من الفلورية الخضراء من GFP التعبير عن خلايا 293T علي المجهر المقلوب. وينبغي ان يكون بالقرب من 100 ٪ من الخلايا. يتم احتضان الخلايا miapaca-2 مع ماده طافي لينتيفيرال لمده 1 إلى 3 أيام. يتم التحكم في فعاليه لينتيفيرال لأول مره من خلال النظر في الفلوري GFP من الخلايا المحولة GFP (الشكل 1A اللوحة العليا). قد يختلف مستوي التعبير GFP من خليه إلى أخرى ولكن 100% منها يجب ان يكون فلوريا. وبمجرد الانتهاء من هذه السيطرة ، والتعبير عن العلم-اوبيكويتين يجب ان تكون أيضا السيطرة عليها. ويتم ذلك عن طريق تلطيخ المناعي باستخدام الأجسام المضادة للعلم (عاده M2 مونوكلونال) (الشكل 1لوحهالسفلي ). وهذا سيبين النسبة المئوية للخلايا المحولة ، التي ينبغي ان تكون 100 في المائة لضمان التعبير المستقر عن المقاطع المستقبلية لثقافة الخلية. من أجل السيطرة علي مستوي التعبير من العلم الخارجية-اوبيكويتين ، يتم تحليل لست] من خلايا محوله من قبل SDS-صفحه تليها لطخه الغربية مع الأجسام المضادة للعلم (الشكل 1ب). يمكن تجميد كلا الخطين الخلويين.
اثنين من الخطوات تنقيه والتحكم عن طريق SDS PAGE والفضة تلطيخ
وبمجرد التحقق من صحة الخطوط الثابتة المعبرة عن الخلايا ، يتم تضخيم كل من خلايا GFP و 6HF-اوبيكويتين حتى يتم الحصول علي ما يكفي من المواد من أجل المضي قدما في عمليه التنقية التي تتم علي خطوتين. فمن المستحسن للحفاظ علي نسخه احتياطيه من هذه الخطوط الخلوية كمخزون المجمدة في النيتروجين السائل من أجل ان تكون قادره علي ذوبان لهم عند الحاجة. 36 h قبل المعالجة ، يتم التعامل مع نصف الخلايا (نصف GFP ونصف 6HF-اوبيكويتين) مع 10 μM من Gemcitabine. عندما تكون جاهزه ، يتم تنقيه البروتينات المطلقة من 6HF-اوبيكويتين ومن خلايا التحكم GFP ، وذلك باستخدام بروتوكول تنقيه من خطوتين (الشكل 2ا). يتم استخدام 10 ٪ من التملص النهائي للسيطرة علي كميه وسلامه المواد المنقية من قبل SDS-الصفحة والفضة تلطيخ من هلام (الشكل 2ب). يمكن استخدام نطاقات علامات الوزن الجزيئي لتقدير كميه البروتينات التي يتم تنقيتها. بدلا من ذلك ، يمكن تحميل كميه معروفه من جيش الصرب البوسني أو اي بروتين آخر في خط من هلام للمساعدة في تحديد كميه البروتينات المنقية. وبمجرد الانتهاء من هذا التحقق ، يتم تحليل المتبقية 90 ٪ من العينات بواسطة اللوني السائل إلى جانب قياس الطيف الكتلي للسماح بالتعرف علي البروتينات المنقية ونصف كمياتها.
تحديد البروتينات المطلقة بواسطة الخلفية (نماذج GFP) الطرح
وتعطي البيانات الماخوذه من تحليل العينات LC-MS/MS الأسماء والكميات (مناطق الذروة وعدد الببتيدات المرصودة) لكل بروتين محدد في عينات GFP و 6HF-Ub. البروتينات التي لديها اعلي كميه في العينة المطلقة بالمقارنة مع عينه GFP هي الأكثر احتمالا ان تكون التي اوبيتامينيد حقا وتطبيق الصيغ الموصوفة في الأساليب المذكورة أعلاه يسمح تصنيفها عن طريق إعطاء درجه الثقة من 0 إلى 100 ٪ . وتعتبر البروتينات التي تم تحديدها بدرجه اعلي من 50 في المائة منها (الشكل 3ا).
هذه الخطوة التي تزيل أساسا البروتينات الخلفية (GFP) من العينات اوبيكويتين أدت إلى تحديد 364 البروتينات اوبيتاميناتيد بشكل كبير (الشكل 3ب)7. لاحظ هنا ان البروتينات التي تم تحديدها باعلي الدرجات معروفه بالفعل باسم الأهداف الرئيسية للاباءه التي تثبت فعاليه طريقه التنقية هذه.
ثم من الممكن اجراء تحليل التخصيب مجموعه الجينات (gsea) من هذه البروتينات اوبيتاميناتيد من أجل تسليط الضوء علي العمليات البيولوجية التي يشاركون فيها (الشكل 3ج) ، وظائفهم الجزيئية ، وحجرهم الخلوية ، أو اي تصنيف آخر لعلم الجينات. ومن المثير للاهتمام للمقارنة بين هذه البروتينية اوبيتاميناتيد مع بروتينيه كامله من الخلية عندما يكون ذلك ممكنا. والواقع ان هذا التحليل يكشف عن المساهمة الحقيقية لهذه البروتينات المطلقة في عمليات محدده مثل الترجمة أو التحلل البروتيني علي سبيل المثال (الشكل 3ج).
والغرض الرئيسي من هذا النوع من التجربة هو التعرف علي التعديلات داخل البروتينية التي يسببها العلاج علي سبيل المثال ، هنا gemcitabine. عن طريق مقارنه اوبيتامينيتومي (البروتينية المحددة المطلقة) في الخلايا المعالجة وغير المعالجة باستخدام الصيغة المحددة تعطي قيمه من-100 (القمع من اوبيتاميتيوايشن) إلى + 100 (التعريفي من اوبيتاميويشن). النظر فقط إلى القيم الواردة أدناه-50 أو اعلي + 50 ، فقد تم التعرف علي ما مجموعه 73 من المطلقات المستحثة و 29 من المكائد المكبوتة (الشكل 4ا). كشف تحليل GSEA لهذه التعديلات من اوبيتاميتيويشن ثراء محدده في عمليات إصلاح الحمض النووي أو دوره الخلية ، والاختلافات الهامه في الترجمة والعمليات الايضيه RNA (الشكل 4ب). هذه النتيجة منطقيه للغاية منذ جيمسيتابيني هو التناظرية الاساسيه التي كتل تخليق الحمض النووي ويثير اضرار الحمض النووي.
للذهاب إلى ابعد من ذلك ، فمن المثير للاهتمام أيضا لاستخدام قواعد البيانات من البروتينات المتفاعلة من أجل استكشاف والتحقق من صحة الشبكات المتفاعلة المحتملة التي شكلتها التعديلات المستحثة جيمسيتابيني من اوبيتاميتيويشن (الشكل 5). وقد ادي ذلك إلى تحديد الشبكات المتفاعلة الوظيفية التي تاثرت بشده بزيادة أو نقصان البروتينات المعنية.
أخيرا, بين ال يغير [اوبيتمايشن], بعض يمكن تضمنت بروتينات من فائده [هيغست], واجبه إلى هم معروفه أو اعمال محتمله وفقا ل أدب. ومن ثم ، فان أحدي الخطوات الهامه هي التحقق من ان ما يلاحظه الطيف الكتلي حقيقي وجدير بالثقة. وكانت PCNA واحده من أكثر البروتينات الأكثرانتشاراعند المعالجة التي تم اكتشافها بواسطة تحليل قياس الطيف الكتلي (الشكل 4ا). للتحقق من ان جيمسيتابيني في الواقع يؤدي إلى البلى من pcna ، miapaca-2 الخلايا التي تعبر عن 6hf-Ub و gfp تزرع ، ومعالجتها ام لا ، وتخضع لتنقيه ني-NTA في ظروف التحريف أو لايمونوبريسيبيتيشن المناهضة للعلم تليها العلم الببتيد الشطف في الظروف الاصليه ، حلها علي صفحه SDS تليها لطخه الغربية مع الأجسام المضادة المقابلة. وأكدت النتيجة المبينة في الشكل 6 ان pcna في الواقع هو المطلقة بشده استجابه للعلاج جيمسيتابيني في خلايا miapaca-2.
الشكل 1: إنشاء خطوط خلوية مستقره تعبر عن 6 من العلم-Ubl. (ا) السيطرة علي التعبير gfp في الخلايا المحولة gfp (اللوحة العليا) و 6his-العلم-اوبيكويتين من قبل المناعي باستخدام المضادة للعلم (M2) الأضداد كالاساسيه و اليكسا-567 المضادة للماوس الأضداد الثانوية. تم استخدام DAPI للبقع النوى. شريط المقياس: 50 μm. (ب) السيطرة علي 6his العلم-اوبيكييتين التعبير في الخلية لست] بواسطة لطخه الغربية باستخدام مكافحه العلم الأجسام المضادة (بدلا من ذلك ، ويمكن استخدام المضادة لمكافحه 6his) علي اليسار ، ومكافحه الأجسام المضادة ، علي اليمين ، لمقارنه التعبير من 6 [ل]-علم-[اوبيقويتين] ([6 ف-اوبيق]) مع [اوبيقويتين] محليه ([اندو]. اوبيق). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تنقيه البروتينات المطلقة بخطوتين. (ا) التمثيل التخطيطي للاجراء. (ب) تعرضت 10% من التهرب النهائي لصفحه SDS متبوعه بتلطيخ اللون الفضي للهلام من أجل تقدير كميه البروتينات المعزولة ونقاءها (بالمقارنة مع gfp). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تحديد البروتينات المطلقة (المقتبسة من بوناكسي et al. 7). (ا) تم رسم الكمية النسبية من الببتيدات المحددة (العينة المطلقة) وغير المحددة (gfp) لكل بروتين تم تحديده في وظيفة من علاماتهم الواثقة. وكما هو مبين ، فان نسبه البروتينات غير المحددة التي تزيد علي اوبيتاميناتيد تصبح مهمة جدا دون النتيجة البالغة 50. التالي ، لا تعتبر سوي البروتينات المحددة مع درجه متفوقة علي 50 كبيره. (ب) الجدول الذي يبين 20 أفضل البروتينات المطلقة بين 364-المجموع المحدد. (ج) أعاده تقسيم البروتينات المطلقة والبروتينات الاجماليه لخلايا MiaPaCa-2 داخل العمليات البيولوجية (قيم > 1.5% تم النظر فيها فقط). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: التعديلات المستحثة لملفات PTM (المقتبسة من بوناكسي et al. 7). (ا) ادراج البروتينات العشرين مع اعلي زيادة (المجموع 73) أو انخفاض (المجموع 29) الترقيم المطلق علي العلاج جيمسيتابيني (Conf: الثقة; Ind: الاستقراء; مندوب: قمع). (ب) أعاده تقسيم Gemcitabine المستحثة التي تم تغييرها في العمليات البيولوجية والمقارنة مع عدم المعالجة. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: التفاعلات الوظيفية لل جيمسيتابيني المستحثة التي تم تغييرها. يتم التعرف علي التفاعلات المحتملة بين جميع البروتينات مع التغيير المستحث من جيمسيتابيني باستخدام قاعده بيانات تفاعلات بروتين البروتين (STRING: string-db.org). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: التحقق من صحة البيوكيميائية من جيمسيتابيني مثيره للاهتمام التي تسببت في التعديلات من اوبيتاميتيويشن. من أجل التحقق من الاعتماد المتزايد من pcna بعد العلاج جيمسيتابيني ، واخضع للخلايا التي تعبر عن 6hf-اوبيكويتين ، معامله أو لا مع جيمسيتابيني ، تعرضت لسحب النيكل إلى أسفل (ني-NTA) تليها وصمه عار الغربية المضادة pcna. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لقد وضعنا منهجيه قويه وموثوق بها لتوليد لمحات من البروتينات التي تم تعديلها من قبل أعضاء الاسره الرئيسية اوبيكويتين. في الواقع ، لقد نجحنا في تطبيق هذا البروتوكول لتوليد لمحات من PTMs من قبل اوبيكويتين ، وأيضا من قبل السومو و Nedd8 ، وللكشف عن التعديلات المرتبطة بالعلاج7، استجابه للتعبير أكثر أو ضربه قاضيه من جين معين (البيانات لا يظهر) وفي الخلايا التي اكتسبت النمط الظاهري المقاوم للادويه العلاج الكيميائي المتنوعة.
هناك فقط عدد قليل من الخطوات الحاسمة خلال الاجراء الذي يجب ان يكون المتلاعب حذرا مع. عند التنضيد من الخرز (ني-NTA أو المضادة للعلم إلى جانب) ، فمن المهم ان أعاده تعليق لهم تماما ، وخاصه الخرز المضادة للعلم منذ يتم تعليقها في العازلة التي تستند إلى الجلسرين اللزج ، وقطع قليلا نهاية غيض لزيادة القسم. وينبغي اتباع احتياط آخر هو ماصه ببطء من أجل تجنب التراص من الخرز. الخطوات الهامه الاضافيه هي التملص مع ايميدازول ثم مع الببتيد العلم. يجب ان تستخدم حقنه هاملتون نظيفه لاستعاده ماده طافي بعد التملص لتجنب, بقدر الإمكان الأنابيب من الخرز علي البروتينات غير المحددة التي لا تزال.
وتبعا لنوع الخلية وكميه المواد النهائية المطلوبة لقياس الطيف الكتلي ، يمكن زيادة أو إنقاص مواد البداية وفقا لذلك. ثم ، التعديل المهم الوحيد يكمن في حجم حبات النيكل كما ينبغي ان يكون من 2 μL لكل 1 ملغ من البروتينات في lysate. قد يحدث ان كميه البروتينات المنقية منخفضه جدا. وينبغي التحكم في مستوي التعبير من Ub/Ubl الموسومة ، وإذا كان منخفضا جدا ، يمكن أعاده محوله الخلايا باستخدام نفس لينتيفيروسيس. بدلا من ذلك ، فمن الممكن لزيادة كميه المواد البداية. في بعض الأحيان ، كميه المواد المنقية غير المحددة في GFP أو الخلايا الابويه مرتفعه جدا. حل واحد للتغلب علي هذه المشكلة هو زيادة حجم وعدد من يغسل في كل من الخطوات تنقيه النيكل والعلم. ومن الممكن أيضا لزيادة تركيز ايميدازول في يغسل مع العازلة جوانيداين, تصل إلى 20 مم. عكسيا ، فانه ليس من الضروري زيادة تركيز الببتيد العلم في الخطوة النهائية التملص لأنها لن تزيد من التملص. فمن الأكثر اهميه لاستخدام الببتيد الطازجة علي مر الزمن ، حتى لو كانت مخزنه في-20 درجه مئوية ، فان فعاليه الببتيد قد تنخفض.
الحد الرئيسي لهذا البروتوكول هو انها مناسبه فقط للخلايا مثقف لأنها يجب ان تكون محوله للتعبير عن المطلوب Ubl الموسومة. التالي ، اي دراسة عن الانسجه أو عينات الورم يجب ان يتم تنفيذها باستخدام نهج بديله مثل الببتيدات diGly ثراء بعد الهضم التريبسين11، ايمونوبريسيبيتيشن مع الأجسام المضادة الخاصة Ub/ubl من الفائدة5، أو استخدام أنابيب6. كل هذه الطرق البديلة هي أيضا مناسبه لتطبيقها في الخلايا المستزرعة. لديهم ميزه استخدام آلات Ub/Ubls الذاتية. ومع ذلك ، توجد عده عيوب. إيمونوبريسيبيتيشنز من الصعب القيام به مع خلفيه منخفضه ، ومثل أنابيب النهج ، والبروتينات التفاعل مع البروتينات المعدلة ، وحتى المعدل نفسه ، لا يمكن القضاء عليها ، علي الرغم من التحسينات العملية التي تم الحصول عليها باستخدام شروط أكثر صرامة. DiGly الببتيدات الإثراء هو تكنيك قويه جدا ولكن قد تتوافق مع نوع مختلف من PTMs. علي سبيل المثال ، فان إثراء diGly من الصباغ المهضوم التريبسين سيحدد البروتينات التي يتم التعرف عليها بشكل أساسي ، ولكن أيضا منها البروتينية ، كما Nedd8 يترك نفس التوقيع diGly بقايا كما اوبيكييتين لا11.
ومن القيود الأخرى علي هذا البروتوكول ان وجود العلامة 6 التي تحمل علمه قد يغير الوظيفة العادية لل Ub/Ubl وان التعبير المفرط في حد ذاته يمكن ان يغير اليه. هذا استطاع مثلا عرقلت الجيل من [بوليوبيقوتين] سلاسل وإحسان [مونوبيقويسايشن]. ومع ذلك ، نظرا لان كلا من سلاسل أحاديه متعددة و polyubiquitin قد تم التعرف عليها باستخدام هذا البروتوكول ، يبدو انه ليس هو الحال7. وجود العلامة في N-المحطة يمنع أيضا تشكيل الخطية المطلقة ، حيث يتم ربط المجاملات المطلقة معا عن طريق N-الطرفية ميثيونين من اوبيكويتين. ومع ذلك ، علي الرغم من ان 6HF-udiquitin لا يمكن ان يكون اوبيتاميناتيد علي بقاياه التقي الاولي ، فانه لا يزال لديه القدرة علي إنهاء هذا النوع من سلسله.
أيضا, بينما هو فائده جوهريه ان يستعمل لينتيفيروسيس اي يمكن الخلق من ثابته خلايا خطوط في واحده أو اثنان أسابيع, هو يمكن ان لا كل خلايا عبر عن ال ب رغب بناء. قد لا يكون هذا مشكله حقيقية لاجراء تنقيه طالما خلايا كافيه تعبر عن Ub/ubl الخارجية ، ولكن المشكلة قد تاتي مع الثقافة علي المدى الطويل كما علي عده مقاطع يمكن ان يكون هناك اختلاف النسيلي مع إثراء في الخلايا مع اقل أو لا التعبير. هذا العيب ، ومع ذلك ، يمكن تجاوزها بسهوله عن طريق استخدام لينتيفيروسيس التي تحتوي اما علي الجينات اختيار المقاومة أو بروتين الفلورسنت التي يمكن استخدامها في تدفق الخلوية لتحديد الخلايا الايجابيه فقط.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
وكان هذا العمل مدعوما من قبل La رابطه المكافحة السرطان إلى الجهد الحاد والماجستير ، والرابطة من أجل البحوث والسرطان إلى PS ، الانكا (معهد السرطان الوطنية) و Canceropole باكا إلى التنفيذ المشترك. مرفق الطيف الكتلي من البروتينات مرسيليا (marseille-proteomique.univ-amu.fr) بدعم من IBISA (البنية التحتية بيولوج Santé et Agronomie) ، الهضبة التكنولوجية ايكس مرسيليا ، والمركز الكبير ، بروفانس-ألب-كوت دازور ريجيون ، ومعهد باولي-كالميتيتس ، ومركز البحوث الخاصة بمرسيليا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma-Aldrich | A2220-5ML | binds all Flag tagged proteins |
| anti-Flag M2 antibody | Sigma-Aldrich | F3165 | to detect 6His-Flag tagged expression of ub/ubl |
| Cell strainer 40 µm | Falcon | 352350 | to remove floating pellet from guanidine lysed cells |
| Flag peptide | Sigma-Aldrich | F3290 | elute flag tagged proteins from anti-flag beads |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 50933 | chaotropic agent used to denature all proteins in cell lysate |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | eluates 6His bond proteins from Ni-NTA beads |
| Lipofectamine 3000 | ThermoFisher | L3000015 | to transfect HEK-293T cells to produce lentiviruses |
| Lobind tubes | Sigma-Aldrich | Z666491 | avoids absorption of precious material |
| Membrane Filter, 0.45 µm | Millipore | HAWP04700F1 | to filter the lentiviral supernantant |
| Ni-NTA | Qiagen | 30210 | purification of the 6His tag |
References
- Prabakaran, S., Lippens, G., Steen, H., Gunawardena, J. Post-translational modification: Nature's escape from genetic imprisonment and the basis for dynamic information encoding. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. , (2012).
- Hochstrasser, M.
- Kirkpatrick, D. S., Weldon, S. F., Tsaprailis, G., Liebler, D. C., Gandolfi, A. J. Proteomic identification of ubiquitinated proteins from human cells expressing His-tagged ubiquitin. Proteomics. 5 (8), 2104-2111 (2005).
- Peng, J., et al. A proteomics approach to understanding protein ubiquitination. Nature Biotechnology. 21 (8), 921-926 (2003).
- Matsumoto, M., et al. Large-scale analysis of the human ubiquitin-related proteome. Proteomics. 5 (16), 4145-4151 (2005).
- Hjerpe, R., Rodríguez, M. S. Efficient approaches for characterizing ubiquitinated proteins. Biochemical Society Transactions. 36 (5), 823-827 (2008).
- Bonacci, T., et al. Identification of new mechanisms of cellular response to chemotherapy by tracking changes in post-translational modifications by ubiquitin and ubiquitin-like proteins. Journal of Proteome Research. 13 (5), 2478-2494 (2014).
- Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (1), 29-46 (2011).
- Hoeller, D., Dikic, I.
- Silva, J. C., Gorenstein, M. V., Li, G. Z. Z., Vissers, J. P. C., Geromanos, S. J. Absolute quantification of proteins by LCMSE: a virtue of parallel MS acquisition. Molecular & Cellular Proteomics. , (2006).
- Kim, W., et al. Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome. Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).
