Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Isolering og udvidelse af cytotoksiske cytokin-induceret Killer T Celler til kræftbehandling

Published: January 24, 2020 doi: 10.3791/60420
Automatic Translation
1,2,3, 4, 4,5, 4,6,7, 1,2, 1,2, 4, 4
1Department of Urology, Wan Fang Hospital, 2Department of Urology, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, 3Graduate Institute of Clinical Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, 4Translational Cell Therapy Center, Department of Medical Research, China Medical University Hospital, 5Graduate Institute of Biomedical Sciences, China Medical University, 6Graduate Institute of Immunology, China Medical University, 7Department of Neurosurgery, Neuropsychiatric Center, China Medical University Hospital

Summary

Her præsenterer vi en protokol til at udføre isolering og udvidelse af perifere blod mononukleare celler-afledt cytokin-induceret CD3+CD56+ killer celler og illustrere deres cytotoksicitet virkning mod hæmatologiske og faste kræftceller ved hjælp af en in vitro diagnose flow cytometri system.

Abstract

Adoptivcelleimmunterapi fokuserer på at genoprette kræftanerkendelse via immunsystemet og forbedrer effektiv tumorcelledrab. Cytokin-induceret killer (CIK) T celle terapi er blevet rapporteret til at udøve betydelige cytotoksiske virkninger mod kræftceller og at reducere de negative virkninger af kirurgi, stråling og kemoterapi i kræftbehandlinger. CIK kan udledes af perifere blodmononukleare celler (PBPC'er), knoglemarv og navlestrengsblod. CIK celler er en heterogen subpopulation af T-celler med CD3+CD56+ og naturlige killer (NK) fænotypiske egenskaber, der omfatter store histokompatibilitet kompleks (MHC)-ubegrænset antitumor aktivitet. Denne undersøgelse beskriver en kvalificeret, klinisk anvendelig, flow cytometri-baseret metode til kvantificering af den cytolytiske evne pbmc-afledte CIK celler mod hæmatologiske og faste kræftceller. I den cytolytiske analyse, cik celler er co-inkuberet på forskellige nøgletal med prestained mål tumorceller. Efter inkubationstiden bestemmes antallet af målceller af en nukleinsyrebindende plet for at detektere døde celler. Denne metode gælder for både forsknings- og diagnosticeringsapplikationer. CIK celler besidder potent cytotoksicitet, der kunne udforskes som en alternativ strategi for kræftbehandling på sin prækliniske evaluering af en cytometer setup og sporing (CS & T) baseret flow cytometri system.

Introduction

Cytotoksiske T lymfocytter er en specifik immuneffekt eller cellepopulation, der formidler immunrespons mod kræft. Flere effektor cellepopulationer, herunder lymphokin-aktiveret killer (LAK) celler, tumor-infiltrerende lymfocytter (TILs), naturlige killer (NK) celler, γδ T celler, og cytokin-induceret killer (CIK) celler er blevet udviklet til adoptivT celle terapi (ACT) formål1. Der er en stigende interesse for CIK celler, fordi de repræsenterer en blanding af cytokin-induceret cytotoksiske cellepopulationer udvidet fra autolog perifere blod mononukleare celler (PMBC)2.

Den ukontrollerede vækst af lymfoide progenitor celler, myeloblaster, og lymfoblaster fører til tre hovedtyper af blodkræft (dvs. leukæmi, lymfom, og myelomatose), solide tumorer, herunder karcinomer (f.eks lungekræft, mavekræft, livmoderhalskræft), og sarkomer, blandt andre kræftformer3. CIK celler er en blanding af cellepopulationer, der udviser en bred vifte af store histokompatibilitet kompleks (MHC)-ubegrænset antitumor aktivitet og dermed holde løfte om behandling af hæmatologiske og avancerede tumorer4,5,6,7. CIK celler omfatter en kombination af celler, herunder T-celler (CD3+CD56−), NK-T celler (CD3+CD56+), og NK celler (CD3-CD56+). Optimering af CIK induktion protokol ved hjælp af en fast tidsplan for tilsætning af IFN-γ, anti-CD3 antistof, og IL-2, resulterer i udvidelse af CIK celler8. Cik-cellernes cytototoksiske evne til at bekæmpe kræftceller afhænger hovedsageligt af, at NK-gruppe 2-medlemmet D (medlem af C-typen lectin-lignende receptorfamilie) nkg2d ligands på tumorceller og på perforinmedierede veje9. Resultaterne af en præklinisk undersøgelse viste, at IL-15-stimulerede CIK-celler induceret potent cytotoksicitet mod primære og akutte myeloid leukæmi cellelinjer in vitro og udstillet en lavere alloreaktivitet mod normale PBPC'er og fibroblaster9. For nylig, resultatet af engangs-sund donor-afledt CIK (1 x 108/ kg CD3+ celler) infusion som konsolidering efter nonmyeloablative allogen transplantation for myeloid neoplasmbehandling i en fase II klinisk undersøgelse blev offentliggjort10.

I denne undersøgelse udviklede vi en optimeret cellekulturformel bestående af IFN-γ, IL-1α, anti-CD3 antistof og IL-2, der blev tilføjet til det hæmatopoietiske cellemedium for at øge CIK-produktionen, og undersøgte cikcellernes cytotoksiske virkning mod kroniske mennesker myeloid leukæmi (K562) celler og kræft i æggestokkene (OC-3) celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Den kliniske protokol blev udført og godkendt i overensstemmelse med retningslinjerne fra Den Institutionelle Review Board for China Medical University and Hospital Research Ethics Committee. Perifere blodprøver blev høstet fra raske frivillige med deres informerede samtykke.

1. Fremstilling af materialer

  1. Opbevar reagenser, antistoffer og kemikalier som vist i materialesikkerhedsdatabladet (MSDS). Stofferne eller cytokinerne opløses i opløsningsmidler som lageropløsninger, og derefter aliquot til opbevaring ved -20 °C eller -80 °C.
    BEMÆRK: Detaljerede oplysninger om materialepræparatering er anført i materialetabellen.

2. PBMC isolation

  1. Varm forløbsopløsningen(materialetabellen)til 18-20 °C før brug. Inverter opløsningsflasken flere gange for at sikre grundig blanding.
  2. Opsaml 3−5 ml human venøs blodprøve i et glashætteglas, der er hepariniseret, og blandes godt ved forsigtigt at vende røret flere gange.
  3. Klargør 4 ml densitetsgradientopløsning i et 15 ml sterilt rør.
  4. Omhyggeligt lag 1 ml af blodprøven på densitetsgradientopløsningen.
  5. Centrifugeres ved 400 x g i 30 min ved 18−20 °C (sluk for pausen).
  6. Omhyggeligt og straks aspirere buffy pels lag af mononukleare celler (ca. 1 ml) på én gang for at undgå at forstyrre lagene til en steril 15 ml rør ved hjælp af en 1 ml steril pipette.
  7. Der tilsættes mindst 3 bind (~3 ml) fosfatbufferet saltvand (PBS) til buffy-pelsen i centrifugerøret. Opbryd cellerne ved forsigtigt at pibe dem op og ned mindst 3 x med en steril pipette.
  8. Centrifugeres ved 400 x g i 10 min ved 18−20 °C. Aspirere supernatanten.
  9. Cellepelletten suspenderes med 5 ml basalmedium (Materialetabel)og overføres til en kolbe. Kultur cellerne i en celle kultur inkubator ved 37 °C og 5% CO2.

3. CIK induktion og ekspansion

  1. På dag 0 kultur ppbcc'erne (1 x 106)i frisk basalmedium indeholdende 1.000 IE/ml IFN-γ for 24 timer i en befugtet cellekulturkuvøse ved 37 °C og 5% CO2.
  2. På dag 1 opdateres mediet med frisk basalmedium indeholdende 50 ng/ml anti-CD3 antistof, 1 ng/ml rh IL-1α og 1.000 U/ml rh IL-2. Opdater mediet hver 3.
  3. På dag 7 skal du opdatere mediet med frisk basalmedium indeholdende 1.000 U/ml rh IL-2. Opdater mediet hver 3.

4. Immunophenotyping til vurdering af CIK-celler

  1. Cikcellerne vaskes med 10 ml steril PBS. Centrifugeres i 10 min ved 300 x g og 18−20 °C, aspirer supernatanten, og ophæng cellerne igen med 10 ml PBS. Tæl cellenummeret og testcellens levedygtighed ved hjælp af trypanblå eksklusionsanalyse.
  2. Aliquot CIK cellerne i seks sterile 1,5 ml rør ved en tæthed på ~ 5-10 x 105 celler / ml PBS. Etiket og behandl som følger: Rør 1, Blank (intet antistof); Rør 2, tilsættes 20 μL isotype IgG1-FITC; Rør 3, tilsættes 20 μL isotype IgG1-APC mAbs; Rør 4, tilsættes 20 μL CD3-FITC; Rør 5, tilsæt 20 μL CD56-APC mAbs; og Rør 6, tilsættes 20 μL CD3-FITC og 20 μL CD56-APC mAbs.
  3. Bland forsigtigt CIK-cellerne med antistofferne ved forsigtigt at pibe dem op og ned mindst 3 x med en 1 ml steril pipette, og inkuber derefter i 30 minutter ved stuetemperatur i mørke.
  4. Centrifugerne centrifugeres i 10 min ved 300 x g og 18−20 °C. Aspirere supernatantog suspendere cellepellet en gang med 1 ml PBS. Forsigtigt pipet dem op og ned mindst 3x med en 1 ml steril pipette.
  5. Gentag trin 4.4.
  6. Lad rørene være mørke, før de flyder cytometrisk analyse.

5. GENKENDELSE af cd-markør

  1. Celleaffjedringen overføres til et sterilt 5 ml polystyren rundt bundrør med en cellesiton (100 μm mesh) ved forsigtigt at pibe gennem hætten. Sæt rørene på karrusellen i orden.
  2. Åbn flowcytometrianalysesoftwaren, og opret en eksperimentel mappe. Klik på knappen Ny prøve for at tilføje et prøve og rør til eksperimentet og navngive rørene på følgende måde: Tube 1, Blank; Rør 2, Isotype IgG1-CD3; Rør 3, Isotype IgG1-CD56; Rør 4, CD3; Rør 5, CD56; Rør 6, CD3CD56.
  3. Opret et scatter gating system til CIK celle populationer (Figur 2A).
    1. Vælg Rør 1 (Tom), og klik på knappen Dot Plot for at oprette et FSC-A/SSC-A-plot. Tegn en rektangelport over hele cellepopulationen med en FSC-A-tærskel >5 x 104 for at udelukke celleaffald.
    2. Vælg parameteren SSC-A/SSC-H for det nye prikplot, og tegn en polygonport rundt om alle enkelte celler. Vælg parameteren Count/FITC (CD3) og Count/APC (CD56) for henholdsvis det nye histoggramplot. Vælg PARAMETERen FITC (CD3)/APC (CD56) for det nye punktplot, og tegn en fire kvadrantport for at definere de fire underpopulationer.
    3. Registrer data fra 20.000 enkelte celler i hver prøve. Klik på knappen Indlæs eksempel for at analysere eksemplet med tomt kontrolelement først. Identificer hele CIK-cellepopulationen ved hjælp af CD56- og CD3-kanalparametrene.
  4. Gentag trin 5.3 til undersøgelse af alle prøver.
  5. Åbn de filer, der indeholder de statistiske værdier af den enkelte prøve til at analysere CIK cellepopulationer og genoptryk dem i analysefiler.

6. Dyrkning og farvning af humane kroniske myeloid leukæmi K562 celler og kræft i æggestokkene OC-3 celler

  1. K562 celler
    1. Dyrkning K562 celler i komplette medier (RPMI basal medium indeholdende 10% føtal kvæg serum [FBS] og 50 U /ml antibiotika og justere glukose til 4,5 g / L) ved en tæthed på 0,5−1 x 106 celler/ml i en celle kultur kolbe og inkubere i en befugtet inkubator ved 37 °C og 5% CO2.
    2. Kulturmediet, der indeholder K562-cellerne, overføres til 50 ml sterile rør, og cellerne pellets ved 300 x g i 10 min ved 18−20 °C på forsøgsdagen.
    3. Aspirere supernatant, resuspendere cellerne i 5 ml steril pbs, og bland godt forsigtigt.
    4. Pellet cellerne ved 300 x g i 10 min. Aspirere supernatant, resuspendere cellerne i PBS og juster K562-cellerne til en koncentration på 0,5-1 x 106 celler/ml.
    5. Der tilsættes 0,5 μL CFSE-farvestof til 1 ml K562-celleaffjedring i et 15 ml sterilt rør ved en endelig koncentration på 5 μM. Bland forsigtigt suspensionen ved at pibe op og ned mindst 3x.
    6. Lad røret stå i en cellekulturkuvøse ved 37 °C og 5% CO2 i 10-15 min.
    7. Tilføj 9 ml PBS til røret og pellet cellerne på 300 x g i 10 min. Dekantersupernatant og derefter suspendere cellepellet i 10 ml af hele medier. Overfør cellesuspensionen til en cellekulturkolbe og anbring i rugemaskinen.
  2. OC-3 celler
    1. Kultur OC-3 celler i komplette medier (DMEM/F12 medium indeholdende 10% FBS og 50 U / ml antibiotika) ved en tæthed på 0,5-1 x 106 celler i en celle kultur kolbe ved 37 °C og 5% CO2.
    2. Aspirat kulturmedierne og vask cellerne med PBS 1 dag før eksperimentet.
    3. Cellerne løsnes ved tilsætning af 1 ml celledissociation enzymopløsning (Materialetabel) og inkuberes i 5 min ved 37 °C.
    4. Suspendere cellerne ved at tilføje 5 ml PBS og bland godt forsigtigt. Pellet cellerne på 300 x g i 10 min og aspirere supernatant. Opslæm cellerne i PBS igen, og cellerne justeres til en koncentration på 0,5-1 x 106 celler/ml.
    5. Der tilsættes 0,5 μL CFSE-farvestof til 1 ml oc-3-celleaffjedring i et 15 ml sterilt rør ved en endelig koncentration på 5 μM. Bland forsigtigt suspensionen ved at pibe op og ned mindst 3x.
    6. Lad røret stå i en cellekulturkuvøse ved 37 °C og 5% CO2 i 10-15 min.
    7. Tilføj 9 ml PBS til røret og pellet cellerne på 300 x g i 10 min. Dekanter supernatantog derefter suspendere cellepellet med komplette medier. Frø 5 x 105 celler/godt ind i en 6 brøndplade og inkuberi i en befugtet inkubator ved 37 °C og 5% CO2 natten over.

7. Cytotoksisk analyse

  1. Coculture af CIK og K562 celler (CIK-K562)
    1. Tæl K562-cellerne fra trin 6.1.7, og test cellens levedygtighed ved trypan blå eksklusionsanalyse. Tilføj 1 ml K562 celler til hver brønd i en 6 brøndplade ved en tæthed på 5 x 105/ml.
    2. Tilføj 1 ml basalmedium med eller uden CIK-celler fra trin 3.4 til 6-brøndpladen fra trin 7.1.1 som følger: Nå 1 = Blank, K562 celler alene (5 x 105); Nå 2 = CFSE-farvede K562 celler alene (5 x 105); Nå 3 = CIK celler (E [effektor], 25 x 105) + CFSE-farvede K562 celler (T [mål], 5 x 105); Nå 4 = CIK celler (E, 50 x 105) + CFSE-farvede K562 celler (T, 5 x 105).
    3. Bland cellesuspensioner ved forsigtigt at pipettere dem op og ned mindst 3x. Pladen anbringes i rugemaskinen i 24 timer.
  2. Coculture af CIK og OC-3 celler (CIK-OC-3)
    1. Tilføj 1 ml basalmedium med eller uden CIK-celler fra trin 3.4 til 6-brøndpladen fra trin 6.2.7 som følger: Nå 1 = Blank, OC-3 celler alene (5 x 105); Nå 2 = CFSE-farvede OC-3 celler alene (5 x 105); Nå 3 = CIK celler (E, 25 x 105) + CFSE-farvede OC-3 celler (T, 5 x 105); Nå 4 = CIK celler (E, 50 x 105)+ CFSE-farvede OC-3 celler (T, 5 x 105).
    2. Bland cellesuspensioner ved forsigtigt at pipettere dem op og ned mindst 3x. Sæt pladen i rugemaskinen i 24 timer.
  3. 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) farvestof farvning
    1. Høst CIK-K562 celleaffjedringen fra trin 7.1.3 direkte ind i et 15 ml sterilt rør.
    2. Høst både suspensionog klæbende celler fra CIK-OC-3 grupper fra trin 7.2.2.
      1. Celleaffjedringen overføres til et 15 ml sterilt rør. Vask brønden med 1 ml steril PBS, saml PBS, og tilsæt til røret. Der tilsættes 0,5 ml celledissociationenzymopløsning og inkuberes i 5 min ved 37 °C.
      2. Tilsæt 1 ml af opløsningen fra samme rør til den tilsvarende brønd, og bland forsigtigt cellerne ved at pipettere dem op og ned mindst 3 x med en 1 ml steril pipette. Indsamle alle cellerne i samme rør.
    3. Centrifuger ved 300 x g i 10 min. supernatanten, og ophæng cellerne igen i 1 ml steril PBS. Pellet cellerne ved 300 x g i 10 min, aspirere supernatantet, og resuspendering celler i 100 μL sterile PBS.
    4. Der tilsættes 5 μL 7-AAD-farvestof (50 ng/μL-lager) til celleaffjedringen. Bland forsigtigt cellerne ved at pibe dem op og ned mindst 3x med en 1 ml steril pipette. Inkuberes i 10 minutter og lad i mørke før analyse.
  4. Cytolytisk kapacitetsanalyse
    1. Bland celleaffjedringen fra trin 7.3.4, og gentag trin 5.1 og 5.2 én gang.
    2. Klik på knappen Ny prøve for at tilføje en prøve og et rør til eksperimentet og kun navngive rørene som følger: Rør 1, K562 (eller OC-3) celler. Rør 2, CFSE-farvede K562 (eller OC-3) celler alene; Rør 3, E:T = 5:1; Rør 4, E:T = 10:1.
    3. Opret et scatter gatingsystem til cytolytisk analyse (Figur 3A).
      1. Vælg Rør 1, og klik på knappen Dot Plot for at oprette et FSC-A/SSC-A-plot. Tegn en rektangelport over alle hændelser med en FSC-A-tærskel >5 x 104 for at udelukke celleaffald.
      2. Vælg parameteren SSC-A/CFSE for det nye prikplot. Vælg 7-AAD/CFSE parameteren for det nye prikplot, og tegn en firekvadrantport for at definere de fire delpopulationer.
      3. Klik på knappen Indlæs eksempel for at analysere prøven med tomt kontrolelement først.
      4. Juster spændingen ved SSC-A og FSC-A. Identificer den døde cellepopulation ved hjælp af CFSE- og 7-AAD-kanalparametrene. Registrer dataene fra >20.000 CFSE+ celler i hver prøve.
    4. Punkt 7.4.6 gentages med henblik på undersøgelse af alle prøver.
    5. Åbn de filer, der indeholder de statistiske værdier for hvert enkelt eksemplar, for at analysere de ikke-levedygtige cellepopulationer og eksportere dataene til analysefiler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Formålet med denne protokol er at isolere og udvide cytokin-induceret dræber (CIK) T-celler fra perifere blodmonocytter og evaluere ciks cytototoksiske virkning mod henholdsvis hæmatologisk malignitet og faste kræftceller. Induktionen af CIK blev identificeret ved CD3/CD56-genkendelsen. Figur 1A viser protokollen for CIK induktion og ekspansion. De repræsentative resultater af gatingstrategien for analyse af underpopulationen af CD3+CD56+ T-celler fra raske donorer er illustreret i figur 1B. Figur 1C viser den statistiske analyse af CIK-andelen fra tre personer.

Figur 2A viser, at CD3+CD56+ celleandelen (0,65% for den oprindelige PBMC, venstre lavere panel og 27,4% for CIK celler høstet på dag 14th, højre lavere panel) steg betydeligt efter 14 dages ekspansion. I vores kultursystem gav CIK-cellerne omkring et halvt hundrede gange ændringer i forhold til det oprindelige antal PbPC'er(figur 2B).

Figur 3 viser ciks cytototoksiske virkning mod kronisk myeloid leukæmi K562-celler og kræft i æggestokkene OC-3. K562 eller OC-3 celler (mål, T) blev plettet med en ikke-fluorescerende farvestof (CFSE), som blev kløvet af intracellulære esteraser i levedygtige celler og derefter blev en meget fluorescerende farvestof. I den cytotoksiske coculture undersøgelse, CFSE-farvede K562 eller OC-3 celler blev cotreated med CIK celler i 24 timer. Ved afslutningen af inkubationen blev de samlede celler høstet og plettet med 7-AAD farvestof, som er et nukleinsyrebindende farvestof, der anvendes som levedygtighedssonde for dødcelleudelukkelse. CIK- og CFSE+ cellernes størrelse og granularitet er illustreret i figur 3A. CfSE-farvede K562-celler (målceller, T) blev co-behandlet med CIK-celler (effektorceller, E) ved et forhold mellem henholdsvis E/T = 0:1, 5:1 og 10:1. 7-AAD+ cellerne i CFSE+ K562-cellerne blev alle evalueret. De statistiske resultater var fra tre uafhængige forsøg. Ved basal lysis forstås procentdelen af celledød i mangel af effektorceller (E:T = 0:1). Figur 3B viser CIK's åbenlyse cytotoksicitet mod OC-3-celler (E:T = 10:1) efter 24 timers inkubation.

Figure 1
Figur 1: Flowdiagram over cytokin-induceret dræberceller induktion og ekspansion. (A) PBPC'er fra samtykkende raske donorer blev oprindeligt udsat for rhIFN-γ (dag 0), efterfulgt af rhIL-2, rhIL-1α, og anti-CD3 mAb (dag 1) hver 3 dage (dag 4). Efterfølgende blev mediet opdateret med rhIL-2-holdigt medium hver 3. (B) Morfologi af CIK celler i løbet af 7 dage af induktion. Aktiveringen og udvidelsen af CIK-celler blev udført som beskrevet i protokollen. Celler blev observeret under et let mikroskop på dag 1, 5 og 7, henholdsvis (forstørrelse = 40x, skala bar = 200 μm). (C) Celletællinger blev udført ugentligt. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Andelen af CD3+CD56+ T-celler fra en repræsentativ PBMC-prøve. (A) Lymfocytter blev anerkendt af en bestemt størrelse og granularitet. Valgt enkeltcellepopulation til analyse efter flowcytometri. (B) Statistisk analyse af CIK ekspansion effektivitet fra tre raske donorer blev udført ved hjælp af en t-test (*, p < 0,01). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Cytotoksiske virkninger af CIK-celler mod kronisk myeloid leukæmi K562 og kræft i æggestokkene oc-3 celler. (A) Efter samkultur med CIK-cellerne i 24 timer blev K562-målcellerne anerkendt og gated baseret på farvning af CFSE-farvestof. Kvadrant illustration af den samlede cellepopulation under den valgte 7-AAD/CFSE parameter og den kumulative cytotoksicitet af CIK celler på det angivne E:T-forhold. (B) Cik-cellernes cytototoksiske virkning mod OC-3-celler ved et E:T = 10:1-forhold. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den beskrevne metode er en hurtig, bekvem og pålidelig protokol for isolering og udvidelse af cytotoksisk cytokin-induceret killer (CIK) T-celler fra fuldblodsprøver af raske donorer. Det viser også den cytotoksiske virkning af CIK mod leukæmi (K562) og kræft i æggestokkene (OC-3) ved hjælp af et flow cytometri setup og sporing (CS & T) system. CIKceller kan induceres og udvides i god produktionspraksis (GMP) betingelser ved hjælp af GMP-grade cytokiner og serum-fri medium for yderligere klinisk infusion11. Effekten af CIK induktion og ekspansion udviser dog individuelle forskelle12,13,14. Desuden er sikkerhed fordelen ved infusion af patient-afledte CIK celler til kræftcelleterapi. Det er blevet rapporteret, at CIK celler udøver cytolytiske virkninger på epitelfaste kræftceller for det meste i en NKG2D-afhængig måde. I hæmatologiske kræftceller, blokerer NKG2D med et specifikt antistof hæmmer i betydelig grad CIK-induceret cytotoksicitet mod NKG2D-lav K562 celler; Denne behandling har dog ingen virkning på HL-60-celler, der mangler NKG2D15. Desuden cik celler udviser mindre celle-drab aktivitet mod K562 celler i forhold til CD8+ CIK celler16. I denne undersøgelse, Fandt vi, at CIK udstillet en større cytotoksisk potentiale mod kræft i æggestokkene OC-3 celler i forhold til leukæmi K562 celler. Disse data tyder på, at de nøjagtige molekylære mekanismer, hvorigennem CIK-effektorer dræber tumorceller, er endnu ikke klare.

Sporing af målcellelevedygtighed og evaluering af effektcellernes cytotoksiske potentiale ved hjælp af flowcytometri er blevet en standardog konventionel metode til klinisk undersøgelse17. Det er blevet antydet , at der observeres en negativ effekt på cellens levedygtighed og udtryk for aktiveringsmarkører , såsom CD3+ populationen i CFSE-farvede lymfocytter med flowcytometri18,19. Således farvning målet kræftceller er en mere effektiv strategi for evaluering af cytotoksiske virkninger af primære CIK celler. IFN-γ, OKT3 og IL-2 er store cytokiner eller stimulatorer til CIK differentiering og spredning. Desuden er andre faktorer såsom thymoglobulin, IL-1α, IL-10, IL-15, også stimulatorer. I øjeblikket, humant serum, menneskelige blodplade-rige plasma, og selv føtal kvæg serum bruges som medium kosttilskud, der kan øge spredningen af CIK celler. Selv om serum eller plasma er beriget med næringsstoffer og vækstfaktorer, tilsætning af allogene animalske produkter præsenterer kilde, parti, og parti variationer, der resulterer i eksperimentel variation, og uundgåeligt foruroligende undersøgelser med terapeutiske resultater for dyrkede celler. I denne undersøgelse brugte vi en kommercielt tilgængelig serum-fri, albumin-fri, og xeno-fri GMP-grade medier suppleret med klinisk kvalitet cytokiner til en vellykket kultur CIK celler. Ulempen ved at bruge xeno-fri eller allogen-fri kosttilskud er, at de reducerer effekten af celleproliferation.

De to-farve celle tracking metoder i protokollerne uafhængigt beregnet levedygtige eller døde effektor målrette celler i en direkte cytotoksicitet assay. I vores gating strategier, CFSE+ målceller kan naturligvis skelnes fra CIK effektor celler (Figur 3). Vigtigst er det, processen med CIK induktion og ekspansion skal være kvalificeret og vise høj levedygtighed. For yderligere multiple-dosering infusioner, tilstanden af kryopræservering, og levedygtigheden og cytotoksicitet efter optøning, er andre kritiske udfordringer. Det faktiske forhold mellem specifik lysis svarer til andelen af 100 x (%Sample lysis - %Basal lysis)/(100 - %Basal lysis). I modsætning til andre undersøgelser18,20, anbefales det, at alle målceller undersøges for at afsløre den nøjagtige og faktiske cytotoksicitet af CIK celler.

Afslutningsvis, protokollen er beskrevet i denne undersøgelse er designet til at øge antallet af PBMC-afledte CIK celler fra raske donorer og til at evaluere deres cytotoksiske funktioner mod kræftceller med to-farve fotoaktiverelige sonder til selektiv sporing af målceller ved et flowcytometri med et IN vitro-diagnosesystem (IVD).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende konflikter af finansiel interesse.

Acknowledgments

Denne undersøgelse blev støttet af China Medical University Hospital (DMR-Cell-1809).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
7-Amino Actinomycin D BD 559925
APC Mouse Anti-Human CD56 antibody BD 555518 B159
APC Mouse IgG1, κ Isotype Control BD 555751 MOPC-21
BD FACSCanto II Flow Cytometer BD 338962
Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) BD 565082
D-(+)-Glucose solution SIGMA G8644
Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12 HyClone SH30023.02
Fetal bovine serum HyClone SH30084.03
Ficoll-Paque Plus GE Healthcare Life Sciences 71101700-EK
FITC Mouse Anti-Human CD3 antibody BD 555332 UCHT1
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control BD 555748 MOPC-21
Human anti-CD3 mAb TaKaRa T210 OKT3
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
Proleukin NOVARTIS
Recombinant Human Interferon-gamma CellGenix 1425-050
Recombinant Human Interleukin-1 alpha PEPROTECH 200-01A
RPMI1640 medium Gibco 11875-085
Sigma 3-18K Centrifuge Sigma 10295
TrypLE Express Enzyme Gibco 12605028
X-VIVO 15 medium Lonza 04-418Q

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cappuzzello, E., et al. Cytokines for the induction of antitumor effectors: The paradigm of Cytokine-Induced Killer (CIK) cells. Cytokine & Growth Factor Reviews. 36, 99-105 (2017).
  2. Schmidt-Wolf, R. S., et al. Propagation of large numbers of T cells with natural killer cell markers. British Journal of Haematology. 87 (3), 453-458 (1994).
  3. Grainger, S., et al. Wnt Signaling in Hematological Malignancies. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 153, 321-341 (2018).
  4. Dai, C., et al. Implication of combined PD-L1/PD-1 blockade with cytokine-induced killer cells as a synergistic immunotherapy for gastrointestinal cancer. Oncotarget. 7 (9), 10332-10344 (2016).
  5. Schmidt-Wolf, I. G., et al. Use of a SCID mouse/human lymphoma model to evaluate cytokine-induced killer cells with potent antitumor cell activity. TheJournal of Experimental Medicine. 174 (1), 139-149 (1991).
  6. Introna, M., et al. Rapid and massive expansion of cord blood-derived cytokine-induced killer cells: an innovative proposal for the treatment of leukemia relapse after cord blood transplantation. Bone Marrow Transplantation. 38 (9), 621-627 (2006).
  7. Schmeel, L. C., et al. Cytokine-induced killer (CIK) cells in cancer immunotherapy: report of the international registry on CIK cells (IRCC). Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 141 (5), 839-849 (2015).
  8. Rutella, S., et al. Adoptive immunotherapy with cytokine-induced killer cells generated with a new good manufacturing practice-grade protocol. Cytotherapy. 14 (7), 841-850 (2012).
  9. Nausch, N., et al. NKG2D ligands in tumor immunity. Oncogene. 27 (45), 5944-5958 (2008).
  10. Gammaitoni, L., et al. Effective activity of cytokine-induced killer cells against autologous metastatic melanoma including cells with stemness features. Clinical Cancer Research. 19 (16), 4347-4358 (2013).
  11. Rettinger, E., et al. The cytotoxic potential of interleukin-15-stimulated cytokine-induced killer cells against leukemia cells. Cytotherapy. 14 (1), 91-103 (2012).
  12. Narayan, R., et al. Donor-derived cytokine-induced killer cell infusion as consolidation after nonmyeloablative allogeneic transplantation for myeloid neoplasms. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 19, 1083 (2019).
  13. Castiglia, S., et al. Cytokines induced killer cells produced in good manufacturing practices conditions: identification of the most advantageous and safest expansion method in terms of viability, cellular growth and identity. Journal of Translational Medicine. 16 (1), 237 (2018).
  14. Bonanno, G., et al. Thymoglobulin, interferon-γ and interleukin-2 efficiently expand cytokine-induced killer (CIK) cells in clinical-grade cultures. Journal of Translational Medicine. 8, 129 (2010).
  15. Iudicone, P., et al. Interleukin-15 enhances cytokine induced killer (CIK) cytotoxic potential against epithelial cancer cell lines via an innate pathway. Human Immunology. 77 (12), 1239-1247 (2016).
  16. Liu, J., et al. Phenotypic characterization and anticancer capacity of CD8+ cytokine-induced killer cells after antigen-induced expansion. PLoS One. 12 (4), 0175704 (2017).
  17. Chen, D., et al. Cytokine-induced killer cells as a feasible adoptive immunotherapy for the treatment of lung cancer. Cell Death & Disease. 9 (3), 366 (2018).
  18. Tario, J. D. Jr Monitoring cell proliferation by dye dilution: considerations for probe selection. Methods in Molecular Biology. 1678, 249-299 (2018).
  19. Last'ovicka, J., et al. Assessment of lymphocyte proliferation: CFSE kills dividing cells and modulates expression of activation markers. Cellular Immunology. 256 (1-2), 79-85 (2009).
  20. Yoshida, T., et al. Characterization of natural killer cells in tamarins: a technical basis for studies of innate immunity. Frontiers in Microbiology. 1, 1-9 (2010).

Tags

Kræftforskning adoptivcelleimmunterapi cytokin-induceret dræbercelle perifere blodmononukleare celler hæmatologiske og solide kræftformer immuncellulær terapi cytototoksisk effekt flow cytometri
Isolering og udvidelse af cytotoksiske cytokin-induceret Killer T Celler til kræftbehandling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hsiao, C. H., Chiu, Y. H., Chiu, S.… More

Hsiao, C. H., Chiu, Y. H., Chiu, S. C., Cho, D. Y., Lee, L. M., Wen, Y. C., Li, J. J., Shih, P. H. Isolation and Expansion of Cytotoxic Cytokine-induced Killer T Cells for Cancer Treatment. J. Vis. Exp. (155), e60420, doi:10.3791/60420 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter