Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para realizar o isolamento e expansão de células mononucleares derivadas de citocinas derivadas de citocinas derivadas de citocinas induzidas por citocinas por cdinénsiainduzidas porcitocinas + CD56+ células assassinas e ilustrar seu efeito de citotoxicidade contra células cancerígenas hematológicas e sólidas usando um sistema de citometria de fluxo de diagnóstico in vitro.
Abstract
A imunoterapia celular adotiva se concentra na restauração do reconhecimento do câncer através do sistema imunológico e melhora a efetiva matança de células tumorais. A terapia celular T do assassino induzido por citocinas (CIK) tem sido relatada para exercer efeitos citotóxicos significativos contra células cancerosas e reduzir os efeitos adversos da cirurgia, radiação e quimioterapia em tratamentos de câncer. A CIK pode ser derivada de células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMCs), medula óssea e sangue do cordão umbilical. As células CIK são uma subpopulação heterogênea de células T com CD3+CD56+ e características fenotimétricas do assassino natural (NK) que incluem grande complexo de histocompatibilidade (MHC) atividade antitumorarestrita. Este estudo descreve um método qualificado, clinicamente aplicável, baseado em citometria de fluxo para a quantificação da capacidade citolítica das células CIK derivadas do PBMC contra células cancerígenas hematológicas e sólidas. No ensaio citolítico, as células CIK são co-incubadas em diferentes proporções com células tumorais alvo prestained. Após o período de incubação, o número de células-alvo são determinados por uma mancha de ligação com ácido nucleico para detectar células mortas. Este método é aplicável tanto a pesquisas quanto às aplicações diagnósticas. As células CIK possuem citotoxicidade potente que poderia ser explorada como uma estratégia alternativa para o tratamento do câncer após sua avaliação pré-clínica por um sistema de citometria e rastreamento baseado em cítometro (CS & T) sistema de citometria de fluxo baseado em CS & T.
Introduction
Linfócitos T citotóxicos são uma população específica de células de efeito imunológico que media as respostas imunes contra o câncer. Várias populações de células effectoras, incluindo células assassinas ativadas por linfokina (LAK), linfócitos infiltrados em tumores (TILs), células assassinas naturais (NK), células γδ T e células assassinas induzidas por citocina (CIK) foram desenvolvidas para fins adotados de terapia celular T (ACT)1. Há um crescente interesse em células CIK, porque elas representam uma mistura de populações de células citotóxicas induzidas por citocinas expandidas a partir de células mononucleares sanguíneas autologos periféricas (PMBCs)2.
O crescimento descontrolado de células progenitoras linfoides, mieloblastos e linfoblastos leva a três tipos principais de câncer de sangue (ou seja, leucemia, linfoma e mieloma), tumores sólidos, incluindo cancerígenos (por exemplo, câncer de pulmão, câncer gástrico, câncer cervical) e sarcomas, entre outros cânceres3. As células CIK são uma mistura de populações celulares que exibem uma ampla gama de grandes atividades antitumorais (MHC)-irrestritas e, portanto, mantêm a promessa para o tratamento de tumores hematológicos e avançados4,5,6,7. As células CIK compreendem uma combinação de células, incluindo células T (CD3+CD56−), células NK-T (CD3+CD56+) e células NK (CD3–CD56+). A otimização do protocolo de indução CIK usando um cronograma fixo para aadição de anticorpo IFN-γ, anti-CD3 e IL-2, resulta na expansão das células CIK8. A capacidade citotóxica das células CIK contra células cancerígenas depende principalmente do engajamento do membro do grupo NK D (um membro da família receptora tipo C) ligands NKG2D em células tumorais, e em caminhos mediados por perforina9. Os resultados de um estudo pré-clínico revelaram que as células CIK estimuladas pelo IL-15 induziram citotoxicidade potente contra linhas de leucemia mielóide primária e aguda in vitro e apresentaram menor aloreatividade contra PBMCs normais e fibroblastos9. Recentemente, foipublicadoa infusão do resultado da infusão de CIK derivado de doadores saudáveis (1 x 108/kg de CD3+ células) como consolidação após transplante aloloablativo não mieloiático para tratamento de neoplasias mielóides em um estudo clínico de fase II .
No presente estudo, desenvolvemos uma fórmula de cultura celular otimizada composta por IFN-γ, IL-1α, anti-CD3 e IL-2 adicionadoao meio de células hematopoiéticas para aumentar a produção de CIK, e investigou o efeito citotóxico das células CIK contra a crônica humana células de leucemia mielóide (K562) e células cancerígenas de ovário (OC-3).
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Protocol
O protocolo clínico foi realizado e aprovado de acordo com as diretrizes do Conselho de Revisão Institucional do Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Médica e Hospitalar da China. Amostras de sangue periféricas foram colhidas de voluntários saudáveis com seu consentimento informado.
1. Preparação de materiais
- Reagentes de loja, anticorpos e produtos químicos, como mostrado no Material Safety Data Sheet (MSDS). Dissolva as drogas ou citocinas em solventes como soluções de estoque e, em seguida, aliquot para armazenamento a -20 °C ou -80 °C.
NOTA: Informações detalhadas para preparação do material são notadas na Tabela de Materiais.
2. Isolamento PBMC
- Aqueça a solução de gradiente de densidade(Tabela de Materiais)a 18-20 °C antes do uso. Inverta a garrafa de solução várias vezes para garantir uma mistura completa.
- Colete 3-5 mL de amostra de sangue venoso humano em um frasco heparinizado e misture bem, invertendo suavemente o tubo várias vezes.
- Prepare 4 mL de solução de gradiente de densidade em um tubo estéril de 15 mL.
- Cuidadosamente camada 1 mL da amostra de sangue na solução de gradiente de densidade.
- Centrífuga a 400 x g por 30 min a 18-20 °C (desligue o intervalo).
- Cuidadosamente e imediatamente aspiraa a camada de casaco buffy de células mononucleares (cerca de 1 mL) ao mesmo tempo para evitar perturbar as camadas em um tubo estéril de 15 mL usando uma pipeta estéril de 1 mL.
- Adicione pelo menos 3 volumes (~3 mL) de soro soro tampão de fosfato (PBS) ao casaco polido no tubo de centrífuga. Suspenda as células canalizando-as suavemente para cima e para baixo pelo menos 3x com uma pipeta estéril.
- Centrífuga a 400 x g por 10 min a 18-20 °C. Aspirar o supernatante.
- Suspender a pelota celular com 5 mL de meio basal (Tabela de Materiais) e transferir para um frasco. Cultura as células em uma incubadora de cultura celular a 37 °C e 5% CO2.
3. Indução e expansão da CIK
- No dia 0, cultura os PBMCs (1 x106)em meio basal fresco contendo 1.000 UI/mL de IFN-γ por 24 h em uma incubadora de cultura celular umidificada a 37 °C e 5% de CO2.
- No dia 1, refresque o meio com meio basal fresco contendo 50 ng/mL de anticorpo anti-CD3, 1 ng/mL de RH IL-1α, e 1.000 U/mL de rh IL-2. Atualize o meio a cada 3 dias.
- No dia 7, refresque o meio com meio basal fresco contendo 1.000 U/mL de RH IL-2. Refrescar o meio a cada 3 dias até o fim da expansão celular (Dia 14).
4. Imunofenofetipagem para avaliação de células CIK
- Lave as células CIK com 10 mL de PBS estéreis. Centrífuga por 10 min a 300 x g e 18-20 °C, aspirando o supernatante, e resuspender as células com 10 mL de PBS. Conte o número da célula e a viabilidade da célula de teste usando o ensaio de exclusão azul trypan.
- Aliquot as células CIK em seis tubos estéreis de 1,5 mL a uma densidade de ~5-10 x 105 células/mL PBS. Rotular e tratar da seguinte forma: Tubo 1, Blank (sem anticorpo); Tubo 2, adicione 20 μL de isotipo IgG1-FITC; Tubo 3, adicione 20 μL de isótipo IgG1-APC mAbs; Tubo 4, adicione 20 μL de CD3-FITC; Tubo 5, adicione 20 μL de MAbs CD56-APC; e Tubo 6, adicione 20 μL de CD3-FITC e 20 μL de MAbs CD56-APC.
- Misture delicadamente as células CIK com os anticorpos, canalizando-as suavemente para cima e para baixo pelo menos 3x com uma pipeta estéril de 1 mL, e depois incubar por 30 min à temperatura ambiente no escuro.
- Centrífuga os tubos por 10 min a 300 x g e 18-20 °C. Aspirar o supernatante e suspender a pelota celular uma vez com 1 mL de PBS. Gentilmente, encane-os para cima e para baixo pelo menos 3x com uma pipeta estéril de 1 mL.
- Repita o passo 4.4.
- Deixe os tubos no escuro antes da análise citométrica de fluxo.
5. Reconhecimento de marcadores cd
- Transfira a suspensão da célula para um tubo inferior redondo de poliestireno estéril de 5 mL com uma tampa de filtro celular (malha de 100 μm) canalizando suavemente através da tampa. Coloque os tubos no carrossel em ordem.
- Abra o software de análise de citometria de fluxo e crie uma pasta experimental. Clique no botão Novo Espécime para adicionar uma amostra e tubo ao experimento e nomear os tubos da seguinte forma: Tubo 1, Em branco; Tubo 2, Isotype IgG1-CD3; Tubo 3, Isotype IgG1-CD56; Tubo 4, CD3; Tubo 5, CD56; Tubo 6, CD3CD56.
- Crie um sistema de dispersão para as populações de células CIK(Figura 2A).
- Selecione o Tubo 1 (Em branco) e clique no botão Dot Plot para criar um enredo FSC-A/SSC-A. Desenhe um portão retângulo sobre toda a população celular com um limiar FSC-A >5 x 104 para excluir detritos celulares.
- Selecione o parâmetro SSC-A/SSC-H para o novo lote de ponto e desenhe um portão de polígono em todas as células únicas. Selecione o parâmetro Count/FITC (CD3) e Count/APC (CD56) para o novo enredo de histograma, respectivamente. Selecione o parâmetro FITC (CD3)/APC (CD56) para o novo lote de pontos e desenhe um portão de quatro quadrantes para definir as quatro subpopulações.
- Registre os dados de 20.000 células individuais em cada espécime. Clique no botão Amostra de carga para analisar a amostra de controle em branco primeiro. Identifique toda a população de células CIK usando os parâmetros do canal CD56 e CD3.
- Repita o passo 5.3 para a investigação de todos os espécimes.
- Abra os arquivos contendo os valores estatísticos da amostra individual para analisar as populações de células CIK e reimprimi-los em arquivos de análise.
6. Culturing e coloração de leucemia mielóide crônica humana células K562 e células OC-3 de câncer de ovário
- Células K562
- Células Culturais K562 em mídia completa (meio basal RPMI contendo 10% de soro bovino fetal [FBS] e 50 antibióticos U/mL e ajustam a glicose a 4,5 g/L) a uma densidade de 0,5-1 x 106 células/mL em um frasco de cultura celular e incubam em uma incubadora úmida a 37 °C e 5% CO2.
- Transfira a mídia cultural contendo as células K562 para tubos estéreis de 50 mL e pellet as células a 300 x g por 10 min a 18-20 °C no dia do experimento.
- Aspirar o supernatante, resuspender as células em 5 mL de PBS estéreis, e misture bem suavemente.
- Pelotas as células a 300 x g por 10 min. Aspirar o supernatant, resuspender as células na PBS e ajustar as células K562 a uma concentração de 0,5-1 x 106 células/mL.
- Adicione 0,5 μL de tinantes CFSE à 1 mL de suspensão celular K562 em um tubo estéril de 15 mL a uma concentração final de 5 μM. Misture delicadamente a suspensão encanando para cima e para baixo pelo menos 3x.
- Deixe o tubo em uma incubadora de cultura celular a 37 °C e 5% DE CO2 por 10-15 min.
- Adicione 9 mL de PBS ao tubo e as células a 300 x g por 10 min. Decante o supernatante e, em seguida, suspenda a pelota celular em 10 mL de mídia completa. Transfira a suspensão celular para um frasco de cultura celular e coloque na incubadora.
- Células OC-3
- Células Culturais OC-3 em mídia completa (meio DMEM/F12 contendo 10% de FBS e 50 antibióticos U/mL) a uma densidade de 0,5-1 x 106 células em um frasco de cultura celular a 37 °C e 5% DE CO2.
- Aspirar a mídia cultural e lavar as células com PBS 1 dia antes do experimento.
- Desaqueasse as células adicionando 1 mL de solução de enzima de dissociação celular (Tabela de Materiais) e incubar por 5 min a 37 °C.
- Suspenda as células adicionando 5 mL de PBS e misture bem suavemente. Contasiar as células a 300 x g por 10 min e aspirar o supernatante. Resuspender as células em PBS e ajustar as células a uma concentração de 0,5-1 x 106 células/mL.
- Adicione 0,5 μL de tinantes CFSE a 1 mL da suspensão da célula OC-3 em um tubo estéril de 15 mL a uma concentração final de 5 μM. Misture delicadamente a suspensão encanando para cima e para baixo pelo menos 3x.
- Deixe o tubo em uma incubadora de cultura celular a 37 °C e 5% DE CO2 por 10-15 min.
- Adicione 9 mL de PBS ao tubo e as células a 300 x g por 10 min. Decante o supernatante e, em seguida, suspenda a pelota celular com mídia completa. Sementes 5 x 105 células/bem em uma placa de 6 poços e incubam em uma incubadora umidificada a 37 °C e 5% CO2 durante a noite.
7. Ensaio citotóxico
- Cocultura das células CIK e K562 (CIK-K562)
- Conte as células K562 a partir da etapa 6.1.7 e teste a viabilidade celular por ensaio de exclusão azul trypan. Adicione 1 mL de células K562 a cada poço em uma placa de 6 poços a uma densidade de 5 x 105/mL.
- Adicione 1 mL de média basal com ou sem células CIK da etapa 3.4 para a placa 6 poço a partir da etapa 7.1.1 da seguinte forma: Bem 1 = Branco, células K562 sozinha (5 x 105); Bem 2 = células K562 manchadas pela CFSE sozinha (5 x 105); Bem 3 = células CIK (E [effector], 25 x 105) + células K562 manchadas pelo CFSE (T [alvo], 5 x 105); Bem 4 = células CIK (E, 50 x 105) + células K562 manchadas pelo CFSE (T, 5 x 105).
- Misture as suspensões da célula canalizando-as suavemente para cima e para baixo pelo menos 3x. Coloque a placa na incubadora por 24 h.
- Cocultura das células CIK e OC-3 (CIK-OC-3)
- Adicione 1 mL de média basal com ou sem células CIK da etapa 3.4 à placa 6 poço da etapa 6.2.7 da seguinte forma: Bem 1 = Branco, células OC-3 sozinha (5 x 105); Bem 2 = células OC-3 manchadas pela CFSE sozinha (5 x 105); Bem 3 = células CIK (E, 25 x 105) + células OC-3 manchadas pelo CFSE (T, 5 x 105); Bem 4 = células CIK (E, 50 x 105) + células OC-3 manchadas pelo CFSE (T, 5 x 105).
- Misture as suspensões da célula canalizando-as suavemente para cima e para baixo pelo menos 3x. Coloque a placa na incubadora por 24 h.
- 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) coloração de tinta
- Colher a suspensão da célula CIK-K562 da etapa 7.1.3 diretamente em um tubo estéril de 15 mL.
- Colher as células suspensas e aderentes dos grupos CIK-OC-3 a partir da etapa 7.2.2.
- Transfira a suspensão da célula para um tubo estéril de 15 mL. Lave o poço com 1 mL de PBS estéril, pegue o PBS e adicione ao tubo. Adicione 0,5 mL de solução de enzima de dissociação celular e incuba por 5 min a 37 °C.
- Adicione 1 mL da solução do mesmo tubo ao poço correspondente e misture delicadamente as células canalizando-as para cima e para baixo pelo menos 3x com uma pipeta estéril de 1 mL. Colete todas as células no mesmo tubo.
- Centrífuga a 300 x g por 10 min, aspirar o supernatante, e resuspender as células em 1 mL de PBS estéril. Pelotas as células a 300 x g por 10 min, aspirar o supernatant, e resuspender as células em 100 μL de PBS estéreis.
- Adicione 5 μL de tinantes 7-AAD (estoque de 50 ng/μL) à suspensão da célula. Misture delicadamente as células canalizando-as para cima e para baixo pelo menos 3x com uma pipeta estéril de 1 mL. Incubar por 10 min e deixe no escuro antes da análise.
- Ensaio de capacidade citolítica
- Misture a suspensão celular da etapa 7.3.4 e repita as etapas 5.1 e 5.2 uma vez.
- Clique no botão Novo Espécime para adicionar um espécime e tubo ao experimento e nomear os tubos da seguinte forma: Tubos 1, Células K562 (ou OC-3) apenas; Tubo 2, células K562 (ou OC-3) manchadas pelo CFSE; Tubo 3, E:T = 5:1; Tubo 4, E:T = 10:1.
- Crie um sistema de gating de dispersão para o ensaio citolítico (Figura 3A).
- Selecione o Tubo 1 e clique no botão Dot Plot para criar um enredo FSC-A/SSC-A. Desenhe um portão retângulo sobre todos os eventos com um limiar FSC-A >5 x 104 para excluir detritos celulares.
- Selecione o parâmetro SSC-A/CFSE para a nova trama de pontilhão. Selecione o parâmetro 7-AAD/CFSE para o novo lote de pontos e desenhe um portão de quatro quadrantes para definir as quatro subpopulações.
- Clique no botão Amostra de carga para analisar a amostra de controle em branco primeiro.
- Ajuste a tensão de SSC-A e FSC-A. Identifique a população de células mortas usando os parâmetros do CANAL CFSE e 7-AAD. Registre os dados de células >20.000 CFSE+ em cada espécime.
- Repita a seção 7.4.6 para a investigação de todos os espécimes.
- Abra os arquivos contendo os valores estatísticos de cada espécime individual para analisar as populações de células não viáveis e exportar os dados para arquivos de análise.
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Representative Results
O objetivo do protocolo atual é isolar e expandir células T de assassinos induzidos por citocinas a partir de monocitos sanguíneos periféricos e avaliar o efeito citotóxico da CIK contra malignidade hematológica e células cancerígenas sólidas, respectivamente. A indução do CIK foi identificada pelo reconhecimento CD3/CD56. A Figura 1A mostra o protocolo para indução e expansão cik. Os resultados representativos da estratégia de gating para análise da subpopulação de células CD3+CD56+ T de doadores saudáveis são ilustrados na Figura 1B. A Figura 1C mostra a análise estatística da proporção de CIK de três indivíduos.
Figura 2A mostra que a proporção de células CD3+CD56+ celular (0,65% para o PBMC original, painel inferior esquerdo e 27,4% para as células CIK colhidas no dia14, painel inferior direito) aumentou significativamente após 14 dias de expansão. Em nosso sistema cultural, as células CIK produziram cerca de meia centena de alterações em comparação com o número original de PBMCs (Figura 2B).
A Figura 3 mostra o efeito citotóxico da CIK contra células k562 de leucemia mielóide crônica humana e células OC-3 do câncer de ovário humano. As células K562 ou OC-3 (alvo, T) foram manchadas com um corante não fluorescente (CFSE), que foi amassado por esterases intracelulares dentro de células viáveis e, em seguida, tornou-se um corante altamente fluorescente. No estudo de cocultura citotóxica, as células K562 ou OC-3 manchadas pelo CFSE foram cotratadas com células CIK por 24 h. No final da incubação, as células totais foram colhidas e manchadas com tintura de 7-AAD, que é um tintura nucleica que é usada como sonda de viabilidade para exclusão de células mortas. O tamanho e a granularidade das células CIK e CFSE+ são ilustrados na Figura 3A. As células K562 manchadas pelo CFSE (células-alvo, T) foram co-tratadas com células CIK (células effectoras, E) em uma proporção de E/T = 0:1, 5:1 e 10:1, respectivamente. As células 7-AAD+ das células CFSE+ K562 foram todas avaliadas. Os resultados estatísticos foram de três experimentos independentes. A lise basal significa a porcentagem de morte celular na ausência de células efetivas (E:T = 0:1). A Figura 3B mostra a óbvia citotoxicidade do CIK contra as células OC-3 (E:T = 10:1) após 24 h de incubação.
Figura 1: Fluxo grama de células assassinas induzidas por citocinas indução e expansão. (A)OS PBMCs de doadores saudáveis consentidos foram inicialmente expostos ao rhIFN-γ (Dia 0), seguido saque-2, rhIL-1α e anti-CD3 mAb (Dia 1) a cada 3 dias (Dia 4). Posteriormente, o meio foi revigorado com meio de contenção de rhIL-2 a cada 3 dias e as células foram colhidas no dia 14. (B)Morfologia das células CIK durante 7 dias de indução. A ativação e expansão das células CIK foram realizadas conforme descrito no protocolo. As células foram observadas um microscópio leve nos dias 1, 5 e 7, respectivamente (ampliação = 40x, barra de escala = 200 μm). (C) A contagem de células foi realizada semanalmente. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 2: A proporção de células CD3+CD56+ T de uma amostra pbmc representativa. (A)Linfócitos foram reconhecidos por tamanho específico e granularidade. População celular única selecionada para análise por citometria de fluxo. (B)A análise estatística da eficácia da expansão do CIK de três doadores saudáveis foi realizada por meio de um t-test (*, p < 0,01). Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 3: Efeitos citotóxicos das células CIK contra leucemia mielóide crônica humana K562 e células OC-3 do câncer de ovário humano. (A) Após a cocultura com as células CIK por 24 h, as células-alvo K562 foram reconhecidas e fechadas com base na coloração do tintura CFSE. Ilustração do quadrante da população celular total o parâmetro selecionado 7-AAD/CFSE e a citotoxicidade cumulativa das células CIK na razão indicada de E:T. (B)O efeito citotóxico das células CIK contra células OC-3 em uma razão E:T = 10:1. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
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Discussion
O método descrito é um protocolo rápido, conveniente e confiável para o isolamento e expansão de células T de cifras tóxicas induzidas por citocina (CIK) de amostras de sangue inteiro de doadores saudáveis. Também mostra o efeito citotóxico do CIK contra leucemia (K562) e células cancerígenas ovarianas (OC-3) usando um sistema de configuração e rastreamento de citometria de fluxo (CS & T). As células CIK podem ser induzidas e expandidas em boas condições de práticas manufactory (GMP) usando citocinas de grau GMP e meio livre de soro para maior infusão clínica11. No entanto, a eficácia da indução e expansão do CIK apresenta diferenças individuais12,13,14. Além disso, a segurança é a vantagem da infusão de células CIK derivadas do paciente para terapia celular cancerosa. Foi relatado que as células CIK exercem efeitos citolíticos em células cancerígenas sólidas epiteliais principalmente de forma dependente de NKG2D. Em células cancerígenas hematológicas, bloquear NKG2D com um anticorpo específico inibe significativamente a citotoxicidade induzida pelo CIK contra células K562 de baixa nkg2D; no entanto, este tratamento não tem qualquer efeito sobre as células HL-60 sem NKG2D15. Além disso, as células CIK exibem menos atividade de morte celular contra células K562 em comparação com as células CD8+ CIK16. Neste estudo, descobrimos que a CIK apresentava um potencial citotóxico maior contra células OC-3 do câncer de ovário em comparação com as células K562 de leucemia. Esses dados sugerem que os mecanismos moleculares exatos através dos quais os efeitos do CIK matam células tumorais ainda não estão claros.
Rastrear a viabilidade celular alvo e avaliar o potencial citotóxico das células effectoras usando citometria de fluxo tornou-se um método padrão e convencional para o exame clínico17. Sugere-se que se observa um efeito negativo na viabilidade celular e na expressão de marcadores de ativação, como a população CD3+ em linfócitos manchados de CFSE com citometria de fluxo18,19. Assim, a coloração das células cancerígenas alvo é uma estratégia mais eficaz para avaliar os efeitos citotóxicos das células CIK primárias. IFN-γ, OKT3 e IL-2 são citocinas ou estimuladores importantes para diferenciação e proliferação de CIK. Além disso, outros fatores como a tiromoglobulina, IL-1α, IL-10, IL-15, também são estimuladores. Atualmente, soro humano, plasma rico em plaquetas humanas e até mesmo soro bovino fetal são usados como suplementos médios que podem melhorar a proliferação de células CIK. Embora o soro ou plasma sejam enriquecidos com nutrientes e fatores de crescimento, a adição de produtos animais alogênicos apresenta variações de origem, lote e lote que resultam em variabilidade experimental, e inevitavelmente estudos desconcertantes com desfechos terapêuticos para células cultivadas. Neste estudo, usamos uma mídia comercialmente disponível sem soro, sem albumina e sem xenog complementada com citocinas de grau clínico para cultivar com sucesso as células CIK. A desvantagem de usar suplementos livres de xenoôs ou alogênicos é que eles reduzem a eficácia da proliferação celular.
Os métodos de rastreamento de células bicolores fornecidos nos protocolos calcularam independentemente células de efeito viável ou morto em um ensaio direto de citotoxicidade. Em nossas estratégias de gating, as células-alvo CFSE+ podem ser obviamente distinguidas das células de efeito CIK(Figura 3). Mais importante, o processo de indução e expansão cik deve ser qualificado e mostrar alta viabilidade. Para novas infusões de dosagem múltipla, a condição de criopreservação e a viabilidade e a citotoxicidade após o descongelamento, são outros desafios críticos. A proporção real de lise específica é igual à proporção de 100 x (%Lysis amostral - %Basal lysis)/(100 - %Basal lysis). Ao contrário de outros estudos18,20, recomenda-se que todas as células-alvo sejam investigadas para revelar a citotoxicidade exata e real das células CIK.
Em conclusão, o protocolo descrito neste estudo foi projetado para aumentar o número de células CIK derivadas do PBMC de doadores saudáveis e avaliar suas funções citotóxicas contra células cancerígenas com sondas fotoactivatáveis de duas cores para rastreamento seletivo de células alvo por uma citometria de fluxo com um sistema de diagnóstico in vitro (IVD).
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Disclosures
Os autores não declaram conflitos concorrentes de interesse financeiro.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pelo China Medical University Hospital (DMR-Cell-1809).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7-Amino Actinomycin D | BD | 559925 | |
| APC Mouse Anti-Human CD56 antibody | BD | 555518 | B159 |
| APC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD | 555751 | MOPC-21 |
| BD FACSCanto II Flow Cytometer | BD | 338962 | |
| Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) | BD | 565082 | |
| D-(+)-Glucose solution | SIGMA | G8644 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12 | HyClone | SH30023.02 | |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30084.03 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare Life Sciences | 71101700-EK | |
| FITC Mouse Anti-Human CD3 antibody | BD | 555332 | UCHT1 |
| FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD | 555748 | MOPC-21 |
| Human anti-CD3 mAb | TaKaRa | T210 | OKT3 |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Proleukin | NOVARTIS | ||
| Recombinant Human Interferon-gamma | CellGenix | 1425-050 | |
| Recombinant Human Interleukin-1 alpha | PEPROTECH | 200-01A | |
| RPMI1640 medium | Gibco | 11875-085 | |
| Sigma 3-18K Centrifuge | Sigma | 10295 | |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12605028 | |
| X-VIVO 15 medium | Lonza | 04-418Q |
References
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