Summary
To-trins hudcarcinogenese induceres af to topisk anvendte kemikalier. En mutagen 7, 12-dimethylbenz [a] anthracen) forårsager mutationer i Epidermal celler og en kontinuerlig anvendelse af generelle vækst stimulator 12-O-tetradecanoyl phorbols-13-acetat accelererer huden papilloma dannelse.
Abstract
Kræft er en af de mest ødelæggende sygdomme hos mennesker. Eksperimentelle kræft modeller er vigtige for at få indsigt i det komplekse samspil mellem forskellige celletyper og gener i at fremme tumorprogression og til at give en platform til afprøvning af effekten af forskellige terapeutiske tilgange. En af de mest almindeligt anvendte eksperimentelle inflammatoriske kræft modeller er DMBA-TPA to-trins hud carcinogenese model. Tumor dannelse induceres i denne model af den topikale anvendelse af to forskellige kemikalier, 7, 12-dimethylbenz [a] anthracen (DMBA) og 12-O-tetradecanoyl phorbols-13-acetat (TPA), der tilsammen forårsager papilloma dannelse i huden. Som det primære resultat er papilloma dannelse i huden, modellen er en ideel, pålidelig, og reproducerbare måde at løse både tumor initiering (tumor-fri overlevelse) og tumorprogression (antal og størrelse af synlige tumorer). Virkningerne af DMBA-TPA behandling overføres via en inflammatorisk mekanisme, hvilket gør denne model specielt egnet til at studere rollen af immunsystemet i tumordannelse. Denne model er dog begrænset til huden og andre overflader, hvor kemikalierne kan påføres. Der findes en detaljeret protokol i denne artikel, hvor modellen kan bruges korrekt.
Introduction
Kræft er en af de førende dødsårsager i verden. Derfor er der et krav om at udvikle pålidelige eksperimentelle sygdomsmodeller for at opnå en bedre forståelse af sygdommen samt for at udforske potentielle terapeutiske tilgange. En af de mest almindeligt anvendte eksperimentelle in vivo modeller til at studere hudkræft udvikling er den kemisk induceret to-trins hud carcinogenese model1,2. Modellen giver et værktøj til at studere tumor initiering, forfremmelse, og progression i tillæg til specifikke begivenheder såsom immuncelle infiltration og angiogenese.
At bruge to-trins hud carcinogenese model, bagsiden hud af mus er behandlet med to forskellige kemikalier, der tilsammen fremkalde tumordannelse. Modellen initieres med en lav dosis af mutagen, DMBA, efterfulgt af længerevarende udsættelse for tumor promotoren, TPA3 (figur 1). Dmba muserer DNA tilfældigt ved at danne kovalente addukter med DNA fra Epidermal celler og primære keratinocyt stamceller4,5,6,7. Nogle af disse tilfældige mutationer finder sted i en proto-oncogene, såsom Hras1 (mutationer i Kras og NTM opdages også) og omdannelsen af proto-onkogener til onkogener driver tumordannelse under ordentlige stimuli. TPA, igen, er den mest almindeligt anvendte tumorvækst fremmende middel. Dens molekylære mål er proteinkinase C (PKC)8. TPA aktiverer også WNT/β-køreledningen i signalering, der er afgørende for tumordannelse i model9. Gentagen og langvarig udsættelse for fremme agent fører til øget celle signalering, øget produktion af vækstfaktorer, og en lokal inflammatorisk reaktion, som er indlysende på grund af øget DNA-syntese og inflammatorisk celleinfiltration i den behandlede hud.
De vigtigste inflammatoriske mediatorer i DMBA-TPA-modellen er blevet identificeret10. Interleukin-17a (Il-17a) er kendt for at være særligt tumorigent i dmba-TPA-modellen11,12. Det virker i synergi med interleukin 6 (Il-6) og deltager i makrofag og neutrofilrekruttering13,14. Desuden har CD4+ T- celler og neutrofiler vist sig at være tumorigent i dmba-TPA-modellen. Endelig kan makrofager også fremme tumor i model15,16,17.
Under forfremmelses fasen forstærkes celle spredningen af de muterede celler, og et vedvarende hyperplasi af epidermis vedligeholdes1. Dette fører til papilloma udvikling i huden i 10 – 20 uger, hvorefter papillomer begynder at konvertere til maligne tumorer, plade celle karcinomer (SCCS)2. Men mindre end 10% af papillomer fremskridt til malignitet, selv om denne procentdel også afhænger af den genetiske baggrund af musene2,18. I årtier var det ikke kendt, hvilken type celler blev oprindeligt muteret i tumorer fører til malignitet, selv om nogle undersøgelser havde rapporteret klart forskellige funktioner i de Maligne tumorer i forhold til benign papillomer19,20. Men, nylige undersøgelser har i høj grad øget vores forståelse på den klonale oprindelse af tumordannelse i DMBA-TPA model21. 22. 23. det blev påvist, at både knoglemarv-afledte epiteliale celler og hårsæk stamceller bidrager til tumordannelse22. Stage-specifikke Lineage Tracing undersøgelser har afsløret, at godartede papillomer af monoklonale oprindelse, men de rekruttere nye epiteliale cellepopulationer21,23. Men kun en af celle klonerne fungerer som en drivkraft for carcinogenese; den indeholder en HRAS-mutation23. Progression til karcinom dannelse er forbundet med en klonal feje23.
Det kræftfremkaldende DMBA initierer papilloma dannelse og TPA fremmer tumorvækst. Derfor kan tumor initiering undersøgt separat fra kampagnen ved at afbryde eksperimentet før TPA-behandlingsperioden. Som tumorprogression er undersøgt ugentligt det giver en stor mulighed for detaljeret tumorvækst analyse i hele studiet. Fordi tumorer er genereret af eksterne kemikalier, en onkogen mutation i kimcelle er unødvendig. Således er det ligetil at studere virkningerne af en genetisk baggrund (f. eks. knockout/transgene vs. vildtype) på tumor2. I sum, DMBA/TPA Skin Cancer model er en særlig nyttig tilgang til at studere rollen af immunsystemet i tumorprogression samt til evaluering af tumor initiering og forfremmelse skridt selvstændigt eller indbyrdes afhængige.
Figur 1: DMBA-TPA-induceret hud carcinogenese model skitse. Det kræftfremkaldende dmba påføres topisk for at inducere DNA-mutationer i Initierings fasen af modellen. Den vækstfremmende agent TPA administreres 2x om ugen for at øge celle spredningen under forfremmelses fasen, hvilket fører til udviklingen af papillomer i huden. Dyr ofres, efter at papillomas respons når et plateau, sædvanligvis inden for uger 15-20, afhængigt af muternes genetiske baggrund. En lille del af papillomer kan videreudvikle sig til VKF inden for 20 – 50 uger. For at studere tidlige hændelser i Initierings fasen og den tidlige forfremmelses fase kan der indsamles prøver (f. eks. kort tid efter den anden TPA-applikation). Et repræsentativt fotografi og hematoxylinlegemer og eosin farvede tværsnit af papillomer på en C57BL/6 mus hud efter 19 ugers behandling er vist. Scale bar = 0,1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den her beskrevne protokol er godkendt af Finlands nationale dyreetiske Komité (protokolnummer ESAVI/23659/2018).
1. forsøgsdyr, reagenser og udstyr
- Brug mus, som matcher alder og køn. Start studiet på 7 – 9 ugers alderen, fordi huden i de fleste mus er i telogen (hvilefasen) omkring den alder2.
- Observere opførsel af dyrene i løbet af undersøgelsen, og hvis de kæmper, som ofte sker med mænd, hus dem separat. Slagsmål kan forårsage nedskæringer i huden, som fremmer tumordannelse. Hunmus foretrækkes på grund af deres mindre aggressive opførsel. Den typiske eksperimentelle gruppe størrelse varierer mellem 8 – 20 dyr pr. gruppe24,25,26,27.
Bemærk: effekt beregninger baseret på den biologiske afvigelse, der ses i tidligere undersøgelser, er med til at vælge en tilstrækkelig stor gruppe størrelse. De stammer, der anvendes som eksempler i denne artikel, omfatter Balb/c og C57BL/6. Men, mange andre muse stammer såsom sencar og fvb har været brugt med dmba-TPA-model, samt Wistar og Sprague-dawley rotter2,28,29. Der er behov for en licens fra den nationale eller lokale Komité for dyre arbejde, før undersøgelsen påbegyndes. Ud over generelle velfærds hensyn er de modelspecifikke endepunkter typisk planocellulært karcinom (SCC) og en infektion i huden. Ridser i huden på grund af kløe efter påføring af de tumorigent kemikalier i acetone er typisk, men ellers bør dyrene ikke vise tegn på ubehag. Vejning regelmæssigt (f. eks. 2x om måneden) hjælper med at evaluere dyrenes velfærd. - Brug DMBA og TPA, begge fortyndet i acetone. Arbejds koncentrationen af DMBA er 250 g/L. En dosis for et dyr er 50 μg DMBA i 200 μL acetone. Lager koncentrationen af TPA er 125 g/L og behandlings koncentrationen 25 g/L. En TPA-dosis for ét dyr er 5 μg i 200 μL acetone.
Forsigtig: dmba er skadelig ved indtagelse og kan forårsage kræft. Acetone fordamper hurtigt og er brandfarlig. Det kan forårsage svimmelhed og irritere øjne. Brug en åndedræts maske og/eller Arbejd under en vakuum strøm. Skift handsker efter håndtering af disse kemikalier. Individuelt ventilerede bure forhindrer spredning af kemikalierne under opstaldning af musene. Efter påføring samles de pipettespidser, der anvendes til håndtering af DMBA, og bortskaffes som farligt affald.
Bemærk: dmba skal beskyttes mod lys. Den fortyndede TPA opbevares i-20 °C, fortrinsvis beskyttet mod lys. - Anskaffe følgende udstyr: en skala, en almindelig shaveren til pels, pipetter og spidser af en passende størrelse, en almindelig lineal, et digitalt kamera, en notesblok og en pen eller en computer til optagelse af papillomer, et inhaleret anæstesi system eller en mus fastholdelses med en åbning på bagsiden top, og en kuldioxid narkose system til at ofre mus.
2. induktion og forfremmelse af hudpapillomer
- Barberer den bageste hud og vejer dyret. Senere, barberer huden når det er nødvendigt, men ikke på tidspunktet for den kemiske eksponering.
Bemærk: Vær forsigtig, når du barberer rundt om papillomer og undgå at skære på huden. Afvejes hvert dyr hver 2 uger for at lægge mærke til et potentielt vægttab. - Påfør 50 μg DMBA i 200 μL acetone topisk på det barberede område ved hjælp af en pipette 48 h efter barbering af pels. Hvis det er nødvendigt, begrænse dyret ved hjælp af let inhalation anæstesi eller en mus fastholdelses.
- Efter 7 dage, Giv den første TPA dosis. Påfør 5 μg TPA i 200 μL acetone på topisk Vis med en pipette 2x om ugen, fortrinsvis mandag og torsdag eller tirsdag og fredag.
- Tæl, Optag og fotografere papillomer hver uge. En håndgribelig masse større end 1 mm i diameter betragtes som en papilloma, hvis den bliver længere end 1 uge. Marker hvert enkelt papilloma på et kort, og Vis dets størrelse hver uge. Opbevar digitale fotografier.
3. dyre offer og prøveindsamling
- Fortsætte behandlingen indtil tumorrespons når et plateau. Generelt, den papilloma byrden forventes at stige 10 – 20 uger efter indledningen, afhængigt af den anvendte musestamme. Plateauet forventes i 15 – 20 uger. En lille del af papillomer (under 3%) kan udvikle sig til SCCs inden for 20 – 50 uger2.
- Ofrer dyrene 24 timer efter den sidste TPA ansøgning. Brug carbondioxid narkose med livmoderhals dislokation eller en anden egnet metode.
- Afhængigt af forskningsspørgsmålet, indsamle passende prøvemateriale fra dyrene30,31.
- For eksempel, tage blodprøver før offer og adskille plasmaet.
- Skær stykker af huden for immun histokemi (IHC) farvning (f. eks, hematoxylinlegemer og eosin, prolifererende eller inflammatoriske celler).
- Brug biopsi slag til at indsamle hud stykker med enten papilloma væv eller ikke-papilloma (behandlet) hud for genekspression (f. eks qPCR) og/eller proteinanalyser (f. eks, Western blot eller ELISA).
- Saml et stykke af milten og huden-dræning lymfeknuder for flow flowcytometri analyse, hvis mere detaljeret analyse af immuncelle populationer ønskes. Du kan også adskille epidermal og dermal lag for yderligere analyser.
4. statistik
- Tegn en Kaplan-Meier overlevelse kurve af papilloma-fri tid og bruge Mantel-Cox log-Rank test for overlevelse. Tegn en lineær kurve over antallet af papillomer pr. uge. Da dette er optællingsdata, skal du bruge en ikke-lineær regressionsmodel. Konsulter om nødvendigt en statistiker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det vigtigste resultat er overlevelse (dvs., papilloma fri) tid mellem behandling eller genotype grupper. Det sekundære udfald er antallet af papillomer pr. uge i hver gruppe (figur 2). De forventede resultater er en statistisk signifikant forskel i papillomer fritid og i antallet af papillomer mellem de eksperimentelle (to eller flere) grupper. Det anbefales at tælle antallet af papillomer og tegne en kurve i løbet af kampagnen (TPA) fase for at få en idé om forskellene mellem grupperne på det tidspunkt. Hvis eksperimentet afsluttes for tidligt, kan det skjule en statistisk signifikant forskel.
Figur 2: de vigtigste resultater af DMBA-TPA-induceret hud carcinogenese model. Repræsentative billeder af papillomer på mus hud og de to vigtigste resultater. Data blev kombineret fra fire særskilte eksperimenter. Bemærk: eksperimenter med Balb/C og C57BL/6 mus blev udført separat. A) en overlevelses plot af papillomas fritid. Stiplet linje = Balb/c og solid line = C57BL/6. B) det gennemsnitlige antal papillomer pr. mus. Stiplet linje = Balb/c og solid line = C57BL/6. Fejllinjer = SEM. (c) en Balb/C-mus med papillomer 11 uger efter behandling med dmba. D) en C57BL/6-mus med papillomer 11 uger efter behandling med dmba. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Histologi, mRNA, og cellulære og proteinanalyse kan udføres for at udforske de mekanismer, der underliggende de observerede forskelle. For eksempel, histologiske analyser er egnede til at studere strukturen af papillomer, morfologi af huden (epidermal og dermal tykkelse), forskellige biologiske processer (proliferation, apoptose, angiogenese), eller infiltration af immunceller32 (figur 3). Huden er ideel til pålidelig kvantificering af morfologiske og IHC parametre ved State-of-art billedanalyse systemer30,31,32,33. Genet og protein udtryk fra (papilloma) hudprøver kan let undersøgt med standardmetoder30. Flowcytometri er et nyttigt værktøj til analyse af forskellige immuncelle populationer af milten og de huddrænede lymfeknuder, som tidligere beskrevet30. Valget af analysemetoder afhænger af forskningsspørgsmålet og skal overvejes, før forsøget påbegyndes.
Figur 3: histologisk analyse af inflammatorisk celleinfiltration i DMBA-TPA-modellen. Repræsentative histologiske tværsnit fra PFA-fast paraffin-indlejret hud i DMBA-TPA-modellen. Hudsektioner blev plettet med en makrofag markør F4/80 (brun). Skala stænger = 200 μm.a) der sås kun få F4/80 positive makrofager i normal, ubehandlet hud. (B) makrofag infiltration i dermis var tydeligt på det tidlige stadium af kræft fremme, på 2 uger og 36 h efter den anden TPA administration. Også, epidermal hyperproliferation blev set på 2 uger, som vist ved fortykkelse af epidermis. (C) ikke-papillomer på 19 uger viste stadig en bemærkelsesværdig infiltration af makrofager. D) der blev set en stærk ophobning af makrofager under papillomer i dermis af de behandlede dyr af dmba-TPA. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DMBA-TPA-induceret hudkræft er en af de mest almindeligt anvendte kræft modeller, fordi det er meget reproducerbare og giver oplysninger om tumorprogression fra initiering til malignitet. Den vigtigste resultatmåling, papilloma dannelse, er let og pålideligt kvantitativ. Modellen henvender sig både tumor initiering (tumor-fri overlevelse) og progression (tumor tal og størrelser) samtidig. Modellen er velegnet til at studere forskellige forbindelser, såsom potentiel terapeutisk, og virkningerne af individuelle gener på tumorprogression i genetisk modificerede dyr. Ved anvendelse af modellen for en given stamme, er det tilrådeligt at studere den eksisterende litteratur for at opnå en idé om, hvordan stammen reagerer i modellen (f. eks, for at finde ud af, hvor hurtigt de første papillomer vises). Ved brug af genetisk modificerede mus anbefales det altid at anvende vildtype-litteratur. Brugen af potentielle yderligere Kontroller, såsom udskiftning af enten DMBA eller TPA eller begge af acetone, er meget diskutelig, fordi det er kendt, at fjerne enten DMBA eller TPA eller invertering deres administration orden er meget usandsynligt, at resultere i induktion af papilloma vækst34. Når det er vigtigt at studere tumor initiering (dvs. ved administration af DMBA alene), det kan opnås ved at ofre dyrene efter DMBA dosis. Når man studerer virkningen af et individuelt gen i en transgene eller knockout-indstilling, anbefales det at tage prøver fra ubehandlede dyr for at påvise mulige forskelle, der kan eksistere før tumordannelse mellem genetisk manipulerede og vilde type stammer30,31.
Selv om DMBA-TPA model er relativt enkel at foretage teknisk, præcis timing er afgørende for succes. Anvendelsen af DMBA og den regelmæssige anvendelse af TPA er begge afgørende for tumor udvikling34. En omhyggelig ugentlig undersøgelse af papillomer er afgørende for at indsamle alle data. Det skal bemærkes, at visse behandlinger eller genetiske baggrunde kan forårsage papillomer at vokse og senere skrumpe eller endda forsvinde30. Sommetider opstår andre noncancerøse læsioner og VKF. I dette tilfælde anbefales histologisk undersøgelse af læsionen. Et andet kritisk skridt er at sikre, at TPA er den eneste tumor promotor. Hud traumer inducerer produktionen af cytokiner, der kan påvirke tumor fremme2,34. Således, den iatrogen hud af huden under barbering skal undgås, og aggressive, kæmper mus skal huses separat. Foruden kampene er andre aspekter af dyrevelfærden også vigtige. Vægttab, kedelig og sammenfilklet pels, og apatisk opførsel er tegn på ubehag. Ubehag er ikke kun et etisk spørgsmål, fordi negativ energibalance hæmmer tumorvækst34.
DMBA-TPA-modellen giver mulighed for mange ændringer. Fordi nogle stammer er kendt for at være mere følsomme end andre, en omhyggelig udvælgelse gør det muligt at planlægge eksperimentet og justere mængden og hyppigheden af TPA ansøgning18,35. Modellen bruges primært til at udvikle hudtumorer, men lokal anvendelse til mave-tarmkanalen er en mulighed36. Desuden er en modificeret version af modellen blevet brugt til at studere tumor udvikling i luftrøret37. Fordi tumor udvikling kan reguleres med DMBA og TPA applikationer, modellen gør det muligt at studere resultaterne efter ændring af miljømæssige aspekter såsom kost og døgnrytme38. Ved at adskille tumor initiering (DMBA) og forfremmelse (TPA), modellen gør det muligt at studere disse to processer selvstændigt. For eksempel, ofrer musene efter dmba behandling tillader studere mekanismen af behandlingen eller effekten af et gen af interesse i tumor initiering2,34. For at studere de tidlige begivenheder i tumor initiering og forfremmelse, dyr kan ofres på et tidligt tidspunkt. For eksempel kan prøverne indsamles kort efter den anden TPA administration (for eksempel 3 h, 12 h, 36 h, eller 48 h efter)30,31. Det er også værd at bemærke, at den klassiske DMBA-TPA to-trins carcinogenese model kan ændres ved hjælp af forskellige kemikalier eller ved hjælp af "tredje" kemikalie. Disse gennemgås af Abel et al2.
DMBA-TPA-modellen har været anvendt i årtier til forskellige formål34. Det er blevet brugt til at studere virkningerne af forskellige Therapeutics24,25,26 og gener31,32,39,40 , men også for at studere ernæring27, døgnrytmen38, og udviklingen af diagnostiske værktøjer41. Som tumorer form fra huden, modellen giver en unik mulighed for at indsamle tumor vævsprøver på forskellige stadier af progression21. Ved indførelse af nye kemo opducerende midler eller immunmodulatorer er det tilrådeligt først at indsamle data om, hvordan stammen har reageret i DMBA-TPA-modellen i tidligere undersøgelser. Hvis det ikke er muligt, anbefales en forundersøgelse uden potentiel terapeutisk agens for at bestemme timingen og antallet af papillomer samt variansen i disse parametre. Eksisterende data fra offentliggjorte undersøgelser kan også bidrage til at bestemme doseringen af den testede sammensatte24,27, men hvis utilgængelig, ved hjælp af en seriel fortynding af det testede stof gør det muligt at evaluere dosisrespons af agenten studerede25,26.
Inflammation er afgørende for menneskelig tumorigenesis, da det er involveret i alle faser af tumorprogression: initiering, fremme, og omdannelse til malignitet42,43. Den kemisk induceret hudcarcinogenese model er en betændelse-drevet carcinogenese model. Pro-inflammatorisk cytokinrespons og infiltration af inflammatoriske celler til den behandlede hud er allerede tydelige i den tidlige fase af modellen. De første infiltrerende celler er neutrofiler, efterfulgt af ophobning af makrofager, T-celler, etc.30,31. Disse celler skabe en inflammatorisk mikromiljø i huden, og en krydstale mellem inflammatoriske og Epidermal celler initieres, fører til produktion af cytokiner, kemo okiner, og prostaglandiner, der drev tumor initiering og vækst lokalt. Som DMBA-TPA model er en betændelse-drevet model, det omfatter ikke nogle andre aspekter af klinisk kræft. Selv om det er kendt, at VKF til sidst kan forårsage metastase i dmba-TPA model, kun en lille del af papillomer udvikle sig til SCCS2,23. Metastase er derfor et sjældent træk i DMBA-TPA-modellen, selv om nogle følsomme udavlede bestande som CD-1 eller SENCAR kan have en øget sandsynlighed for at udvikle metastase44. Udseendet af SCC er ofte betragtes som en dyrevelfærd spørgsmål og dermed en Endpoint kriterium. Derfor, på trods af eksistensen af metastase i modellen, nogle andre modeller såsom transplantation eller genmanipulerede modeller er mere egnet til at studere metastase45. En anden begrænsning af modellen er, at det kræver en overflade for at anvende kemikalierne. Således, studere kræft progression i et specifikt indre organ er ude af anvendelsesområdet for modellen.
En anden fælles hudkræft model er UV-stråling model46. Modellen er sammenlignelig med DMBA-TPA-modellen, fordi ingen af disse to modeller behøver celletransplantation eller genetisk modifikation for at forårsage kræft. Den grundlæggende forskel mellem modellerne er, at UV-stråling model inducerer aggressiv SSC dannelse, mens tumor resultatet i DMBA-TPA model er generelt godartede papillomer. Hvis UV-stråling kombineres med anvendelse af kemiske carcinogener eller i muse stammer med en genetisk baggrund, der gør stammen modtagelig for kræft udvikling, selv melanom dannelse kan finde sted. De mest almindelige mutationer i UV-stråling model inaktivere P53 genet, en afgørende tumor suppressor gen i mennesker46, mens de mest almindelige mutationer i dmba-TPA model aktivere HRAS-gen23. UV-stråling forårsager også immunsuppression46,47, som kan være en forstyrrende faktor, når man studerer de aspekter af immunsystemet. Men disse to modeller også arbejde i kombination. UV-stråling kan bruges som en fremmende middel med DMBA eller som et initierende middel med TPA46.
Et rimeligt spørgsmål er, om DMBA-TPA model efterligner menneskelig kræft. En lille del af papillomer udvikler til VKF. Ikke desto mindre, den præmaligne fase af human SCC er aktinisk keratose, og det adskiller sig fra papilloma dannelse set i modellen. Stadig, papilloma dannelse svarende til modellen er påvist hos mennesker behandlet for melanom med vemurafenib. Dette tyder på, at de HRAS-muterede stamceller, der er afgørende for carcinogenese i DMBA-TPA model også findes på menneskelig hud34. Desuden er det rapporteret, at optagelsen af 2-deoxy-2-[18f]-fluoro-D-glucose (18f-FDG) papillomer og mikroinvasive SCC'er er højere end i den omgivende hud, men ikke så højt som i et fuldt invasivt SCC, hvilket afspejler ligheden mellem de præmaligne stadier41. Hvis du bruger DMBA-TPA model for toksicitet evaluering, man skal huske, at gentagelsen af eksponering har en stor effekt på tumor forfremmelse34. I det mindste nogle af de molekylære mekanismer er fælles for modellen og menneskelig hud.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af det finske Akademi (tilskud 25013080481 og 25013142041 (I.J.), 286377 og 295814 (M.P.), 287907 (T.J.)), Päivikki og Sakari Sohlberg Foundation (M.P., T.J.), Finnish Medical Foundation (T.P.), den konkurrencedygtige statslige forskning Finansiering af området for ekspert ansvar på Tampere Universitets Hospital (Grant 9V049 og 9X044 (M.P.), 9X011 og 9V010 (T.J.)), den konkurrencedygtige stats forskningsfinansiering af Fimlab Laboratories-laboratoriets ekspert ansvarsområde (Grant X51409 (I.J.)), Tays Støttefond (I.J., M.P., T.J.), Tampere tuberkulose Foundation (I.J., M.P., T.J.), den finske Kulturfond (M.V.), Paulo Foundation (T.P.), Cancer Society of Finland (M.P.) og Emil Aaltonen Foundation (T.P.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1000 ul RPT XL Graduated Filter Tip (Sterile), Refill | Starlab | S1182-1730-C | |
| 300 ul RTP Graduated Filter Tip (sterile), Refill | Starlab | S1180-9710-C | |
| 7,12-Dimethylbenz[a]anthracene (DMBA) | Sigma | D3254-100MG | Harmful if swallowed and may cause cancer. Store protected from light. |
| Acetone | Sigma | 1000141011 | Evaporates rapidly and is inflammable. |
| Attane vet 1000 mg/g | Piramal Critical Care Limited | Liquid isoflurane for inhalation | |
| Battery-Operated Clipper Isis | Albert Kerlb GmbH | GT421 | For shaving the fur |
| CONTRAfluran-Restgasfilter | ZeoSys GmbH | For anesthesia | |
| Linex Nature N1030 Ruler 30 cm | Staples Business Advantage | 60383 | For measuring papillomas |
| Medium CO2 Chamber 300 x 200 x 200mm - Red | VetTech Solutions Ltd | AN045AR | For sacrifice |
| Mekasoft | Mekalasi | 23008 | Table cover |
| Mice (Balb/c JRj) | Janvier labs | Other strains also possible | |
| Mice (C57BL/6JRj) | Janvier labs | Other strains also possible | |
| Panasonic Lumix DMC-FS5 Digital Camera | Panasonic | ||
| Paraformaldehyde | Merck | 30525-89-4 | For histology samples |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate aka 12-Otetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) | Enzo | BML-PE160-0001 | |
| Precision balance PLJ-C/PLJ-G | KERN & SOHN GmbH | PLJ 600-3CM | |
| Pre-Set CO2 System-2 Chamber-S/S Housing | VetTech Solutions Ltd | AN044BX | For sacrifice |
| RNAlater | Qiagen | 76104 | For nucleic acid samples |
| Tacta pipette 100-1000 ul | Sartorius | LH-729070 | |
| Tacta pipette 20-200 ul | Sartorius | LH-729060 | |
| UNO Anaesthetic Key Filler | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia | |
| UNO Face Mask for Mouse | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia | |
| UNO FM2200 Flowmeter | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia | |
| UNO Gas Exhaust Unit | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia | |
| UNO Induction Box | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia | |
| UNO200VAP Vaporizer | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia |
References
- DiGiovanni, J.
- Abel, E. L., Angel, J. M., Kiguchi, K., DiGiovanni, J. Multi-stage chemical carcinogenesis in mouse skin: fundamentals and applications. Nature Protocols. 4 (9), 1350-1362 (2009).
- Perez-Losada, J., Balmain, A.
- Bonham, K., et al. Activation of the cellular Harvey ras gene in mouse skin tumors initiated with urethane. Molecular Carcinogenesis. 2 (1), 34-39 (1989).
- Quintanilla, M., Brown, K., Ramsden, M., Balmain, A. Carcinogen-specific mutation and amplification of Ha-ras during mouse skin carcinogenesis. Nature. 322 (6074), 78-80 (1986).
- Nelson, M. A., Futscher, B. W., Kinsella, T., Wymer, J., Bowden, G. T. Detection of mutant Ha-ras genes in chemically initiated mouse skin epidermis before the development of benign tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (14), 6398-6402 (1992).
- Morris, R. J. A perspective on keratinocyte stem cells as targets for skin carcinogenesis. Differentiation. 72 (8), 381-386 (2004).
- Chung, Y. W., Kim, H. K., Kim, I. Y., Yim, M. B., Chock, P. B. Dual function of protein kinase C (PKC) in 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA)-inducec manganese superoxide dismutase (MnSOD) expression: activation of CREB and FOXO3a by PKC-alpha phosphorylation and by PKC-mediated inactivation of Akt, respectively. The Journal of Biological Chemistry. 286 (34), 29681-29690 (2011).
- Su, Z., et al. Tumor promoter TPA activates Wnt/β-catenin signaling in a casein kinase 1-dependent manner. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (32), 7522-7531 (2018).
- Swann, J. B., et al. Demonstration of inflammation-induced cancer and cancer immunoediting during primary tumorigenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 652-656 (2008).
- Wang, L., Yi, T., Zhang, W., Pardoll, D. M., Yu, H. IL-17 enhances tumor development in carcinogen-induced skin cancer. Cancer Research. 70 (24), 10112-10120 (2010).
- He, D., et al. IL-17 mediated inflammation promotes tumor growth and progression in the skin. PLoS One. 7 (2), 32126 (2012).
- Roussel, L., et al. IL-17 promotes p38 MAPDK-dependent endothelial activation enhancing neutrophil recruitment to sites of inflammation. Journal of Immunology. 184 (8), 4531-4537 (2010).
- Wanqiu, H., Young-Hee, J., Hyun, S. K., Byung, S. K. Interleukin-6 (IL-6) and IL-17 synergistically promote viral persistence by inhibition cellular apoptosis and cytotoxic T cell function. Journal of Virology. 88 (15), 8479-8489 (2014).
- Yusuf, N., et al. Antagonistic roles of CD4+ and CD8+ T-cells in 7,12-dimethylbenz(a)anthracene cutaneous carcinogenesis. Cancer Research. 68 (10), 3924-3930 (2008).
- Gong, L., et al. Promoting effect of neutrophils on lung tumorigenesis is mediated by CXCR2 and neutrophil elastase. Molecular Cancer. 12 (1), 154 (2013).
- Vestweber, D., Wessel, F., Nottebaum, A. F. Similarities and differences in the regulation of leukocyte extravasation and vascular permeability. Seminars in Immunopathology. 36 (2), 177-192 (2014).
- Woodworth, C. D., et al. Strain-dependent differences in malignant conversion of mouse skin tumors is an inherent property of the epidermal keratinocyte. Carcinogenesis. 25 (9), 1771-1778 (2004).
- Tennenbaum, T., et al. The suprabasal expression of alpha 6 beta 4 integrin is associated with a high risk for malignant progression in mouse skin carcinogenesis. Cancer Research. 53 (20), 4803-4810 (1993).
- Hennings, H., Shores, R., Mitchell, P., Spangler, E. F., Yuspa, S. H. Induction of papillomas with a high probability of conversion to malignancy. Carcinogenesis. 6 (11), 1607-1610 (1985).
- Auto, Y., et al. Time-Series Analysis of Tumorigenesis in a Murine Skin Carcinogenesis Model. Scientific Reports. 8 (1), 12994 (2018).
- Park, H., et al. Bone marrow-derived epithelial cells and hair follicle stem cells contribute to development of chronic cutaneous neoplasms. Nature Communications. 9 (1), 5293 (2018).
- Reeves, M. Q., Kandyba, E., Harris, S., Del Rosario, R., Balmain, A. Multicolour lineage tracing reveals clonal dynamics of squamous carcinoma evolution from initiation to metastasis. Nature Cell Biology. 20 (6), 699-709 (2018).
- Dao, V., et al. Prevention of carcinogen and inflammation-induced dermal cancer by oral rapamycin includes reducing genetic damage. Cancer Prevention Research. 5, Philadelphia Pa. 400-409 (2015).
- Yeong, L. T., Abdul Hamid, R., Saiful Yazan, L., Khaza’ai, H., Mohtarrudin, N. Low dose triterpene-quinone fraction from Ardisia crispa root precludes chemical-induced mouse skin tumor promotion. BMC Complementary and Alternative Medicine. 15 (1), 431 (2015).
- Kong, Y. H., Xu, S. P. Salidroside prevents skin carcinogenesis induced by DMBA/TPA in a mouse model through suppression of inflammation and promotion of apoptosis. Oncology Reports. 39 (6), 2513-2526 (2018).
- Jung, M., Bu, S. Y., Tak, K. H., Park, J. E., Kim, E. Anticarcinogenic effect of quercetin by inhibition of insulin-like growth factor (IGF)-1 signaling in mouse skin cancer. Nutrition Research and Practice. 7 (6), 439-445 (2013).
- Hu, Y. Q., Wang, J., Wu, J. H. Administration of resveratrol enhances cell-cycle arrest followed by apoptosis in DMBA-induced skin carcinogenesis in male Wistar rats. European review for medical and pharmacological sciences. 13, 2935-2946 (2016).
- Schweizer, J., Loehrke, H., Hesse, B., Goerttler, K. 7,12-Dimethylbenz[a]anthracene/12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate-mediated skin tumor initiation and promotion in male Sprague-Dawley rats. Carcinogenesis. 3 (7), 785-789 (1982).
- Vähätupa, M., et al. T-cell-expressed proprotein convertase FURIN inhibits DMBA/TPA-induced skin cancer development. Oncoimmunology. 5 (12), 1245266 (2016).
- May, U., et al. Resistance of R-Ras knockout mice to skin tumour induction. Scientific Reports. 5, 11663 (2015).
- Krajewska, M., et al. Image analysis algorithms for immunohistochemical assessment of cell death events and fibrosis in tissue sections. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (7), 649-663 (2009).
- Järvinen, T. A., Ruoslahti, E. Target-seeking antifibrotic compound enhances wound healing and suppresses scar formation in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21671-21676 (2010).
- Schwarz, M., Münzel, P. A., Braeuning, A. Non-melanoma skin cancer in mouse and man. Archives of Toxicology. 87 (5), 783-798 (2013).
- Slaga, T. J. SENCAR mouse skin tumorigenesis model versus other strains and stocks of mice. Environmental Health Perspectives. 68, 27-32 (1986).
- Goerttler, K., Loehrke, H., Schweizer, J., Hesse, B. Systemic two-stage carcinogenesis in the epithelium of the forestomach of mice using 7,12-dimethylbenz(a)anthracene as initiator and the phorbol ester 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate as promoter. Cancer Research. 39 (4), 1293-1297 (1979).
- Topping, D. C., Nettesheim, P. Promotion-like enhancement of tracheal carcinogenesis in rats by 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate. Cancer Research. 40, 4352-4355 (1980).
- Wille, J. J. Circadian rhythm of tumor promotion in the two-stage model of mouse tumorigenesis. Cancer Letters. 190 (2), 143-149 (2003).
- Lee, Y. S., et al. Inhibition of skin carcinogenesis by suppression of NF-κB dependent ITGAV and TIMP-1 expression in IL32γ overexpressed condition. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 37 (1), 293 (2018).
- Kiss, A., et al. Cell type-specific p38δ targeting reveals a context-, stage-, and sex-dependent regulation of skin carcinogenesis. International Journal of Molecular Sciences. 20 (7), 1532 (2019).
- Tomo-o, I., et al. Positron emission tomography imaging of DMBA/TPA mouse skin multi-step tumorigenesis. Molecular Oncology. 4 (2), 119-125 (2010).
- Mantovani, A., Allavena, P., Sica, A., Balkwill, F.
- Crusz, S. M., Balkwill, F. R. Inflammation and cancer: advances and new agents. Nature Reviews. Clinical Oncology. 12 (10), 584-596 (2015).
- Hennings, L., et al. Malignant conversion and metastasis of mouse skin tumors: a comparison of SENCAR and CD-1 mice. Environmental Health Perspectives. 68, 69-74 (1986).
- Gómez-Cuadrado, L., Tracey, N., Ma, R., Qian, B., Brunton, V. G. Mouse models of metastasis: progress and prospects. Disease Models & Mechanisms. 10 (9), 1061-1074 (2017).
- Ouhtit, A., Ananthaswamy, H. N. A model for UV-induction of skin cancer. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 1 (1), 5-6 (2001).
- Day, C. -P., Marchalik, R., Merlino, G., Michael, H. T. Mouse models of UV-induced melanoma: genetics, pathology, and clinical relevance. Laboratory Investigation. 97 (6), 698-705 (2017).
![Kemisk induceret Hudcarcinogenese model ved brug af Dimethylbenz [a] anthracen og 12-O-Tetradecanoyl Phorbols-13-acetat (DMBA-TPA)](https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/60445.jpg)
