Summary
Двухступенчатый кожный канцерогенез индуцируется двумя местно прикладными химическими веществами. Мутаген 7,12-диметилбенцзазазазас) вызывает мутации в эпидермальных клетках и непрерывное применение стимулятора общего роста 12-O-Tetradecanoyl phorbol-13-ацетат ускоряет формирование папилломы кожи.
Abstract
Рак является одним из самых разрушительных заболеваний человека. Экспериментальные модели рака важны для получения информации о сложном интерплене различных типов клеток и генов в продвижении прогрессирования опухоли и предоставить платформу для тестирования эффективности различных терапевтических подходов. Одной из наиболее часто используемых экспериментальных моделей воспалительного рака является двухступенчатая модель канцерогенеза DMBA-TPA. Формирование опухоли индуцируется в этой модели путем местного применения двух различных химических веществ, 7,12-диметилбенза (DMBA) и 12-O-Tetradecanoyl форбол-13-ацетат (TPA), которые вместе вызывают образование папилломы в коже. В качестве основного результата является формирование папилломы в коже, модель является идеальным, надежным и воспроизводимым способом решения как инициации опухоли (без опухолевого выживания) и прогрессирования опухоли (количество и размер видимых опухолей). Эффекты лечения DMBA-TPA передаются через воспалительный механизм, что делает эту модель особенно подходящей для изучения роли иммунной системы в формировании опухоли. Тем не менее, эта модель ограничивается кожи и других поверхностей, где химические вещества могут быть применены на. Подробный протокол предоставляется в этой статье, чтобы успешно использовать модель.
Introduction
Рак является одной из ведущих причин смерти в мире. Поэтому существует спрос на разработку надежных экспериментальных моделей заболеваний, чтобы лучше понять болезнь, а также изучить потенциальные терапевтические подходы. Один из наиболее часто используемых экспериментальных моделей in vivo для изучения развития рака кожи является химически индуцированной двухступенчатой модели канцерогенеза кожи1,2. Модель предоставляет инструмент для изучения инициации опухоли, поощрения и прогрессирования в дополнение к конкретным событиям, таким как инфильтрация иммунных клеток и ангиогенез.
Для использования двухступенчатой модели канцерогенеза кожи, задняя кожа мышей лечится двумя различными химическими веществами, которые вместе вызывают образование опухоли. Модель инициируется с низкой дозой мутагена, DMBA, а затем длительное воздействие опухолевого промотора, TPA3 (Рисунок 1). DMBA устраняет ДНК случайнымобразом,образуя ковалентные аддукты с ДНК эпидермальных клеток и первичных кератиноцитов стволовых клеток4,5,6,7. Некоторые из этих случайных мутаций происходят в протоонкогене, таких как Hras1 (мутации в Красе и Нрасе также обнаружены) и преобразование протоонкогенов в онкогены приводит к образованию опухоли при надлежащих стимулах. TPA, в свою очередь, является наиболее часто используемым средством роста опухоли. Его молекулярная цель - протеина киназа C (PKC)8. TPA также активирует Wnt / катенин сигнализации, что имеет решающее значение для формирования опухоли в модели9. Повторное и длительное воздействие рекламирующего агента приводит к усилению клеточной сигнализации, увеличению выработки факторов роста и локальной воспалительной реакции, которые проявляются из-за повышенного синтеза ДНК и проникновения воспалительных клеток в обработанную кожу.
Ключевые воспалительные посредники в модели DMBA-TPA были определены10. Интерлейкин-17А (IL-17A), как известно, особенно опухолевых в модели DMBA-TPA11,12. Он работает в синергии с интерлейкином 6 (IL-6) и участвует в макрофаге и нейтрофилов вербовки13,14. Кроме того, было показано, что CD4и Т-клетки и нейтрофилы опухолевые в модели DMBA-TPA. Наконец, макрофаги могут также способствовать опухолевому в модели15,16,17.
Во время этапа продвижения, пролиферация клеток мутировавших клеток усиливается и устойчивая гиперплазия эпидермиса поддерживается1. Это приводит к развитию папилломы в коже через 10-20 недель, после чего папилломы начинают преобразовываться в злокачественные опухоли, плоскоклеточные карциномы (СКК)2. Однако, менее 10% папиллом прогрессирует до злокачественных новообразований, хотя этот процент также зависит от генетического фона мышей2,18. На протяжении десятилетий не было известно, какой тип клеток были первоначально мутировали в опухолях, ведущих к злокачественности, хотя некоторые исследования сообщили четко различные особенности в злокачественных опухолей по сравнению с доброкачественными папилломы19,20. Тем не менее, недавние исследования значительно увеличили наше понимание клонального происхождения образования опухоли в модели DMBA-TPA21. 22. 23. Было продемонстрировано, что как костного мозга полученных эпителиальных клеток и волосяного фолликула стволовых клеток способствуют образованию опухоли22. Этап конкретных линий отслеживания исследований обнародовал, что доброкачественные папилломы моноклонального происхождения, но они вербуют новые эпителиальные популяции клеток21,23. Однако, только один из клонов клетки действует как водитель для канцерогенеза; он содержит мутацию Hras23. Прогрессирование к образованию карциномы связано с клональной развертки23.
Канцероген DMBA инициирует формирование папилломы и TPA способствует росту опухоли. Таким образом, инициация опухоли может быть изучена отдельно от продвижения, прервав эксперимент до периода лечения TPA. По мере того как прогрессирование тумора изучено еженедельно оно предлагает большую возможность для детального анализа роста тумора в течении изучения. Поскольку опухоли генерируются внешними химическими веществами, онкогенная мутация в зародышевой линии не нужна. Таким образом, изучение влияния генетического фона (например, нокаут/трансген против дикого типа) на опухолевый генез является простым2. В целом, модель рака кожи DMBA/TPA является особенно полезным подходом для изучения роли иммунной системы в прогрессировании опухоли, а также для оценки инициирования опухоли и продвижения шагов независимо или взаимозависимо.
Рисунок 1: DMBA-TPA-индуцированной кожи канцерогенез модели контура. Канцероген DMBA местно применяется для индуцирования мутаций ДНК в фазе инициации модели. Стимулирующий рост агент TPA вводится 2 раз в неделю для повышения пролиферации клеток на этапе продвижения, что приводит к развитию папиллом в коже. Звери приносятся в жертву после того, как папиллома ответ достигает плато, как правило, в течение нескольких недель 15-20, в зависимости от генетического фона мышей. Небольшая часть папиллом может далее развиваться в SCCs в течение 20-50 недель. Для изучения ранних событий на этапе посвящения и раннего продвижения могут быть собраны образцы (например, вскоре после второго применения TPA). Представленная фотография и гематоксилин и эозин окрашенных сечение папилломы на c57BL/6 мыши кожи после 19 недель лечения показаны. Шкала бар 0,1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Описанный здесь протокол был одобрен Национальным комитетом по этике животных Финляндии (протокольный номер ESAVI/23659/2018).
1. Экспериментальные животные, реагенты и оборудование
- Используйте возраст и половые мышки. Начните исследование в возрасте 7-9 недель, потому что кожа у большинства мышей находится в telogen (покойная фаза) вокруг этого возраста2.
- Наблюдайте за поведением животных во время исследования и если они борются, что часто случается с самцами, размещайте их отдельно. Драки могут вызвать порезы кожи, которые способствуют образованию опухоли. Самки мышей предпочитают из-за их менее агрессивного поведения. Типичный размер экспериментальной группы варьируется от 8-20 животных в группе24,25,26,27.
ПРИМЕЧАНИЕ: Расчеты мощности, основанные на биологической дисперсии, наблюдаемой в более ранних исследованиях, помогают выбрать достаточно большой размер группы. Штаммы, используемые в качестве примеров в этой статье включают Balb/c и C57BL/6. Тем не менее, многие другие штаммы мыши, такие как SENCAR и FVB были использованы с DMBA-TPA-модель, а также Wistar и Sprague-Dawley крыс2,28,29. До начала исследования необходима лицензия национального или местного комитета по работе с животными. В дополнение к общим соображениям благосостояния, модель конкретных конечных точек, как правило, плоскоклеточный рак (SCC) и инфекции кожи. Царапины в коже из-за зуда после применения опухолевых химических веществ в ацетоне является типичным, но в противном случае животные не должны показывать никаких признаков дискомфорта. Регулярное взвешивание (например, 2 раз в месяц) помогает оценить благосостояние животных. - Используйте DMBA и TPA, оба разбавленных ацетоном. Рабочая концентрация ДМБА составляет 250 г/л. Доза для одного животного составляет 50 мкг ДМБА в 200 л ацетона. Концентрация tPA составляет 125 г/л, а концентрация лечения 25 г/л. Доза TPA для одного животного составляет 5 мкг в 200 зла ацетона.
ВНИМАНИЕ: DMBA вредно при проглатывании и может вызвать рак. Ацетон быстро испаряется и легковоспламеняется. Это может вызвать головокружение и раздражать глаза. Используйте дыхательную маску и/или работайте под вакуумным потоком. Изменение перчатки после обработки любого из этих химических веществ. Индивидуально вентилируемые клетки предотвращают распространение химических веществ во время корпуса мышей. После нанесения соберите пипетки, используемые для обработки ДМБА, и утилизировать как опасные отходы.
ПРИМЕЧАНИЕ: DMBA должна быть защищена от света. Разбавленный TPA хранится в -20 градусов по Цельсию, предпочтительно защищен от света. - Закупите следующее оборудование: весло, обычная бритва для меха, пипетки и кончики соответствующего размера, обычная линейка, цифровая камера, блокнот и ручка или компьютер или компьютер для записи папиллом, ингаляционная система анестезии или удерживающее мышь с отверстием на задней вершине, и системы наркода углекислого газа для жертвоприношения мышей.
2. Индукция и продвижение папилломы кожи
- Побрить заднюю кожу и взвесить животное. Позже, брить кожу, когда это необходимо, но не во время химического воздействия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны при бритье вокруг папилломы и избежать каких-либо сокращений на коже. Взвешивание каждого животного каждые 2 недели, чтобы заметить любую потенциальную потерю веса. - Нанесите 50 мкг DMBA в 200 мл ацетона местно на бритую область с помощью пипетки 48 ч после бритья меха. При необходимости срежь животное с помощью легкой ингаляционной анестезии или удерживаемого мыши.
- После 7 дней, дать первую дозу TPA. Применить 5 мкг TPA в 200 зЛ ацетона местно с пипеткой 2x в неделю, предпочтительно понедельник и четверг или вторник и пятницу.
- Считайте, записывайте и фотографируйте папилломы каждую неделю. Ощутимая масса, превышающая 1 мм в диаметре, считается папилломой, если она остается дольше 1 недели. Отметьте каждую индивидуальную папиллому на карте и перечислите ее размер каждую неделю. Храните цифровые фотографии.
3. Пожертвование животных и коллекция образцов
- Продолжайте лечение до тех пор, пока реакция опухоли не достигнет плато. Как правило, бремя папилломы, как ожидается, увеличится через 10-20 недель после начала, в зависимости от используемого штамма мыши. Плато ожидается через 15-20 недель. Небольшая доля папиллом (до 3%) может развиться в SCCs в течение 20-50 недель2.
- Пожертвуйте животными 24 ч после последнего применения TPA. Используйте углекислый газ наркоз с вывихом шейки матки или другим подходящим методом.
- В зависимости от вопроса исследования, собрать соответствующий образец материала из животных30,31.
- Например, взять образцы крови перед жертвоприношением и отделить плазму.
- Вырезать кусочки кожи для иммуногистохимии (IHC) окрашивания (например, гематоксилин и эозин, размножающиеся или воспалительные клетки).
- Используйте биопсию ударов для сбора кусочков кожи с папилломы ткани или не папиллома (обработанные) кожи для экспрессии генов (например, qPCR) и / или анализы белка (например, Западная поника или ELISA).
- Соберите кусок селезенки и кожи дренирующих лимфатических узлов для анализа цитометрии потока, если более подробный анализ популяций иммунных клеток желательно. Вы также можете отделить эпидермальные и кожные слои для дальнейшего анализа.
4. Статистика
- Нарисуйте кривую выживания Каплан-Мейер в свободное от папилломы время и используйте тест мантел-Кокс для выживания. Нарисуйте линейную кривую количества папиллом в неделю. Поскольку это данные подсчета, используйте нелинейную модель регрессии. При необходимости проконсультируйтесь со статистиком.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Основным результатом является выживание (т.е. папиллома бесплатно) время между лечением или генотипгруппы. Вторичным результатом является количество папиллом в неделю в каждой группе(рисунок 2). Ожидаемые результаты являются статистически значимой разницей в свободном времени папилломы и в количестве папиллом между экспериментальными (двумя или более) группами. Рекомендуется подсчитать количество папиллом и нарисовать кривую во время этапа продвижения (TPA), чтобы получить представление о различиях между группами на этом этапе. Слишком раное прекращение эксперимента может скрыть статистически значимую разницу.
Рисунок 2: Основные результаты модели канцерогенеза, вызванной DMBA-TPA. Репрезентативные изображения папиллом на коже мыши и два основных исхода. Данные были объединены из четырех отдельных экспериментов. ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперименты с мышами Balb/C и C57BL/6 проводились отдельно. (A) Участок выживания папиллома свободного времени. Линия dashed - Balb/c и твердая линия C57BL/6. (B) Среднее количество папиллом на мышь. Линия dashed - Balb/c и твердая линия C57BL/6. Ошибки баров - SEM. (C) Balb /c мышь с папилломы на 11 недель после лечения DMBA. (D) Мышь C57BL/6 с папилломами на 11 недель после лечения DMBA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Гистология, мРНК, а также клеточный и белковый анализ могут быть проведены для изучения механизмов, лежащих в основе наблюдаемых различий. Например, гистологические анализы подходят для изучения структуры папиллом, морфологии кожи (эпидермальная и кожная толщина), различных биологических процессов (пролиферация, апоптоз, ангиогенез) или инфильтрации иммунных клеток32 (рисунок 3). Кожа идеально подходит для надежной количественной оценки морфологических и IHC параметров с помощью современных систем анализа изображений30,31,32,33. Выражения гена и белка из образцов кожи (папилломы) можно легко изучить стандартными методами30. Цитометрия потока является полезным инструментом для анализа различных популяций иммунных клеток селезенки и кожи дренирующих лимфатических узлов, как ранее описано30. Выбор аналитических методов зависит от исследовательского вопроса и должен быть рассмотрен до начала эксперимента.
Рисунок 3: Гистологический анализ инфильтрации воспалительных клеток в модели DMBA-TPA. Представитель гистологических сечений от PFA-фиксированной парафина встроенных кожи в модели DMBA-TPA. Секции кожи были окрашены маркером макрофага F4/80 (коричневый). Шкала баров 200 мкм. (A) Только несколько F4/80 положительных макрофагов были замечены в нормальной, необработанной кожи. (B) Макрофаг инфильтрации в дерме было очевидно на ранней стадии поощрения рака, на 2 недели и 36 ч после второго введения TPA. Кроме того, эпидермальная гиперраспространение была замечена на 2 недели, о чем свидетельствует утолщение эпидермиса. (C) Non-папиллома кожи на 19 недель по-прежнему показали замечательное проникновение макрофагов. (D) Сильное накопление макрофагов было замечено под папилломы в дерме DMBA-TPA обработанных животных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DMBA-TPA-индуцированных рака кожи является одним из наиболее часто используемых моделей рака, поскольку он является высоко воспроизводимым и предоставляет информацию о прогрессии опухоли от начала до злокачественности. Ключевой показатель исхода, образование папилломы, легко и надежно количествен. Модель касается одновременно инициации опухоли (безопухолевого выживания), так и прогрессирования (числа и размеры опухоли). Модель подходит для изучения различных соединений, таких как потенциальные терапевтические препараты, и влияние отдельных генов на прогрессирование опухоли у генетически модифицированных животных. При применении модели для любого данного штамма, целесообразно изучить существующую литературу, чтобы достичь представления о том, как штамм реагирует в модели (например, чтобы выяснить, как быстро появятся первые папилломы). При использовании генетически модифицированных мышей, использование диких типа littermates всегда рекомендуется. Использование потенциальных дополнительных средств контроля, таких как замена DMBA или TPA или обоих ацетоном, является весьма спорным, потому что известно, что удаление dMBA или TPA или инвертирование их административного заказа весьма маловероятно, приведет к индукции роста папилломы34. Когда важно изучать инициацию опухоли (т.е. путем введения ДМБА в одиночку), это может быть достигнуто путем жертвоприношения животных после дозы DMBA. При изучении влияния отдельного гена в трансгенных или нокаут настройки, рекомендуется взять образцы из необработанных животных, чтобы обнаружить возможные различия, которые могут существовать до формирования опухоли между генетически модифицированных и диких штаммов типа30,31.
Хотя модель DMBA-TPA относительно проста в техническом оснащении, точное время имеет важное значение для успеха. Применение DMBA и регулярное применение TPA имеют решающее значение для развития опухоли34. Тщательное еженедельное изучение папиллом имеет важное значение для сбора всех данных. Следует отметить, что некоторые методы лечения или генетического происхождения может привести к папилломрасти расти, а затем сокращаться или даже исчезают30. Иногда возникают другие нераковые поражения и СКК. В этом случае рекомендуется гистологическое исследование поражения. Другим важным шагом является обеспечение того, чтобы TPA является единственным опухолевым промотором. Кожная травма индуцирует выработку цитокинов, которые могут повлиять на продвижение опухоли2,34. Таким образом, ятрогенные раны кожи во время бритья необходимо избегать, и агрессивные, боевые мыши должны быть размещены отдельно. В дополнение к борьбе, другие аспекты благополучия животных также имеют важное значение. Потеря веса, тупой и запутанный мех, и апатичным поведением являются признаками дискомфорта. Дискомфорт не только этический вопрос, потому что отрицательный энергетический баланс тормозит рост опухоли34.
Модель DMBA-TPA предоставляет возможность для многих модификаций. Поскольку некоторые штаммы, как известно, более чувствительны, чемдругие,тщательный отбор позволяет планировать эксперимент и корректировать количество и частоту применения TPA18,35 . Модель в основном используется для развития опухолей кожи, но локальное применение в желудочно-кишечном тракте является вариантом36. Кроме того, модифицированная версия модели была использована для изучения развития опухоли в трахееи37. Поскольку развитие опухоли может регулироваться с помощью приложений DMBA и TPA, модель позволяет изучать результаты после изменения экологических аспектов, таких как диета и циркадный ритм38. Разделяя инициацию опухоли (DMBA) и продвижение (TPA), модель позволяет изучать эти два процесса самостоятельно. Например, жертвовать мышами после лечения ДМБА позволяет изучать механизм лечения или эффект гена, интересующегося инициатомопухоли2,34 . Для изучения ранних событий в инициации опухоли и поощрения, животные могут быть принесены в жертву в раннее время. Например, образцы могут быть собраны вскоре после второго введения TPA (например, 3 ч, 12 ч, 36 ч или 48 ч после)30,31. Стоит также отметить, что классическая двухступенчатая модель канцерогенеза DMBA-TPA может быть модифицирована с помощью различных химических веществ или с помощью "третьего" химического вещества. Они рассматриваются Абель идр. 2.
Модель DMBA-TPA используется десятилетиями для различныхцелей 34. Он был использован для изучения эффектов различных терапевтических24,25,26 и генов31,32,39,40, но и для изучения питания27, циркадный ритм38, и развитие диагностических инструментов41. Поскольку опухоли образуются из кожи, модель предоставляет уникальную возможность собирать образцы опухолевых тканей на разных стадиях прогрессирования21. При внедрении новых химиопрофилактических средств или иммуномодуляторов, желательно сначала собрать данные о том, как штамм отреагировал в модели DMBA-TPA в предыдущих исследованиях. Если нет, prestudy без потенциального терапевтического агента рекомендуется определить сроки и количество папиллом, а также дисперсии в этих параметров. Существующие данные из опубликованных исследований также может помочь определить дозировку испытанного соединения24,27, но если недоступны, с помощью серийного разбавления исследуемого соединения позволяет оценить дозу ответ агента изучены25,26.
Воспаление имеет важное значение для опухоли человека, так как он участвует во всех фазах прогрессирования опухоли: начало, продвижение, и преобразование в злокачественности42,43. Химически индуцированной модели канцерогенеза кожи является воспаление инициативе модели канцерогенеза. Провоспалительный цитокин ответ и инфильтрации воспалительных клеток в обработанную кожу уже очевидны на ранней стадии модели. Первые инфильтративающие клетки являются нейтрофиловами, за которыми следует накопление макрофагов, Т-клеток и т.д.30,31. Эти клетки создают воспалительные микроокружения в коже, и перекрестный разговор между воспалительными и эпидермальными клетками инициируется, что приводит к производству цитокинов, хемокинов и простагландинов, которые управляют инициацией опухоли и ростом на местном уровне. Поскольку модель DMBA-TPA является моделью, ориентированной на воспаление, она не включает в себя некоторые другие аспекты клинического рака. Хотя известно, что SCCs в конечном итоге может вызвать метастазировать в модели DMBA-TPA, только небольшая часть папиллом развиваться в SCCs2,23. Следовательно, метастаз является редкой особенностью в модели DMBA-TPA, хотя некоторые чувствительные выведенные запасы, такие как CD-1 или SENCAR, могут иметь повышенную вероятность развития метастазирования44. Появление SCC часто считается вопросом защиты животных и, таким образом, конечным критерием. Поэтому, несмотря на наличие метастазв в модели, некоторые другие модели, такие как трансплантация или генетически модифицированные модели, больше подходят для изучения метастаз45. Еще одним ограничением модели является то, что она требует поверхности для применения химических веществ. Таким образом, изучение прогрессирования рака в определенном внутреннем органе выходит за рамки модели.
Другой распространенной моделью рака кожи является модель УФ-излучения46. Модель сравнима с моделью DMBA-TPA, потому что ни одна из этих двух моделей не нуждается в пересадке клеток или генетической модификации, чтобы вызвать рак. Основное различие между моделями заключается в том, что модель УФ-излучения вызывает агрессивное образование SSC, в то время как исход опухоли в модели DMBA-TPA, как правило, доброкачественные папилломы. Если УФ-излучение в сочетании с применением химических канцерогенов или в мышиштаммов с генетическим фоном, что делает штамм восприимчивым для развития рака, даже образование меланомы может иметь место. Наиболее распространенные мутации в модели УФ-излучения инактивируют ген p53, важнейший ген супрессора опухоли у людей46, в то время как наиболее распространенные мутации в модели DMBA-TPA активируют hras-ген23. УФ-излучение вызывает также иммуносупрессию46,47, которые могут быть запутанным фактором при изучении аспектов иммунной системы. Тем не менее, эти две модели также работают в комбинации. УФ-излучение может быть использовано в качестве рекламного агента с DMBA или в качестве иницы с TPA46.
Разумный вопрос заключается в том, является ли модель DMBA-TPA имитирует рак человека. Небольшая доля папиллом развивается до SCCs. Тем не менее, предраковый этап человеческого SCC является актиничным кератозом, и он отличается от образования папилломы видели в модели. Тем не менее, образование папилломы, похожее на модель, обнаруживается у людей, получавших меланому с помощью вемурафениба. Это говорит о том, что грас мутировал стволовых клеток, которые необходимы для канцерогенеза в модели DMBA-TPA также существуют на коже человека34. Кроме того, сообщается, что поглощение 2-дезокси-2-з18F'-фтор-D-глюкозы (18F-FDG) папилломы и микроинвазивных SCCs выше, чем в окружающей коже, но не так высока, как в полностью инвазивных SCC, что отражает сходство предраковых стадиях41. При использовании модели DMBA-TPA для оценки токсичности, следует помнить, что повторение воздействия имеет большое влияние на поощрение опухоли34. По крайней мере, некоторые молекулярные механизмы являются общими для модели и человеческой кожи.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась Академией Финляндии (гранты 25013080481 и 25013142041 (I.J.), 286377 и 295814 (M.P.), 287907 (T.J.)), P'ivikki и Sakari Sohlberg Foundation (M.P., T.J.), Финский медицинский фонд (T.P.), Конкурентное государственное исследование Финансирование экспертной зоны ответственности университетской больницы Тампере (грант 9V049 и 9X044 (M.P.), 9X011 и 9V010 (T.J.)), Конкурентное государственное научно-исследовательское финансирование экспертной зоны ответственности лабораторий Fimlab (грант X51409 (I.J.)), Tays Фонд поддержки (I.J., M.P., T.J.), Фонд туберкулеза Тампере (I.J., M.P., T.J.), Финский культурный фонд (M.V.), Фонд Пауло (T.P.), Онкологическое общество Финляндии (M.P.) и Фонд Эмиля Аалтонена (T.P.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1000 ul RPT XL Graduated Filter Tip (Sterile), Refill | Starlab | S1182-1730-C | |
| 300 ul RTP Graduated Filter Tip (sterile), Refill | Starlab | S1180-9710-C | |
| 7,12-Dimethylbenz[a]anthracene (DMBA) | Sigma | D3254-100MG | Harmful if swallowed and may cause cancer. Store protected from light. |
| Acetone | Sigma | 1000141011 | Evaporates rapidly and is inflammable. |
| Attane vet 1000 mg/g | Piramal Critical Care Limited | Liquid isoflurane for inhalation | |
| Battery-Operated Clipper Isis | Albert Kerlb GmbH | GT421 | For shaving the fur |
| CONTRAfluran-Restgasfilter | ZeoSys GmbH | For anesthesia | |
| Linex Nature N1030 Ruler 30 cm | Staples Business Advantage | 60383 | For measuring papillomas |
| Medium CO2 Chamber 300 x 200 x 200mm - Red | VetTech Solutions Ltd | AN045AR | For sacrifice |
| Mekasoft | Mekalasi | 23008 | Table cover |
| Mice (Balb/c JRj) | Janvier labs | Other strains also possible | |
| Mice (C57BL/6JRj) | Janvier labs | Other strains also possible | |
| Panasonic Lumix DMC-FS5 Digital Camera | Panasonic | ||
| Paraformaldehyde | Merck | 30525-89-4 | For histology samples |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate aka 12-Otetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) | Enzo | BML-PE160-0001 | |
| Precision balance PLJ-C/PLJ-G | KERN & SOHN GmbH | PLJ 600-3CM | |
| Pre-Set CO2 System-2 Chamber-S/S Housing | VetTech Solutions Ltd | AN044BX | For sacrifice |
| RNAlater | Qiagen | 76104 | For nucleic acid samples |
| Tacta pipette 100-1000 ul | Sartorius | LH-729070 | |
| Tacta pipette 20-200 ul | Sartorius | LH-729060 | |
| UNO Anaesthetic Key Filler | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia | |
| UNO Face Mask for Mouse | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia | |
| UNO FM2200 Flowmeter | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia | |
| UNO Gas Exhaust Unit | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia | |
| UNO Induction Box | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia | |
| UNO200VAP Vaporizer | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia |
References
- DiGiovanni, J.
- Abel, E. L., Angel, J. M., Kiguchi, K., DiGiovanni, J. Multi-stage chemical carcinogenesis in mouse skin: fundamentals and applications. Nature Protocols. 4 (9), 1350-1362 (2009).
- Perez-Losada, J., Balmain, A.
- Bonham, K., et al. Activation of the cellular Harvey ras gene in mouse skin tumors initiated with urethane. Molecular Carcinogenesis. 2 (1), 34-39 (1989).
- Quintanilla, M., Brown, K., Ramsden, M., Balmain, A. Carcinogen-specific mutation and amplification of Ha-ras during mouse skin carcinogenesis. Nature. 322 (6074), 78-80 (1986).
- Nelson, M. A., Futscher, B. W., Kinsella, T., Wymer, J., Bowden, G. T. Detection of mutant Ha-ras genes in chemically initiated mouse skin epidermis before the development of benign tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (14), 6398-6402 (1992).
- Morris, R. J. A perspective on keratinocyte stem cells as targets for skin carcinogenesis. Differentiation. 72 (8), 381-386 (2004).
- Chung, Y. W., Kim, H. K., Kim, I. Y., Yim, M. B., Chock, P. B. Dual function of protein kinase C (PKC) in 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA)-inducec manganese superoxide dismutase (MnSOD) expression: activation of CREB and FOXO3a by PKC-alpha phosphorylation and by PKC-mediated inactivation of Akt, respectively. The Journal of Biological Chemistry. 286 (34), 29681-29690 (2011).
- Su, Z., et al. Tumor promoter TPA activates Wnt/β-catenin signaling in a casein kinase 1-dependent manner. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (32), 7522-7531 (2018).
- Swann, J. B., et al. Demonstration of inflammation-induced cancer and cancer immunoediting during primary tumorigenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 652-656 (2008).
- Wang, L., Yi, T., Zhang, W., Pardoll, D. M., Yu, H. IL-17 enhances tumor development in carcinogen-induced skin cancer. Cancer Research. 70 (24), 10112-10120 (2010).
- He, D., et al. IL-17 mediated inflammation promotes tumor growth and progression in the skin. PLoS One. 7 (2), 32126 (2012).
- Roussel, L., et al. IL-17 promotes p38 MAPDK-dependent endothelial activation enhancing neutrophil recruitment to sites of inflammation. Journal of Immunology. 184 (8), 4531-4537 (2010).
- Wanqiu, H., Young-Hee, J., Hyun, S. K., Byung, S. K. Interleukin-6 (IL-6) and IL-17 synergistically promote viral persistence by inhibition cellular apoptosis and cytotoxic T cell function. Journal of Virology. 88 (15), 8479-8489 (2014).
- Yusuf, N., et al. Antagonistic roles of CD4+ and CD8+ T-cells in 7,12-dimethylbenz(a)anthracene cutaneous carcinogenesis. Cancer Research. 68 (10), 3924-3930 (2008).
- Gong, L., et al. Promoting effect of neutrophils on lung tumorigenesis is mediated by CXCR2 and neutrophil elastase. Molecular Cancer. 12 (1), 154 (2013).
- Vestweber, D., Wessel, F., Nottebaum, A. F. Similarities and differences in the regulation of leukocyte extravasation and vascular permeability. Seminars in Immunopathology. 36 (2), 177-192 (2014).
- Woodworth, C. D., et al. Strain-dependent differences in malignant conversion of mouse skin tumors is an inherent property of the epidermal keratinocyte. Carcinogenesis. 25 (9), 1771-1778 (2004).
- Tennenbaum, T., et al. The suprabasal expression of alpha 6 beta 4 integrin is associated with a high risk for malignant progression in mouse skin carcinogenesis. Cancer Research. 53 (20), 4803-4810 (1993).
- Hennings, H., Shores, R., Mitchell, P., Spangler, E. F., Yuspa, S. H. Induction of papillomas with a high probability of conversion to malignancy. Carcinogenesis. 6 (11), 1607-1610 (1985).
- Auto, Y., et al. Time-Series Analysis of Tumorigenesis in a Murine Skin Carcinogenesis Model. Scientific Reports. 8 (1), 12994 (2018).
- Park, H., et al. Bone marrow-derived epithelial cells and hair follicle stem cells contribute to development of chronic cutaneous neoplasms. Nature Communications. 9 (1), 5293 (2018).
- Reeves, M. Q., Kandyba, E., Harris, S., Del Rosario, R., Balmain, A. Multicolour lineage tracing reveals clonal dynamics of squamous carcinoma evolution from initiation to metastasis. Nature Cell Biology. 20 (6), 699-709 (2018).
- Dao, V., et al. Prevention of carcinogen and inflammation-induced dermal cancer by oral rapamycin includes reducing genetic damage. Cancer Prevention Research. 5, Philadelphia Pa. 400-409 (2015).
- Yeong, L. T., Abdul Hamid, R., Saiful Yazan, L., Khaza’ai, H., Mohtarrudin, N. Low dose triterpene-quinone fraction from Ardisia crispa root precludes chemical-induced mouse skin tumor promotion. BMC Complementary and Alternative Medicine. 15 (1), 431 (2015).
- Kong, Y. H., Xu, S. P. Salidroside prevents skin carcinogenesis induced by DMBA/TPA in a mouse model through suppression of inflammation and promotion of apoptosis. Oncology Reports. 39 (6), 2513-2526 (2018).
- Jung, M., Bu, S. Y., Tak, K. H., Park, J. E., Kim, E. Anticarcinogenic effect of quercetin by inhibition of insulin-like growth factor (IGF)-1 signaling in mouse skin cancer. Nutrition Research and Practice. 7 (6), 439-445 (2013).
- Hu, Y. Q., Wang, J., Wu, J. H. Administration of resveratrol enhances cell-cycle arrest followed by apoptosis in DMBA-induced skin carcinogenesis in male Wistar rats. European review for medical and pharmacological sciences. 13, 2935-2946 (2016).
- Schweizer, J., Loehrke, H., Hesse, B., Goerttler, K. 7,12-Dimethylbenz[a]anthracene/12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate-mediated skin tumor initiation and promotion in male Sprague-Dawley rats. Carcinogenesis. 3 (7), 785-789 (1982).
- Vähätupa, M., et al. T-cell-expressed proprotein convertase FURIN inhibits DMBA/TPA-induced skin cancer development. Oncoimmunology. 5 (12), 1245266 (2016).
- May, U., et al. Resistance of R-Ras knockout mice to skin tumour induction. Scientific Reports. 5, 11663 (2015).
- Krajewska, M., et al. Image analysis algorithms for immunohistochemical assessment of cell death events and fibrosis in tissue sections. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (7), 649-663 (2009).
- Järvinen, T. A., Ruoslahti, E. Target-seeking antifibrotic compound enhances wound healing and suppresses scar formation in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21671-21676 (2010).
- Schwarz, M., Münzel, P. A., Braeuning, A. Non-melanoma skin cancer in mouse and man. Archives of Toxicology. 87 (5), 783-798 (2013).
- Slaga, T. J. SENCAR mouse skin tumorigenesis model versus other strains and stocks of mice. Environmental Health Perspectives. 68, 27-32 (1986).
- Goerttler, K., Loehrke, H., Schweizer, J., Hesse, B. Systemic two-stage carcinogenesis in the epithelium of the forestomach of mice using 7,12-dimethylbenz(a)anthracene as initiator and the phorbol ester 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate as promoter. Cancer Research. 39 (4), 1293-1297 (1979).
- Topping, D. C., Nettesheim, P. Promotion-like enhancement of tracheal carcinogenesis in rats by 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate. Cancer Research. 40, 4352-4355 (1980).
- Wille, J. J. Circadian rhythm of tumor promotion in the two-stage model of mouse tumorigenesis. Cancer Letters. 190 (2), 143-149 (2003).
- Lee, Y. S., et al. Inhibition of skin carcinogenesis by suppression of NF-κB dependent ITGAV and TIMP-1 expression in IL32γ overexpressed condition. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 37 (1), 293 (2018).
- Kiss, A., et al. Cell type-specific p38δ targeting reveals a context-, stage-, and sex-dependent regulation of skin carcinogenesis. International Journal of Molecular Sciences. 20 (7), 1532 (2019).
- Tomo-o, I., et al. Positron emission tomography imaging of DMBA/TPA mouse skin multi-step tumorigenesis. Molecular Oncology. 4 (2), 119-125 (2010).
- Mantovani, A., Allavena, P., Sica, A., Balkwill, F.
- Crusz, S. M., Balkwill, F. R. Inflammation and cancer: advances and new agents. Nature Reviews. Clinical Oncology. 12 (10), 584-596 (2015).
- Hennings, L., et al. Malignant conversion and metastasis of mouse skin tumors: a comparison of SENCAR and CD-1 mice. Environmental Health Perspectives. 68, 69-74 (1986).
- Gómez-Cuadrado, L., Tracey, N., Ma, R., Qian, B., Brunton, V. G. Mouse models of metastasis: progress and prospects. Disease Models & Mechanisms. 10 (9), 1061-1074 (2017).
- Ouhtit, A., Ananthaswamy, H. N. A model for UV-induction of skin cancer. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 1 (1), 5-6 (2001).
- Day, C. -P., Marchalik, R., Merlino, G., Michael, H. T. Mouse models of UV-induced melanoma: genetics, pathology, and clinical relevance. Laboratory Investigation. 97 (6), 698-705 (2017).
