Summary
Diese Arbeit stellt ein Protokoll vor, um homogene Zellkulturen von primären okulomotorischen, Trochlea- und Spinalmotorneuronen zu ergeben. Diese Kulturen können für vergleichende Analysen der morphologischen, zellulären, molekularen und elektrophysiologischen Eigenschaften von augen- und spinalmotorischen Neuronen verwendet werden.
Abstract
Okulomotorische Neuronen (CN3s) und Trochlea-Neuronen (CN4s) weisen eine bemerkenswerte Resistenz gegen degenerative motorische Neuronenerkrankungen wie amyotrophe Lateralsklerose (ALS) im Vergleich zu Spinalmotorneuronen (SMNs) auf. Die Fähigkeit, primäre Maus-CN3s, CN4s und SMNs zu isolieren und zu kultiieren, würde einen Ansatz zum Untersuchen von Mechanismen bieten, die dieser selektiven Sicherheitsanfälligkeit zugrunde liegen. Bis heute verwenden die meisten Protokolle heterogene Zellkulturen, die die Interpretation experimenteller Ergebnisse verwirren können. Um die Probleme im Zusammenhang mit gemischten Zellpopulationen zu minimieren, sind reine Kulturen unverzichtbar. Hier wird im ersten Protokoll detailliert beschrieben, wie CN3s/CN4s zusammen mit SMNs-Gegenstücken aus denselben Embryonen mit embryonalen Tag 11.5 (E11.5) IslMN:GFP transgene Mausembryonen effizient gereinigt und kultiviert werden können. Das Protokoll enthält Einzelheiten zur Gewebesektion und -dissoziation, zur FACS-basierten Zellisolierung und zur In-vitro-Kultivierung von Zellen aus CN3/CN4- und SMN-Kernen. Dieses Protokoll fügt bestehenden Protokollen ein neuartiges In-vitro-Kultursystem cN3/CN4 hinzu und bietet gleichzeitig eine reine spezies- und altersgerechte SMN-Kultur zum Vergleich. Analysen, die sich auf die morphologischen, zellulären, molekularen und elektrophysiologischen Eigenschaften motorischer Neuronen konzentrieren, sind in diesem Kultursystem möglich. Dieses Protokoll wird die Erforschung der Mechanismen ermöglichen, die die Entwicklung des motorischen Neurons, die selektive Anfälligkeit und die Krankheit definieren.
Introduction
Die Kultur der primären motorischen Neuronen ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das die Untersuchung der neuronalen Entwicklung, Funktion, und Anfälligkeit für exogene Stressoren ermöglicht. Motorische Neuronenkulturen sind besonders nützlich für die Untersuchung neurodegenerativer Erkrankungen wie der amyotrophen Lateralsklerose (ALS)1,2, deren Krankheitsmechanismen unvollständig verstanden werden. Interessanterweise sind trotz des signifikanten Zelltodes von Spinalmotorneuronen (SMNs) bei ALS-Patienten und ALS-Modellmäusen der Zelltod in okulomotorischen Neuronen (CN3s) und Trochlea-Neuronen (CN4s) relativ knapp1,3,4,5,6,7,8,9. Daher könnten vergleichende Analysen reiner Kulturen von CN3s/CN4s und SMN wichtige Hinweise auf Mechanismen liefern, die der relativen Verwundbarkeit zugrunde liegen. Leider war ein großes Hindernis für solche Analysen die Unfähigkeit, gereinigte Kulturen dieser motorischen Neuronen zu züchten.
Viele Protokolle wurden für die Reinigung von SMNs aus Tiermodellen beschrieben. Die meisten dieser Protokolle verwenden Dichtegradientzentrifugation10,11,12 und/oder p75NTR-Antikörper-basierte Zellsortierungs-Schwenktechniken13,14,15,16. Die Dichtegradientenzentrifugation nutzt die größere Größe von SMNs im Vergleich zu anderen Rückenzellen aus, während p75NTR ein extrazelluläres Protein ist, das ausschließlich von SMNs im Rückenmark exprimiert wird. Fast 100% reine SMN-Kulturen wurden von einem oder beiden dieser Protokolle11,12,14erzeugt. Diese Protokolle waren jedoch nicht erfolgreich bei der Erzeugung von CN3/CN4-Kulturen, da CN3s/CN4s p75NTRnicht ausdrücken und andere spezifische CN3/CN4-Marker nicht identifiziert wurden. Sie sind auch kleiner als SMNs und daher schwieriger zu isolieren, basierend auf der Größe. Stattdessen haben sich In-vitro-Studien von CN3s oder CN4s auf dissoziierte17,18,19,20,21, Explant17,22,23,24,25,26und Slice27,28 Kulturen, die aus heterogenen Zelltypen bestehen, und keine Protokolle für die Isolation und Kultur von primären CN3s oder CN4s.
Hier wird ein Protokoll für die Visualisierung, Isolierung, Reinigung und Kultivierung von CN3s, CN4s und SMNs vom selben Embryonaltag 11.5 (E11.5) IslMN:GFP transgene Mäuse29 (Abbildung 1, Abbildung 2A) beschrieben. IslMN:GFP kennzeichnet speziell motorische Neuronen mit einem farnesylierten GFP, das auf die Zellmembran lokalisiert. Dieses Protokoll ermöglicht einen art- und altersgerechten Vergleich mehrerer Arten von motorischen Neuronen, um pathologische Mechanismen bei motorischen Neuronenerkrankungen aufzuklären.
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Protocol
Alle Experimente mit Labortieren wurden in Übereinstimmung mit den NIH-Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren und mit Genehmigung des Animal Care and Use Committee des Boston Children es Hospital durchgeführt.
1. Einrichten von zeitierten Matings vor der Zerlegung
- Um pränatale embryonale Mäuse für die motorische Neuronenernte zu erzeugen, wiegen Sie jede weibliche Maus und richten Sie eine zeitgefällige Paarung zwischen erwachsenen IslMN:GFP transgenen Mäusen 11,5 Tage vor dem Tag der Neuronenisolation ein. Für die Entwicklung dieses Protokolls wurden 129S1/C57BL/6J IslMN:GFP-Mäuse im Alter von 2 bis 9 Monaten verwendet und am Abend eine zeitgefällige Paarung eingerichtet.
- Untersuchen Sie weibliche Mäuse am nächsten Morgen auf Vaginalstecker. Betrachten Sie das Datum, an dem der Stecker als embryonaler Tag (E) 0,5 identifiziert wird.
- Wiegen Sie weibliche Mäuse und untersuchen Sie Welpen mit Ultraschall (siehe Materialtabelle)zwischen E8.5-11. Überprüfen Sie die Anzeichen einer erfolgreichen Paarung.
- Bestätigen Sie die erfolgreiche Paarung, indem Sie Gewichtszunahme bei weiblichen Mäusen erkennen (in der Regel >1,5 g bei E9.5, wenn es mehr als 5-6 Embryonen gibt).
- Bestätigen Sie Embryonen visuell unter Ultraschall. Embryonen sind nach E9.5 leicht durch Ultraschall nachweisbar. Ultraschall wird nur an Frauen durchgeführt, die an Gewicht gewonnen haben, weil sie häufiger schwanger sind als solche, die es nicht tun.
HINWEIS: Weibliche Mäuse können Gewicht aus anderen Gründen als der Schwangerschaft zu gewinnen, so Gewichtszunahme allein ist kein zuverlässiger Indikator für eine Schwangerschaft. Ultraschall-Bestätigung verhindert unnötige Opfer von Frauen, die nicht schwanger sind, aber nicht entscheidend ist, wenn nicht verfügbar.
2. Sezierbedingungen und Vorbereitung von Instrumenten
- Führen Sie alle Beschichtungen (außer Säurereinigung von Coverlips), Medienvorbereitung, Gewebedissoziation (außer Zentrifugation und Inkubation) und Kulturarbeit in einer laminaren Durchflusshaube durch, um die Sterilität der Medien und embryonalen motorischen Neuronen zu gewährleisten.
- Führen Sie mit sorgfältiger Aufmerksamkeit auf sterile Technik die Gewebesektion außerhalb einer laminaren Durchflusshaube mit minimalem Kontaminationsrisiko durch.
- Sterilisieren Sie eine Sezierplatte, eine Mikrosezierende Schere, ein Paar Daumenverbandszange, zwei Paar Dumont #5 Pinzette, ein Mikrosezierendes Messer und einen Moria Mini perforierten Löffel, indem Sie vor der Verwendung in 70% Ethanol eintauchen.
3. PDL/Laminin Beschichtung von Geschirr/Coverslips
HINWEIS: Kultur dissoziierte primäre motorische Neuronen in 96 Brunnen oder 24 Brunnenplatten, abhängig von der Anzahl der Zellen, die für die Anwendung benötigt werden. Zellen können direkt in der Gewebekulturplatte ohne Verwendung von Decklippen abgebildet werden, wenn die Brunnen optisch transparent sind und die Dicken mit der Bildgebung kompatibel sind.
- Für Anwendungen, die Abdeckungen benötigen, bereiten Sie säuregereinigte, sterilisierte und luftgetrocknete Abdeckungen mindestens 2 Tage vor der Neuronenisolation vor, wie zuvor beschrieben30. Chargen von Coverlips können auf diese Weise rechtzeitig vor Experimenten hergestellt und bis zu 6 Monate ohne Auswirkungen auf die experimentelle Qualität gelagert werden.
- Bereiten Sie 2 Tage vor der Neuronenisolation eine Arbeitslösung aus 20 g/ml Polyd-Lysin (PDL) in phosphatgepufferter Saline (PBS) vor.
- Aliquot PDL (1 mg/ml) im Voraus und bei -20 °C als Lagerlösung lagern.
- Bedecken Sie die Oberfläche jedes Abdeckrutsches oder des Brunnens der Gewebekulturplatte mit ausreichender PDL-Lösung (z. B. 100 l pro Brunnen auf 96 Wellplatten oder 500 l pro Brunnen auf 24 Wellplatten mit oder ohne Decklippen). Über Nacht bei 37 °C inkubieren.
- Am nächsten Tag 3x mit sterilisiertem Wasser waschen.
- Versiegeln Sie die Platten mit Paraffinfolie und lagern Sie die gewaschenen PDL-beschichteten Platten bei 4 °C bis zu 1 Monat, wenn sie nach der letzten Wäsche vollständig getrocknet werden.
- Bereiten Sie eine Arbeitslösung mit 10 l Laminin (1,1 x 1,2 mg/ml) in 1,2 ml PBS vor.
- Aliquot Lamininvorräte (1,1 bis 1,2 mg/ml) im Voraus und bei -80 °C lagern.
- Bedecken Sie die Oberfläche jedes Coverslips oder gut mit genügend Lamininlösung, um die Oberfläche gleichmäßig zu beschichten. Vor der Anwendung mindestens 2 h bei 37 °C inkubieren.
HINWEIS: PDL/lamininbeschichtete Platten und Decklippen können bis zu 1 Woche bei 37 °C gelagert werden, aber es wird frisch beschichtetes Laminin bevorzugt. Laminin direkt vor der Beschichtung30entfernen. Laminin darf nicht austrocknen. Wenn die Platten länger als mehrere Stunden gelagert werden sollen, sollten sie in Paraffinfolie eingewickelt werden.
4. Vorbereitung von Dissektions-, Motorneuron-Kulturmedien und Dissoziationslösungen
HINWEIS: Die Konzentrationen in Klammern geben die Endkonzentrationen jedes Reagenzes an.
- Bereiten Sie das Seziermedium vor.
- Das wärmeaktivierte Pferdeserum über Nacht bei 4 °C auftauen, 1 ml Aliquots vorbereiten und bei -20 °C lagern. Thaw Aliquots bei RT direkt vor gebrauchen.
- B27-Ergänzung (50x) in 1 ml Aliquots bei -20 °C lagern. Thaw aliquots bei RT unmittelbar vor gebrauch. Vermeiden Sie Gefrier-/Tauzyklen.
- Glutamin-Ergänzung (100x) bei 4 °C oder -20 °C lagern. Bei Lagerung bei -20 °C in 0,5 ml Aliquots aufteilen.
- Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) in 1 ml Aliquots bei -20 °C lagern. Thaw aliquots bei RT unmittelbar vor gebrauch.
- Um das Sezieren medium zu machen, Mischen Sie 9,4 ml Hibernate E mit 200 l Pferdeserum (2%), 200 l 50x B27-Zulage (1x), 100 l 100-L mit 100-fachem Glutamin-Zusatz (1x) (z.B. GlutaMAX) und 100 l mit 10.000 U/mL Penicillin-Streptomycin (100 U/ml). Verwenden Sie dieses Medium zum Sammeln von seziertem Gewebe und zur endgültigen Suspension von dissoziierten Zellen.
- Fügen Sie 500 l des Dissektionsmediums zu einzelnen 1,7 ml Mikrozentrifugenröhren für die Gewebesammlung am Tag vor der Neuronenisolation hinzu. Bereiten Sie ein Rohr für jeden Gewebetyp vor, der gesammelt wird (z. B. Positivkontrolle, Negativkontrolle, CN3/CN4, SMN) und lagern Sie vor der Verwendung bei 4 °C.
- Kombinieren Sie 49 ml Hibernate E Low Fluoreszenzmedien mit 1 ml B27-Beilage (1x) und füllen Sie eine 24-Well-Platte mit diesem Medium (2 ml/gut) am Tag vor der Neuronenisolation. Verwenden Sie diese Schale zum Sammeln von Mausembryonen. Vor der Anwendung bei 4 °C lagern.
- Bereiten Sie das Medium motorische Neuronenkultur vor.
- Bereiten Sie 250 L Aliquots von 25 mM 2-Mercaptoethanol in Leibovitz' L15 Medium vor. Bei -20 °C lagern.
- Generieren Sie 5 L-Aliquots von 100 g/ml-Lösungen von BDNF, CNTF und GDNF, die in sterilisiertem Wasser verdünnt werden. Bei -80 °C auftauen und bei RT unmittelbar vor Gebrauch auftauen.
- Bereiten Sie die 10 mM Forskolin-Lösung vor, indem Sie 64 l Dimethylsulfoxid (DMSO) zu 5 mg (1,0670 m) Forskolin und Wirbel gut auflösen. Dann sterilisiertes Wasser (1.003 ml) in die DMSO-Lösung geben und gut wirbeln. 12 L Aliquots von 10 mM Forskolin bei -20 °C lagern und unmittelbar vor Gebrauch bei RT auftauen.
- Bereiten Sie 12 L Aliquots von 100 mM Isobutylmethylxanthin (IBMX) in DMSO verdünnt. Bei -20 °C auftauen und bei RT unmittelbar vor Gebrauch auftauen.
- Um die motorische Neuronenkultur mittelzumachen, mischen Sie 9,4 ml neurobasales Medium mit 200 l Pferdeserum (2%), 200 l 50x B27-Ergänzung (1x), 100 l 100x Glutamin-Ergänzung (1 x), 100 l mit 10.000 U/m: Penicillin-Streptomycin (100 U/ml) und 20 l 25 mM 2-Mercaptoethanol (50 'M), vorzugsweise direkt vor der Anwendung. Dieser Schritt kann bis zu 1 Tag vor der Neuronenisolation durchgeführt werden.
- Kurz vor der Verwendung fügen Sie dem Motorneuronen-Kulturmedium 10 0l/ml (10 ng/mL), CNTF (10 ng/mL) und GDNF (10 ng/mL) und 10 l mit 10 mM Forskolin (10 m) und 10 l mit 100 mM IBMX (100 mM) hinzu. Das Medium auf 37 °C vorwärmen.
- Bereiten Sie die Dissoziationslösungen vor.
- Bereiten Sie die Papainlösung (20 U/ml Papain und 0,005% DNase) und eine Albumin-Ovomucoid-Inhibitorlösung (1 mg/ml Ovomucoid-Inhibitor, 1mg/ml Albumin und 0,005% DNase) nach den Anweisungen des Herstellers vor.
- Bereiten Sie 500 L Aliquots von jedem Ovomucoid-Inhibitor und Papain-Lösungen vor und lagern Sie bei -80 °C. Mindestens bei 37 °C auftauen.
5. Ventrale Mittelhirn- und Rückenmarkszerlegung
HINWEIS: Führen Sie alle folgenden Schritte mit Ausnahme der Schritte 5.1.1-5.1.3 und 5.1.5-5.1.6 unter einem Fluoreszenz-Dissektions-Stereomikroskop aus. Die Gesamtdissektionszeit pro Experiment beträgt in der Regel 3-5 h, abhängig von der Beherrschung der Seziertechnik und der Anzahl der für jedes Experiment erforderlichen motorischen Neuronen.
- Ventrale Mittelhirnsektion
- Euthanisieren Sie eine schwangere Maus etwa 11,5 Tage nach der Befruchtung durch Kohlendioxidgas und Zervixdislokation.
- Sprühen Sie den Bauch gründlich mit Ethanol und entfernen Sie die Gebärmutter mit steriler Mikrosesektierungsschere und Daumenverbandszange. Waschen Sie die Gebärmutter kurz in sterilem PBS, dann auf die Sezierplatte mit vorgekühlten sterilen PBS gefüllt übertragen.
- Entfernen Sie die IslMN:GFP-positivenEmbryonen vorsichtig aus der Gebärmutter mit sterilen Mikrosezierenscheren, Daumenverbandszangen und Dumont #5 Pinzette in eiskalten sterilen PBS unter dem hellen Licht des Mikroskops. Übertragen Sie jeden Embryo mit einem sterilen Moria Mini-Perforat-Löffel in einen separaten Brunnen einer 24-Well-Platte, gefüllt mit vorgekühltem Hibernate-E-Low-Fluoreszenzmedium, ergänzt mit 1x B27. Halten Sie die 24 Brunnenplatte auf Eis.
- Einen Embryo auf eine sterile Sezierplatte übertragen und vollständig mit der eiskalten sterilen Hank-Ausgewogene Salzlösung (HBSS) bedecken.
- Stellen Sie sicher, dass die Sezierschritte unter Fluoresceinisothiocyanat (FITC) Beleuchtung des Mikroskops durchgeführt werden. Entfernen Sie mit einer Pinzette den Schwanz und das Gesicht des Embryos, ohne das Mittelhirn zu beschädigen (Abbildung 2Ba). Platzieren Sie den Embryo anfällig mit Gliedmaßen, die unter und Schwanz nach vorne zeigen, in Richtung des Dissektors (angezeigt durch ein Sternchen, Abbildung 2Bb).
- Mit einer Pinzette wird das Dach des vierten Ventrikels aufgeschlitzt, um eine kleine Öffnung zu erzeugen. Verwenden Sie diese Öffnung, um eine Pinzette in den Raum zwischen dem vierten Ventrikel und seinem Dach einzuhaken. Sezieren Sie entlang der dorsalen Oberfläche des Embryorostrals zum Kortex und seitlich zur Bodenplatte und Motorsäule (Abbildung 2Ca,b). Öffnen Sie das sezierte Gewebe in einer offenen Buchweise, um die GFP-positiven CN3- und CN4-Kerne zu enthüllen.
HINWEIS: Ein kleines Stück Gewebe aus dem ventralen Mittelhirn, das Mesenchym, CN3 und CN4 enthält, wird nun freigelegt. - Trennen Sie vorsichtig das ventrale Mittelhirn vom Embryo und entfernen Sie Meningealgewebe mit einer Pinzette und einem Mikrotrennmesser. Sezieren Sie die bilateralen GFP-positiven CN3- und CN4-Kerne weg von der Bodenplatte und anderen GFP-negativen Umgebensgeweben mit einer Pinzette und einem Mikrosezierendes Messer (Abbildung 2D). Maximieren Sie die Anzahl der GFP-positiven motorischen Neuronen im ausgeschnittenen Gewebe, vermeiden Sie es jedoch, sie zu berühren oder zu beschädigen.
- Wenn eine Sammlung von separaten CN3- und CN4-Kernen gewünscht wird, entlang der Mittellinie dieser beiden Kerne schneiden (gelbe gepunktete Linie in Abbildung 2D). Mit einer P1000 Pipette das sezierte ventrale Mittelhirngewebe mit minimalem HBSS sammeln und in ein mit Dissektionsmedium gefülltes 1,7 ml Mikrozentrifugenrohr legen (siehe Schritt 4.1.5). Auf Eis bis zur Dissoziation aufbewahren.
- Setzen Sie die Pooling ventralen Midbrains aus zusätzlichen Embryonen in der gleichen Röhre fort, bis die Gesamtzahl die experimentelle Anforderung erfüllt (siehe Schritt 8 für ideale Zellzahlen).
HINWEIS: Eine gepoolte Sammlung von mindestens 10 ventralen Mittelhirnen, die etwa 1 x 104 CN3/CN4 Motorneuronen ergeben, wird empfohlen, da Gewebe während der Dissoziation und Sortierung Stress ausgesetzt sind.
- Ventrale Rückenmarkssektion
- Halten Sie den Embryo anfällig mit dem Kopf nach vorne des Mikroskops, in Richtung des Dissektors. Halten Sie den Embryo mit einer Pinzette und legen Sie die Spitze des anderen Pinzettenpaares in den ungeöffneten kaudalen Teil der vierten Herzkammer ein.
- Öffnen Sie den Rest des Hinterhirns und des Rückenmarks dorsal über die gesamte rostrocaudale Ausdehnung des Embryos. Öffnen Sie durch Schneiden von rückendem Gewebe, beginnend mit dem vierten Ventrikel und Arbeiten in Richtung des zentralen Kanals des kaudalen Rückenmarks mit den Zangen als Schere (Abbildung 2Ca,b). Achten Sie darauf, das ventrale Rückenmark während dieses Eingriffs zu berühren oder zu beschädigen.
- Halten Sie den Embryo mit einer Pinzette und kneifen Sie die Klappe des Rückengewebes auf jeder Seite mit dem anderen Paar Pinzette (Abbildung 2Ea,b).
HINWEIS: Ausgeschnittene dorsale Gewebe enthalten dorsale Haut, Mesenchym, dorsale Wurzelganglien (DRGs), dorsales Hinterhirn und Rückenmark. Entfernen Sie so viel wie möglich von diesen Geweben, ohne die SMN-Kerne zu beschädigen, da sie klebend sind und SMNs während der Filterung einfangen können oder während der FACS-Sortierung Verstopfungen verursachen können. - Entfernen Sie das ventrale Rückenmark mit dem Mikrodissektionsmesser, um direkt unter dem GFP-positiven SMN zu durchdringen. Heben Sie das ventrale Rückenmark mit sägeartigen Bewegungen auf beiden Seiten an (Abbildung 2Fa,b). Schneiden Sie das schwimmende ventrale Rückenmark quer direkt über C1, wo die ersten GFP-positiven vorderen Hornprojekte (Abbildung 2G). Auch quer an der oberen Grenze der unteren Extremität schneiden (Abbildung 2G). Entfernen Sie nach diesem Eingriff den zervikalen (C1)-Lumbar (L2-L3) Teil des ventralen Rückenmarks.
- Legen Sie das ventrale Rückenmark dorsale Seite nach oben und halten Sie, indem Sie das GFP-negative Gewebe zwischen die GFP-positiven SMN-Säulen mit einer Pinzette drücken. Entfernen Sie das verbleibende angebrachte Mesenchym, DRGs und rückenförmiges Rückenmark, indem Sie beide Seiten der GFP-positiven SMN-Säule mit dem Mikrodissektionsmesser beschneiden (Abbildung 2H). Achten Sie darauf, GFP-positive motorische Neuronen zu maximieren, ohne sie zu beschädigen.
- Mit einer P1000 Pipette das sezierte ventrale Rückenmarksgewebe mit minimalem HBSS sammeln und in das SMN-markierte 1,7 ml Mikrozentrifugenrohr mit Dissektionsmedium legen. Auf Eis bis zur Dissoziation aufbewahren. Pooling ventralen Rückenmark aus zusätzlichen Embryonen in der gleichen Röhre, bis die Gesamtzahl die experimentellen Anforderungen erfüllt.
HINWEIS: Das Sammeln von mindestens drei ventralen Rückenmark mit ca. 2,1 x 104 SMN wird empfohlen, da Gewebe bei der Dissoziation und Sortierung Stress ausgesetzt sind. - Sammeln Sie gesichtsmotorische Neuronen und Extremitäten der Isl MN:GFP-Mausembryonen als GFP-positive und GFP-negative Kontrollen für fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS). Extremitäten sind GFP-negativ, da sich die GFP-positiven Axone der SMNs in diesem embryonalen Zeitalter noch nicht in die Extremitäten ausgedehnt haben.
6. Gewebedissoziation
HINWEIS: Die Gesamtdissoziationszeit beträgt in der Regel 1,5 h pro Experiment.
- Warmes Papain und Albumin-Ovomucoid-Inhibitor-Lösung aliquotiert bis 37 °C 30 min vor der Dissoziation.
- Drehen Sie mikrosezierte gewebe mit geringer Geschwindigkeit kurz herunter.
- Mit einer P100 Pipette, vorsichtig entfernen Sie so viel Hibernate E wie möglich, ohne Gewebe zu aspitrieren.
HINWEIS: Achten Sie darauf, alle restliche Hibernate E nach diesem Schritt zu entfernen, um zu vermeiden, die Wirksamkeit der Papain-Dissoziation im nächsten Schritt zu reduzieren. - Fügen Sie jedem der 1,7 ml Mikrozentrifugenröhren, die die mikrosezierten Gewebeproben enthalten, das entsprechende Volumen der Papainlösung (Tabelle 1) hinzu.
HINWEIS: Das geeignete Volumen von Papain für die Dissoziation wurde bestimmt, um die effektive Dissoziation zu maximieren und gleichzeitig die Belastung der Zellen zu minimieren. - 8x mit einer P200 Pipette sanft trituieren. Führen Sie alle Triturationsschritte schonend durch, um die Motorneuronenlebensfähigkeit zu erhalten.
- Inkubieren Sie die Rohre, die die Gewebe für 30 min bei 37 °C enthalten, rühren durch Fingerstreich10x alle 10 min. Jede Suspension 8x mit einer P200 Pipette nach der Inkubation sanft trituieren. Drehen Sie die Zellen bei 300 x g für 5 min.
- Um die Wirksamkeit der Ovomucoid-Hemmung im nächsten Schritt zu gewährleisten, verwenden Sie eine P1000 Pipette, um so viel Überstand wie möglich zu entfernen und zu entsorgen, ohne das Gewebe zu aspirating.
- Pellets in der entsprechenden Menge der Albumin-Ovomucoid-Inhibitorlösung (Tabelle 1) durch sanftetrituierende 8x mit einer P200 Pipette resuspendieren.
- Warten Sie 2 min, damit sich die verbleibenden Teile des nicht soziierten Gewebes an der Unterseite des Rohres absetzen können.
- Sammeln Sie so viel Überstand wie möglich, ohne unsoziale Gewebe mit einer P200 Pipette zu aspitrieren. Übertragen Sie den Überstand auf frische 1,7 ml Mikrozentrifugenrohre.
- Wenn einige Gewebestücke nach Schritt 6.10 unverbunden bleiben, wiederholen Sie die Schritte 6.8-6.10 für die nicht soziierten Gewebe, die in den ursprünglichen 1,7 ml Mikrozentrifugenröhren verbleiben, um die Endausbeute dissoziierter Zellen zu maximieren und gleichzeitig die Belastung der Zellen zu minimieren und gleichzeitig die Belastung der Zellen zu minimieren. zuvor dissoziiert, enthalten im Überstand von Schritt 6.10.
- Drehen Sie die Zellen bei 300 x g für 5 min. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand vorsichtig mit einer P1000 Pipette.
- Setzen Sie das Pellet im entsprechenden Volumen des Seziermediums (Tabelle 1) durch Pipettieren von 8x mit einer P1000 Pipette aus. Das entsprechende Volumen der Endsuspension wurde so bestimmt, dass die Zelldichte 107 Zellen/ml nicht überschreitet, was den Strom der Durchflusszytometriemaschine blockieren kann, aber auch, dass die Zellen nicht übermäßig verdünnt werden, was zu einer verlangsamten Sortiergeschwindigkeit führt.
- Filtern Sie die Suspensionen durch 70 m Zellsiebe, um große Klumpen oder unverdautes Gewebe zu eliminieren. Die Suspensionen in 5 ml runde Polystyrol-Reagenzgläser übertragen und auf Eis lagern, bis es erforderlich ist.
7. Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS)
HINWEIS: Dieses Protokoll wurde mit einem FACS-Sortierer optimiert, der mit einem 15 mw 405 nm violetten Laser, einem 100 mw 488 nm blauen Laser, einem 75 mw 594 nm orangen Laser und einem 40 mw 640 nm roten Laser ausgestattet ist. Die Zellen wurden als Mantelflüssigkeit in sterilem PBS unter aseptischen Bedingungen durch eine 100-m-Düse sortiert. Um die Zellspannung zu minimieren, wurde die Durchflussrate auf einen Probendruck von 1 bis 3 eingestellt, so dass maximal 1.000 bis 4.000 Ereignisse pro Sekunde erfasst wurden. Die Gesamt-FACS-Zeit beträgt in der Regel 1 x 2 H pro Experiment.
- Richten Sie Spannungen für vorwärts- und seitenstreuende Spannungen ein, damit die Zellpopulation richtig visualisiert werden kann. Das Einrichten geeigneter Spannungen für die Zellsortierung ist komplex und erfordert einen erfahrenen FACS-Betreiber.
- Um verschiedene Zellpopulationen zu unterscheiden, zeichnen Zellen basierend auf der Größe, die durch den Vorwärtsstreubereich (FSC-A) bestimmt wird, im Vergleich zur internen Komplexität, die durch den Side Scatter Area (SSC-A) bestimmt wird. Zeichnen Sie ein Tor um die lebenden Zellen, wie in Abbildung 3Aa und Abbildung Ba angegeben, um Trümmer und abgestorbene Zellen auszuschließen. Gruppieren Sie die Zellen innerhalb des gated-Bereichs als Grundgesamtheit 1 (P1).
- Um Zellklumpen und Doublets auszuschließen, zeichnen Sie Als nächstes P1-Zellen basierend auf der Side Scatter Width (SSC-W) im Vergleich zum SSC-A. Gate die Population der einzelnen Zellen als Population 2 (P2) (Abbildung 3Ab und Abbildung Bb).
- Plot P2-Zellen basierend auf der Vorwärtsstreubreite (FSC-W) im Vergleich zu FSC-A und Gate der Grundgesamtheit einzelner Zellen als Grundgesamtheit 3 (P3) (Abbildung 3Ac und Abbildung Bc).
HINWEIS: Die Verwendung von zwei aufeinanderfolgenden Toren in 7.3 und 7.4 schließt Zellklumpen und Doublets (hohe FSC-W und hohe FSC-A) aus. - Gate P3-Zellen basierend auf GFP versus Allophycocyanin (APC). Der APC-Kanal erkennt die Autofluoreszenz. Durch das Gating auf diesem Kanal wird die Erfassung autofluoreszierender Zellen vermieden. Verwenden Sie GFP-negative Zellen, um die Spannung für FITC/GFP-Leuchtstoffkanäle anzupassen. Idealerweise positionieren Sie Tore für diese Zellpopulationen um 102. Wählen Sie die Gate-Schwellenwerte für die GFP-positive Population 4 (P4) einzeln für jeden Motorneurontyp aus (Abbildung 3Anzeige und Abbildung Bd).
HINWEIS: Stellen Sie das GFP-Gate für SMNs viel höher ein als für CN3s/CN4s, um eine reine Kultur zu erhalten (Abbildung 3Anzeige und Abbildung Bd). Ein niedrigeres GFP-Tor für SMN-Kulturen führt zur Kontamination der Kulturen durch Glia und nicht-motorische Neuronen. Dies ist wahrscheinlich, weil es Low-Level-GFP-Expression in einigen Glia und nicht-motorischen Neuronen aufgrund eines undichten Promoter. Der Prozentsatz der GFP-positiven Zellen im Vergleich zu Gesamtzellen beträgt in der Regel 0,5 bis 1,5 % für CN3s/CN4s und 1,5 %2,5 % für SMNs. Wenn die Sezierung erfolgreich war, können diese Zahlen als Benchmark verwendet werden, um die geeignete Position für das GFP-positive Gate zu bestimmen (Abbildung 3Ae und Abbildung Be). - Führen Sie FACS gemäß dem Herstellerprotokoll aus. Sammeln Sie P4-Zellen in frische 1,7 ml Mikrozentrifugenröhren, die mit 500 l motorischem Neuronenkulturmedium gefüllt sind. Auf Eis bis zum Plattieren aufbewahren.
HINWEIS: Obwohl die Zellen direkt in die Brunnen sortiert werden können, führt dies zu einer ungleichmäßigen Anzahl von Zellen pro Brunnen. Sortieren Sie die Zellen in 1,75 ml Mikrozentrifugenrohre und verschichten Sie dann manuell, um eine gleichmäßigere Beschichtungsverteilung zu erreichen.
8. Kultur der gereinigten primären Motorneuronen
- Verdünnt FACS-isolierte CN3/CN4- und SMN-Suspensionen mit motorischem Neuronenkulturmedium auf 37 °C auf Dichten von 5 x 103 bzw. 1 x 104 Zellen/ml vorgewärmt.
HINWEIS: Ein E11.5 Embryo liefert etwa 1 x 103 CN3/CN4 und 7 x 103 SMN. Diese Erträge hängen jedoch stark von der Reinheit von sezierten Geweben, der Gründlichkeit der Zelldissoziation und der entsprechenden Schwellenvon GFP-Gattern während der FACS ab. - Übertragen Sie 96 mit PDL und Laminin vorbeschichtete Wellplatten aus dem 37 °C Gewebekultur-Inkubator auf die laminare Strömungshaube und Aspiratlaminin aus jedem Brunnen. Verwenden Sie Teller und Decklippen sofort ohne waschen.
- Fügen Sie 200 L verdünnte CN3/CN4- und SMN-Aufhängungen in die einzelnen Bohrungen von PDL/Laminin-beschichteten 96-Wellplatten ein. Die endgültige Zelldichte sollte 1 x 103 und 2 x 103 Zellen/Well für CN3/CN4 bzw. SMN betragen.
HINWEIS: Die anfängliche Beschichtungsdichte von SMNs in 96 Bohrplatten (2 x 103 Zellen/Well) ist doppelt so hoch wie die von CN3s/CN4s (1 x 103 Zellen/Well), um ähnliche endgültige motorische Neuronenzahlen und Dichten bei 2 und 9 Tagen in vitro (DIV) (4x6 x 102 bzw. 2x4 x 102 Zellen pro Brunnen) zu erhalten. - Kulturneuronen in einem 37 °C, 5% CO2-Inkubator.
- Füttern Sie Neuronen alle 5 Tage, indem Sie die Hälfte der alten Medien (100 l) entfernen und durch das gleiche Volumen des frischen motorischen Neuronenkulturmediums ersetzen. Stellen Sie sicher, dass neuronale Prozesse auf 1 DIV sichtbar werden und um 14 DIV dicker und länger werden (Abbildung 4). Neuronale Zellkörper werden vergrößert und neigen dazu, sich in Langzeitkulturen zu aggregieren, insbesondere bei SMNs (Abbildung 4).
HINWEIS: Führen Sie alle Medien- und Lösungsänderungen durch, indem Sie die Hälfte des ursprünglichen mittleren Volumens belassen, um das Lösen kultivierter Zellen zu vermeiden. Dazu gehören Fixierungs- und Immunzytochemie (ICC) Schritte. Wenn alle Medien entfernt werden, unabhängig davon, wie sanft, werden die meisten Zellen ablösen und weggewaschen werden.
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Representative Results
Ziel dieses Protokolls war es, sowohl primäre CN3s/CN4s als auch SMNs langfristig hoch zu reinigen und zu kultivieren, um vergleichende Analysen der Mechanismen zu ermöglichen, die motorischen Neuronenstörungen zugrunde liegen (siehe Abbildung 1 und Abbildung 2 zur Übersicht).
Sobald Neuronen erfolgreich isoliert und in der Kultur angebaut wurden, wurden fast reine primäre CN3/CN4- und SMN-Kulturen erhalten (Abbildung 5A,B) und für mindestens 14 DIV aufrechterhalten (Abbildung 4 und Abbildung 6). Die Reinheit der CN3/CN4- und SMN-Kulturen bei 2 DIV betrug 93,5 x 2,2 % bzw. 86,7 % bzw. 4,7 %, wenn sie vom ICC mit dem Motorneuronmarker Islet1 und dem neuronalen Marker TUJ1 (Abbildung 5B)bewertet wurden. Diese hohen Reinheitsmäßigkeiten beruhten jedoch stark auf dem Alter der Embryonen und der Festlegung geeigneter Schwellenwerte für GFP-Tore während der FACS (Abbildung 3). Die Zerlegung von Embryonen bei E10.5 ist aufgrund erhöhter Weichheit und Klebende des Gewebes schwieriger als die Zerlegung bei E11.5, was zu einer verminderten Motorneuronausbeute führt. Die Reinheit von E10,5 CN3s/CN4s und SMNs war jedoch mit denen für E11,5-Embryonen vergleichbar (92,8 % bzw. 82,2 % bei 2 DIV; Daten aus einem einzigen Experiment). Die Reinheit von CN3s/CN4s und SMNs ging dramatisch zurück, als E13.5-Embryonen verwendet wurden, auch wenn nur die höchste GFP-positive Population erhoben wurde (20,7% bzw. 7,4% bei 2 DIV; Daten aus einem einzigen Experiment), wahrscheinlich aufgrund der Expression von GFP in nicht-motorischen Neuronen (Abbildung 7). Dieselbe Tendenz galt auch für E12.5-Kulturen, wenn auch viel weniger dramatisch. Daher sind Embryonen bei E12.5 oder älter ungeeignet für die Verwendung bei der Reinigung von motorischen Neuronen mit diesem Protokoll.
Reine motorische Neuronenkulturen sind wertvoll für das Verständnis isolierter Wachstumsmuster, Verhaltensweisen und Schwachstellen von motorischen Neuronen. Dieses Beispiel zeigt, wie diese Kulturen verwendet werden können, um motorische Neuronenreaktionen auf chemische Behandlung zu testen. Um festzustellen, ob primäre CN3s/CN4s und SMNs unterschiedliche Reaktionen auf endoplasmatische Retikulum(ER)-Stressoren zeigen, wurden primäre Monokulturen von CN3s/CN4s und SMNs mit diesem Protokoll gewonnen und mit unterschiedlichen Konzentrationen eines ER-Stresses, Cyclopiazonsäure (CPA), behandelt. Neuronen wurden mit CPA (5, 10, 15, 20, 25 oder 30 M) oder Fahrzeugsteuerung (DMSO) bei 2 DIV behandelt und 3 Tage später für ICC zur Bewertung der Überlebensverhältnisse festgelegt (Abbildung 8A). Die Anzahl der lebensfähigen Neuronen in jeder Probe wurde gezählt und überlebensverhältnisse wurden als die Anzahl lebensfähiger Zellen in medikamentös behandelten Brunnen dividiert durch die Anzahl der lebensfähigen Zellen in den mit DMSO behandelten Brunnen berechnet. CN3/CN4-Monokulturen waren im Vergleich zu SMN-Monokulturen deutlich resistenter gegen CPA-Behandlungen (10 bis 25 M)(Abbildung 9 und Abbildung 8B)31.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll die Erzeugung hochgereinigter primärer Maus-Embryonal-CN4- und SMN-Kulturen ermöglicht, die ein leistungsfähiges und zuverlässiges System für die Untersuchung neuronalen Verhaltens bieten.
Abbildung 1: Schema zur Vorbereitung von mausembryonalen motorischen Neuronen. Der Schaltplan veranschaulicht die Schritte in der Isolierung und Kultur der embryonalen motorischen Neuronen der Maus und die ungefähre Zeit in Stunden oder Tagen für jeden Schritt. Die Reihenfolge des Sezierverfahrens für CN3/CN4 und für SMN wird jeweils sequenziell 1 bis 4 beschriftet. Abkürzungen: CN3/CN4 = oculomotor neuron/trochlear neuron; SMN = spinales motorisatelles Neuron; FACS = fluoreszenzaktivierte Zellsortierung; h = Stunde; d = Tag. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Zerlegung des ventralen Mittelhirns und des zervikalen (C1)-Lenden (L2-L3) Desrückenmarks. (A) Laterale (a) und dorsale (b) Ansichten von GFP-positiven motorischen Neuronen in einem E11.5 IslMN:GFP transgene Mausembryon unter Fluoresceinisothiocyanat (FITC) Beleuchtung. Ein ganzer E11.5-Embryo wurde wie zuvorbeschrieben 32 hergestellt, um den Embryo transparent zu machen. Anschließend wurde der Embryo durch Immunfluoreszenz-Etikettierung mit Anti-GFP-Färbung (grün) analysiert. Die Bilder wurden unter einem konfokalen Mikroskop aufgenommen. Skalenbalken = 200 m (Seitenansicht) und 400 m (dorsale Ansicht). Abkürzungen: S = superior; I = minderwertig; V = ventral; D = dorsal. (B-H) Dissektionsschritte, die auf Bildern von E11.5 ventralem Mittelhirn und ventralem Rückenmarksgewebe hervorgehoben sind, die mit einer ausgestatteten Kamera unter hellem Licht (Bb) oder FITC-Beleuchtung mit einem Fluoreszenz-Sezieren-Stereomikroskop aufgenommen wurden. Skalenbalken = 200 m (D) und 1 mm (A-C, E-H). (B) (a) Entfernung von Gesicht und Schwanz des Embryos durch Schneiden entlang der roten Linien. (b) Embryo zur Zerlegung positioniert. Die Positionierung der Vorderseite des Mikroskops wird durch ein Sternchen angezeigt. (C) Schneiden entlang der durchgezogenen roten Linie, um das Dach des vierten Ventrikels (a) Seitenansicht und (b) dorsale Ansicht zu öffnen. Verwendung dieser Öffnung, um entlang der Oberfläche des Embryos dorsal zum Gehirn zu schneiden (Trajektorie durch gestrichelten roten Pfeil angezeigt). Dadurch wird das Gewebe mit Mesenchym, CN3 und CN4 freilegt, das aus dem Schädel gehoben werden kann. Bei SMN-Sektion, Einsetzen von Zangen in die gleiche Öffnung zwischen dem vierten Ventrikel und seinem Dach, dann schneiden in Richtung der kaudalen Seite des Embryos (Trajektorie durch gestrichelten gelben Pfeil angezeigt). (D) Endansicht des ventralen Mittelhirns mit bilateralem GFP-positivem CN3 und CN4-Kernen. Die Ränder des Gewebes werden durch ein rotes Rechteck hervorgehoben. Schneiden entlang gelb gepunkteten Linie, um CN3 und CN4 Kerne getrennt zu sammeln, wenn gewünscht. (E) Nach dem Öffnen des restlichen Hinterhirns und des Rückenmarks, schlagen dorsale Gewebe über den roten Linien auf beiden Seiten mit Pinzette (a) vor und (b) nach. (F) Bilaterale Entfernung von überschüssigem Gewebe ventral zum Rückenmark entlang der roten Linie (a) vor, und (b) nach. (G) Schneiden des ventralen Rückenmarks an den beiden durch die roten Linien angegebenen Stellen. Auf der rostralen Seite, Schneiden des schwimmenden ventralen Rückenmarks quer über C1, wo das erste GFP-positive Vorderhorn projiziert wird. Schneiden des kaudalen Endes des Rückenmarks quer an der oberen Grenze der unteren Extremität. Sobald diese Schnitte gemacht sind, kann der zervikale (C1) durch Lendenwirbel (L2-L3) Teil des ventralen Rückenmarks entfernt werden. (H) Endansicht des ventralen Rückenmarks mit GFP-positiven SMN-Säulen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Repräsentative Sortierplots von ventralen Mittelhirnen (A) und ventralen Rückenmarks (B). (Aa und Ba) Vorwärtsstreubereich (FSC-A) versus Side Scatter Area (SSC-A) sortierte Parzelle vor dem Ausschluss von Schutt und abgestorbenen Zellen. (Ab, Bb, Ac, Bc) Sortierte Plots für den Ausschluss von Zellklumpen (b) und Doublets (c) basierend auf Width (SSC-W) versus SSC-A und Forward Scatter Width (FSC-W) bzw. FSC-A. (Anzeige und Bd) Sortierte Plots, um IslMNzu isolieren :GFP -positive motorische Neuronen. Um eine reine Kultur zu erhalten, muss das GFP-Gate für SMNs (Bd) höher eingestellt sein als für CN3s/CN4s (Ad). (Ae und Be) Prozentsätze der Zellen, die zur Erfassung durch FACS-Sortierung abgegrenzt wurden. %Übergeordnetestelltstelltstellt stellt den Prozentsatz der Zellen in der aktuellen Gated-Population relativ zur Anzahl der Zellen in der vorherigen Gated-Zellenpopulation dar, während %Total den Prozentsatz der Gated-Zellen relativ zur Gesamtzelle darstellt. Die erwarteten Prozentsätze der GFP-positiven Zellen im Vergleich zu den Gesamtzellen (rot verpackt) betragen 0,5 bis 1,5 % für CN3/CN4 und 1,5 bis 2,5 % für SMN. Wenn die Sezierung erfolgreich durchgeführt wurde, können diese Prozentsätze als Benchmark für die Einrichtung des GFP-positiven Gates in (Ad und Bd )verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Phasenkontrastbilder der primären CN3/CN4- und SMN-Monokulturen bei 2, 7 und 14 DIV. Repräsentative Differentialinterferenzkontrastbilder der primären CN3/CN4- und SMN-Kulturen wurden bei 2, 7 und 14 DIV mit invertiertem Fluoreszenzmikroskop mit entsprechender Bildaufnahme- und Verarbeitungssoftware und 40-fachen Objektiven aufgenommen. Neuronale Prozesse wurden dicker und länger um 14 DIV. Neuronale Zellkörpergrößen wurden vergrößert und neigten dazu, in Langzeitkulturen zu aggregieren, vor allem für SMNs. Beide Kulturen können mindestens 14 DIV beibehalten werden. Skalenbalken = 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Charakterisierungen isolierter E11.5-Maus-CN3/CN4- und SMN-Kulturen. (A) Repräsentative Immunzytochemiebilder von E11.5-Maus-CN3s/CN4s (oben) und SMNs (unten) für 2 DIV kultiviert. Immunfluoreszenz-Etikettierung mit dem neuronalen Marker TUJ1 (grün) und dem Motorneuronmarker Islet1 (rot), die zur Analyse von Neuronen und Kernen durchgeführt wurden, wurden mit DAPI (blau) gegenbewertet. Fast alle kultivierten Zellen waren motorische Neuronen (TUJ1+, Islet1+). Die Bilder wurden mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop mit entsprechender Bildaufnahme- und Verarbeitungssoftware und 20-fachen Objektiven aufgenommen. Die Proben wurden abgebildet und verarbeitet, um eine maximale Signalintensität ohne gesättigte Pixel zu erreichen. Die gesamte mikroskopische Arbeit und Bildverarbeitung in den folgenden Abbildungen wurde unter diesen Bedingungen durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. Skala bar = 100 m. (B) Die Reinheit der E11.5-Maus-CN3/CN4- und SMN-Kulturen bei 2 DIV. Die Reinheit der Kulturen CN3/CN4 und SMN betrug 93,5 x 2,2 % bzw. 86,7 % 4,7 %. Tote neuronale Zellkörper wurden durch Screening auf pyknotische Kernmorphologie und Membranschwellung untersucht. Neuronale Prozesse wurden als degenerierende Prozesse klassifiziert, wenn Anzeichen von Perlen und Schwellungen beobachtet wurden. Zellen mit zelligem Körpertod oder degenerierenden Prozessen galten als lebensfähige nicht-motorische Neuronen (TUJ1+, Islet1-) oder lebensfähige motorische Neuronen (TUJ1+, Islet1+)33. Die Reinheit der motorischen Neuronenkulturen wurde berechnet als die Anzahl der lebensfähigen motorischen Neuronen geteilt durch die Gesamtzahl der lebensfähigen nicht-motorischen Neuronen plus lebensfähige motorische Neuronen. Die Werte stellen den Mittelwert von drei getrennten Experimenten dar. Nicht signifikant (p > 0,05) durch Student es t test. Die Zellzählung erfolgte manuell unter 20-facher Vergrößerung. Abkürzungen: SEM = Standardfehler des Mittelwerts. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Repräsentative Immunzytochemie der primären CN3/CN4- und SMN-Monokulturen bei 2, 7 und 14 DIV. Primäre CN3/CN4- und SMN-Kulturen wurden bei 2, 7, 14 DIV durch Immunfluoreszenz-Kennzeichnung mit TUJ1 (grün) und Kerne mit DAPI (blau) gegenbewertet. Neuronale Prozesse werden dicker und länger um 14 DIV. Neuronale Zellkörpergrößen wurden vergrößert und neigten dazu, sich in Langzeitkulturen zu aggregieren, insbesondere bei SMNs. Sowohl CN3/CN4- als auch SMN-Kulturen können mindestens 14 DIV-Kulturen beibehalten werden. Bilder wurden unter 10-facher Vergrößerung aufgenommen. Maßstabsleiste = 200 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Charakterisierung von E13.5-Maus-CN3/CN4- und SMN-isolierten Kulturen. E13.5 CN3/CN4 und SMN wurden mit diesem Protokoll isoliert und kultiviert und bei 2 DIV durch Immunfluoreszenzkennzeichnung mit TUJ1 (grün) und Islet1 (rot) analysiert, und die Kerne wurden mit DAPI (blau) gegenbewertet. Viele nicht-motorische neuronale Zellen (TUJ1+, Islet1-) waren vorhanden (Pfeile), was zu einer drastischen Abnahme sowohl der CN3/CN4- als auch der SMN-Reinheit führte, wobei die Abnahme in SMN-Kulturen stärker ausgeprägt war. Die Bilder wurden unter der 20-fachen Vergrößerung aufgenommen. Maßstabsleiste = 100 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 8: Repräsentative Anwendung der primären motorischen Neuronenkultur, die zeigt, dass CN3s/CN4s selektiv resistent gegen ER-Stress sind, der durch CPA induziert wird. (A) Experimentelle Randlage: Primäre CN3/CN4- und SMN-Monokulturen wurden mit CPA oder Fahrzeugkontrolle (DMSO) bei 2 DIV behandelt und Zellviabilitäten wurden durch Immunzytochemie-Analyse nach 3 Tagen Behandlung bewertet. Diese Gliederung wurde aus der veröffentlichten Arbeit31geändert. (B) Quantifizierung der Überlebensverhältnisse von CN3s/CN4s und SMNs, die 3 Tage lang mit 5 bis 30 M CPA behandelt wurden. Neuronen wurden durch immunfluoreszierende Kennzeichnung von Zellen mit TUJ1 analysiert und Kerne mit DAPI gegenbewertet. Die Überlebensverhältnisse wurden berechnet als die Anzahl lebensfähiger Zellen (siehe Abbildung 5B Legende) in medikamentsbehandelten Brunnen geteilt durch die Anzahl lebensfähiger Zellen in Brunnen, die nur Fahrzeug enthalten (DMSO). Die Zellzählung erfolgte manuell unter 20-facher Vergrößerung. Die Werte stellen den Mittelwert von vier getrennten Experimenten dar. *p < 0,05; p < 0.005 durch Student es t test. Diese Zahl wurde gegenüber der zuvor veröffentlichten Arbeit31geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 9: Repräsentative Immunzytochemie der primären CN3/CN4- und SMN-Monokulturen nach einer 3-tägigen Exposition gegenüber steigenden CPA-Konzentrationen ab 2 DIV. Neuronen wurden durch immunfluoreszierende Kennzeichnung von Zellen mit TUJ1 (grün) und Kerne wurden mit DAPI (blau) gegenstainiert. Primäre CN3s/CN4 waren resistenter gegen CPA-Behandlungen als primäre SMNs. Bilder wurden unter 10-facher Vergrößerung aufgenommen. Maßstabsleiste = 200 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Anzahl der Mittelhirne (X) | Papain | Albumin-ovomucoid | Hibernate E | |||||||||
| 10 x X 20 € | 200 l | 100 l | 600 l | |||||||||
| 20 < X 30 € | 300 l | 150 l | 700 l | |||||||||
| 30 < X 40 | 400 l | 200 l | 800 l | |||||||||
| Anzahl der Rückenmarks (Y) | Papain | Albumin-ovomucoid | Hibernate E | |||||||||
| 3 x Y 5 | 200 l | 100 l | 500 l | |||||||||
| 5 < Y 10 | 400 l | 200 l | 800 l | |||||||||
| 10 < Y 15 | 600 l | 300 l | 1200 l | |||||||||
Tabelle 1: Angemessene Volumina von Papain, Albumin-Ovomucoid und Endsuspension, die in Dissoziationsschritten verwendet werden. Die entsprechenden Volumina von Papain und Albumin-Ovomucoid, die mit verschiedenen Zahlen von ventralem Mittelhirn und ventralem Rückenmarksgewebe verwendet werden sollten, wurden nach mehreren Optimierungsrunden aus den Anweisungen des Herstellers modifiziert. Da Gewebe bei der Dissoziation und Sortierung Stress ausgesetzt sind, wird eine gepoolte Sammlung von mehr als 10 ventralen Mittelhirnen und mehr als drei ventralen Rückenmarksen empfohlen. Das Volumen von Papain wurde durch die Betrachtung des Gleichgewichts zwischen effektiver Dissoziation und der Belastung dieses Verfahrens bestimmt. Das Volumen der Albumin-Ovomucoid-Inhibitor-Lösung ist die Hälfte der von Papain. Das entsprechende Volumen der Endsuspension Hibernate E wurde so bestimmt, dass die Zelldichte 107 Zellen/ml nicht überschreitet, die Zellen jedoch nicht übermäßig verdünnt werden.
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Discussion
Historisch gesehen haben sich In-vitro-Studien von CN3- und/oder CN4-Motorneuronen auf heterogene Kulturen wie dissoziierte17,18,19,20,21, Explant17,22,23,24,25,26und Slice27,28 Kulturen verlassen, da diese Zellen nicht von umgebende Zellen basierend auf der Größe und spezifische Marker für diese Zellen wurden nicht gemeldet. Das vorliegende Protokoll ist eine umfassende Methode zur Isolierung und Kultur von primären E11,5 murinen CN3s/CN4s und SMNs aus denselben Embryonen und bestätigt die hohe Reinheit der Kulturen. Durch die Erzeugung reiner SMN- und CN3/CN4-Kulturen aus denselben Mausembryonen ermöglicht das Protokoll kontrollierte Vergleiche des In-vitro-Verhaltens von CN3s/CN4s mit SMNs, die von wildem Typ isoliert sind, sowie mutierten Embryonen.
Die reinen Kulturen von CN3s/CN4s und SMNs, die durch dieses Protokoll erzeugt werden, ermöglichen vergleichende Studien über morphologische, zelluläre, molekulare und elektrophysiologische Eigenschaften dieser motorischen Neuronen. Da andere schädelmotorische Neuronenpopulationen aus dieser Isl MN:GFP-Transgen-Mauslinie visualisiert und seziert werden können (einschließlich Abducens, Motortrigeminal, Gesichts- und Hypoglossal), könnte dieses Protokoll auch für ihre Isolation und Kultur erweitert werden, vorausgesetzt, dass FACS GFP-Gatter entsprechend angepasst werden. Schließlich können die aus diesem Protokoll abgeleiteten FACS-sortierten motorischen Neuronen genomischen (z.B. Assay für Transposase-Accessible Chromatin mittels Sequenzierung oder ATAC-Seq) und/oder transkriptomischen (z. B. RNA-Sequenz31) Analysen unterzogen werden, um die normale Entwicklung und die selektive Anfälligkeit spezifischer motorischer Neuronensubtypen bei neurodegenerativen Störungen zu untersuchen31.
Es gibt mehrere Schritte in diesem Protokoll, die entscheidend sind, um die Anzahl der reinen, gesunden motorischen Neuronen im isolierten Kultursystem zu maximieren. Während der Zerlegung sollten die GFP-negativen Gewebe (z.B. Mesenchym und DRGs) maximal entfernt werden, ohne die Motorneuronen zu beschädigen, da diese Gewebe klebend sind und SMNs während der Filterung einfangen oder verstopfen während der FACS-Sortierung verursachen können. Während der Gewebedissoziation sollte das minimale essentielle Volumen von Papain verwendet werden, und die Zellen müssen vorsichtig mit minimaler, aber ausreichender Trituration behandelt werden. Papain wurde für den Gewebedissoziationsschritt in diesem Protokoll verwendet, da vorläufige Daten darauf hindeuteten, dass es weniger destruktiv ist als Trypsin sowohl für CN3/CN4 als auch für SMN. Die Überlebensquoten auf der Grundlage der plattierten Anzahl von CN3s/CN4s und SMNs bei 2 DIV stiegen von 39,5 % auf 52,7 % bzw. von 52,3 % auf 58,4 %, wenn Papain anstelle von Trypsin (0,25 %, 4 Min. Inkubation) verwendet wurde. Obwohl diese Zahlen aus einem einzigen Experiment abgeleitet werden, das vor der vollständigen Optimierung durchgeführt wurde, deuten zusätzliche Berichte auch darauf hin, dass Trypsin für die Zellextraktion aus dem Gewebe des Nervensystems12,34,35,36suboptimal ist. Während faCS sollten fluoreszierende Vitalfarbstoffe (Propidiumiodid und Calceinblau) und kleine Sortierdüsen (z. B. 70 m) nicht verwendet werden, da sie schädlich für das Überleben des Motorneurons sind. Die Verwendung großer Sortierdüsen (100 m oder größer) wird dringend empfohlen, da der SMN-Zelltod bei Verwendung einer 70-mm-Düse deutlich zunimmt. Die Festlegung geeigneter Gating-Schwellenwerte für GFP-positive Zellen in FACS ist ein entscheidender Schritt, um reine Kulturen zu erhalten. Motorneuronenkulturen werden durch Forskolin, IBMX und Wachstumsfaktoren (BDNF, CNTF und GDNF) ergänzt. Forskolin und IBMX wurden berichtet, um additiv sMN Überleben zu fördern37,38. Vorläufige Daten aus den vorliegenden Studien deuten darauf hin, dass Forskolin und IBMX auch das CN3/CN4-Überleben additiv erhöhen. Die Überlebensquote auf Basis der plattierten Anzahl von CN3s/CN4s bei 2 DIV stieg von 17,5 % auf 26,9 %, 31,9 % und 37,0 %, wenn IBMX, Forskolin und IBMX+forskolin hinzugefügt wurden (Zahlen basieren auf einem einzigen Experiment, das vor der vollständigen Optimierung der Zellkulturbedingungen durchgeführt wurde). Es ist am besten, alle mittleren Veränderungen und Wass von kultivierten Zellen durchzuführen, indem die Hälfte des ursprünglichen Volumens verlassen wird, um das Lösen kultivierter Zellen zu vermeiden. Schließlich ist es auch ideal, die Zeit zwischen der Zerlegung und Beschichtung von motorischen Neuronen zu reduzieren (z. B. durch Verkürzung der Sezierenderzeit mit mehreren Dissektoren), um die Lebensfähigkeit der Kulturen zu verbessern.
Es gibt vier große potenzielle Probleme, die auftreten können, wenn sie diesem Protokoll folgen. Die erste ist die geringe Ausbeute an motorischen Neuronen nach FACS. Mögliche Ursachen für niedrige Erträge sind die Verwendung junger Embryonen (z. B. E10.5), die weniger motorische Neuronen haben, eine unzureichende Entfernung von klebenden GFP-negativen Geweben während der Zerlegung (z. B. Mesenchym und DRGs), die Motorneuronen einfangen und zu ihrer Entfernung während der Filtration führen können, unzureichende Papainisierung/Trituration während der Dissoziation und/oder das Ansetzen des GFP-positiven Tores während der FACS. Das zweite potenzielle Problem ist die geringe Reinheit der motorischen Neuronenkulturen, die höchstwahrscheinlich durch die Verwendung älterer Embryonen (z. B. E12.5) und/oder durch die Einstellung des GFP-positiven Gatters während des FACS entstehen. Drittens kann eine geringe Anzahl von angeschlossenen motorischen Neuronen in kultur durch unsachgemäße FACS-Sortierung und/oder unzureichende PDL/Laminin-Beschichtung von Platten/Coverlips beobachtet werden. Viertens können motorische Neuronen eine geringe Lebensfähigkeit in der Kultur aufweisen. Mögliche Ursachen für eine geringe Lebensfähigkeit sind grobe und/oder verlängerte Sezierungen, übermäßige Papainisierung/Trituration während der Dissoziation, unangemessener Umgang mit Zellen im gesamten Protokoll (z. B. grobe Pipettierung von Zellen, Versäumnis, Zellen auf Eis zu legen, Nichtabkühlen von PBS und HBSS) und/oder übermäßige Zeit zwischen der Einschifegung von schwangeren Mäusen und der Endbeschichtung der Zellen. Die Verwendung von Reagenzien, die nicht frisch und/oder unangemessene Konzentrationen sind, kann auch die experimentellen Ergebnisse beeinträchtigen.
Es gibt drei Haupteinschränkungen dieses Protokolls. IslMN:GFP transgene Mäuse und FACS Sortierung sind beide ziemlich teuer. Sie sind jedoch für dieses Protokoll von entscheidender Bedeutung, da es derzeit keine alternative Methode gibt, die hochgereinigte CN3s/CN4s wirtschaftlicher erzeugen kann. Es gibt ein kleines E10.5-E12.5-Altersfenster für die embryonalen Mäuse, und es ist schwierig zu bestätigen, dass entsprechend gealterte Embryonen vorhanden sind, besonders wenn keine Ultraschallmaschine zur Verfügung steht. Wenn nur reine SMNs benötigt werden, können sie aus E12.5-15.0 Mausembryonen mit Methoden wie Gradientenzentrifugation10,11,12 und/oder p75NTR-Antikörper-basierte Zellsortierungs-Schwenktechniken13,14,15,16abgeleitet werden. Schließlich sind proteinbasierte Assays, die eine große Menge an Ausgangsmaterial erfordern, aus diesen Kulturen aufgrund der geringen Ausbeute an motorischen Neuronen (insbesondere CN3s/CN4s) nicht machbar. Stammzell-abgeleitete Motorneuronen31,39, die grenzenlos erzeugt werden können, könnten theoretisch zu diesem Zweck ersetzt werden.
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Disclosures
Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.
Acknowledgments
Wir danken Brigitte Pettmann (Biogen, Cambridge, MA, USA) für den Unterricht in SMN-Sektionstechniken; die Dana Farber Cancer Institute Flow Cytometry Facility, die Immunology Division Flow Cytometry Facility der Harvard Medical School, The Joslin Diabetes Center Flow Cytometry Core, Brigham and Women es Hospital Flow Cytometry Core und Boston Children es Hospital Flow Cytometry Research Facility for FACS isolation of primary motor neurons; A.A. Nugent, A.P. Tenney, A.S. Lee, E.H. Nguyen, M.F. Rose, weitere Engle-Labormitglieder und Mitglieder des Project ALS-Konsortiums für technische Hilfe und nachdenkliche Diskussion. Diese Studie wurde vom Projekt ALS unterstützt. Darüber hinaus wurde R.F. von der Japan Heart Foundation/Bayer Yakuhin Research Grant Abroad und dem NIH Training Grant in Genetics T32 GM007748 finanziert; J.J. wurde durch das NIH/NEI-Schulungsprogramm in den Molekularen Basen von Augenkrankheiten (5T32EY007145-16) durch das Schepens Eye Research Institute und durch das Developmental Neurology Training Program Postdoctoral Fellowship (5T32NS007473-19) durch das Boston Children es Hospital unterstützt; M.C.W wurde von NEI (5K08EY027850) und der Children es Hospital Ophthalmology Foundation (Faculty Discovery Award) unterstützt. und E.C.E. ist ein Howard Hughes Medical Institute Investigator.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | 1:400 |
| Alexa Fluor 594-conjugated F(ab')2 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11072 | 1:400 |
| B27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| BD FACSAria llu SORP Flow Cytometer | BD Bioscience | - | This has 4 laser system equipped with 405, 488, 594, and 640 nm lasers. |
| BD Falcon 70μm Nylon Cell Strainers | CORNING | 352350 | For filtering the dissociating cells before FACS. |
| BD Falcon Round Bottom Test Tubes With Snap Cap | CORNING | 352054 | |
| BDNF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-207 | |
| Cell Culture microplate, 96 well, PS, F-bottom (Chimney Well) | Greiner Bio-One International | 655090 | We tried multiple 96-well dishes and this was the best one for culture and analyses after ICC |
| Circular Cover Glasses for microscopy | Karl Hecht & Assistent | 1001/14 | We used this coverslip since the area was large (diamater: 14 mm). |
| CNTF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-272 | |
| Cyclopiazonic acid from Penicillium cyclopium | Sigma-Aldrich | C1530 | CPA. One of ER stressors. |
| 4′,6-diamidino-2-phenylinodole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | DMSO |
| Dumont #5 Forceps Inox Tip Size 0.05 mm x 0.01 mm Biologie Tips | Roboz Surgical Instrument | RS-5015 | |
| Forskolin | Thermo Fisher Scientific | BP25205 | |
| GDNF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-305 | |
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14175-095 | |
| Hibernate E | BrainBits | HE | |
| Hibernate E low fluorescence | BrainBits | HELF | Fluorescence which hinders observation of embryo's GFP expressions should be low. |
| Horse serum, heat inactivated, New Zealand origin | Thermo Fisher Scientific | 26050-070 | |
| IBMX | Tocris Cookson | 2845 | Isobutylmethylxanthine |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017-015 | |
| Leibovitz’s L15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5913 | |
| Micro Knife 4.75" 1.7 mm x 27 mm blade | Roboz Surgical Instrument | RS-6272 | |
| Moria Mini Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-19 | |
| Mouse monoclonal antibody to neuronal class III β-tubulin (TUBB3) | BioLegend | 801202 | 1:500, TUJ1 |
| Nikon Perfect Focus Eclipse Ti live cell fluorescence microscope and Elements software | Nikon | - | Differential interference contrast images and immunocytochemistry images of the cell cultures were captured with these equipments |
| Nitric Acid 90%, Fuming (Certified ACS) | Fisher Scientific | A202-212 | For rinsing coverslips |
| Olympus 1.7 mL Microtubes, Clear | Genesee Scientific | 22-281 | These are the tubes that we described "1.7 mL microcentrifuge tubes" in the context. |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corp | LK003150 | Papain solution and alubumin-ovomucoid inhibitor solution are prepared from this kit. |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Poly D-lysin (PDL) | MilliporeSigma | A-003-E | |
| Rabbit monoclonal antibody to Islet1 | Abcam | ab109517 | 1:200 |
| SMZ18 and SMZ1500 zoom stereomicroscopes with DS-Ri1 camera | Nikon | - | Dissection was performed and images of dissected embryos and tissues are captured under these fluorescence microscopes. |
| Sylgard 170 Black Silicone Encapsulant - A+B 0.9 kg kit | Dow Corning | 1696157 | We make dissection dishes using this kit. |
| TC treated Dishes, 100 mm x 20 mm | Genesee Scientific | 25-202 | We make dissection dishes using this dish. |
| Thum Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width | Roboz Surgical Instrument | RS-8100 | |
| Transducer for LOGOQ e VET | GE Healthcare | L8-18i-RS | For ultrasound on female mice |
| Veterinary ultrasound machine | GE Healthcare | LOGOQ e VET | For ultrasound on female mice |
| Zeiss LSM 700 series laser scanning confocal microscope and Zen Software | Carl Zeiss | - | Confocal image of the embryo was captured with these equipments |
References
- Kiernan, M. C., et al. Amyotrophic lateral sclerosis. Lancet. 377 (9769), 942-955 (2011).
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