Summary
To-trinns hud kreft er indusert av to lokalt anvendte kjemikalier. A arvestoffskadelig 7, 12-dimethylbenz [a] anthracene) forårsaker mutasjoner i epidermal celler og en kontinuerlig anvendelse av generell vekst stimulator 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate akselererer hudens papilloma formasjon.
Abstract
Kreft er en av de mest ødeleggende menneskelige sykdommer. Eksperimentelle kreft modeller er viktig for å få innsikt i det komplekse samspillet mellom ulike celletyper og gener for å fremme tumorprogresjon og for å gi en plattform for å teste effekten av ulike terapeutiske tilnærminger. En av de mest brukte eksperimentelle inflammatorisk kreft modellene er DMBA-TPA to-trinns hud kreft modell. Tumor formasjon er indusert i denne modellen av aktuell anvendelse av to ulike kjemikalier, 7, 12-dimethylbenz [a] anthracene (DMBA) og 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA), som sammen forårsake papilloma dannelse i huden. Som det primære utfallet er papilloma dannelse i huden, er modellen en ideell, pålitelig og reproduserbar måte å ta opp både tumor initiering (tumor-fri overlevelse) og tumorprogresjon (antall og størrelse på synlige svulster). Effekten av DMBA-TPA-behandlingen overføres via en inflammatorisk mekanisme, som gjør denne modellen spesielt egnet for å studere immunsystemets rolle i tumor dannelse. Imidlertid er denne modellen begrenset til huden og andre overflater der kjemikaliene kan påføres på. En detaljert protokoll er gitt i denne artikkelen for å bruke modellen vellykket.
Introduction
Kreft er en av de viktigste årsakene til dødsfall i verden. Derfor er det et krav om å utvikle pålitelig eksperimentell sykdom modeller for å få en bedre forståelse av sykdommen, samt å utforske potensielle terapeutiske tilnærminger. En av de mest brukte eksperimentelle in vivo-modeller for å studere hudkreft utvikling er den kjemisk indusert to-trinns hud kreft modell1,2. Modellen gir et verktøy for å studere tumor innvielse, forfremmelse, og progresjon i tillegg til bestemte hendelser som immun celle infiltrasjon og angiogenese.
For å bruke to-trinns hud kreft modell, er baksiden hud av mus behandlet med to forskjellige kjemikalier som sammen induserer tumor formasjon. Modellen initieres med en lav dose av arvestoffskadelig, DMBA, etterfulgt av forlenget eksponering for tumor arrangøren, TPA3 (figur 1). DMBA mutates DNA tilfeldig ved å danne kovalente addukter med DNA av epidermal celler og primære Keratinocyte stamceller4,5,6,7. Noen av disse tilfeldige mutasjoner finner sted i en proto-diagnostisk, slik som Hras1 (mutasjoner i Kras og NRAs er også oppdaget) og konvertering av proto-oncogenes til oncogenes stasjoner svulsten formasjonen under riktig stimuli. TPA, i sin tur, er den mest brukte tumor vekst-fremme agent. Dens molekylære mål er protein kinase C (PKC)8. TPA aktiverer også wnt/β-catenin signalering som er avgjørende for tumor dannelse i modellen9. Gjentatt og langvarig eksponering for fremme agent fører til økt celle signalering, økt produksjon av vekstfaktorer, og en lokal inflammatorisk reaksjon, som er tydelig på grunn av økt DNA-syntese og inflammatorisk celle infiltrasjon i den behandlede huden.
De viktigste inflammatoriske meglere i DMBA-TPA-modellen har blitt identifisert10. Interleukin-17A (Il-17A) er kjent for å være spesielt tumorigene i DMBA-TPA-modellen11,12. Det fungerer i synergi med interleukin 6 (Il-6) og deltar i macrophage og nøytrofile rekruttering13,14. I tillegg har CD4+ T celler og nøytrofile blitt vist å være TUMORIGENE i DMBA-TPA-modellen. Endelig kan makrofager også fremme tumorigenesis i modellen15,16,17.
I løpet av kampanje fasen, celle spredning av muterte celler er forbedret og en vedvarende, ved over huden opprettholdes1. Dette fører til papilloma utvikling i huden i 10-20 uker, hvoretter papillomer begynner å konvertere til ondartede svulster, plateepitel celle kreftsvulster (SCCs)2. Men mindre enn 10% av papillomer fremdrift til kreft, selv om denne prosentandelen også avhenger av den genetiske bakgrunnen til musene2,18. I flere ti år var det ikke kjent hvilken type celler opprinnelig ble mutert i svulster som fører til kreft, selv om noen studier hadde rapportert klart distinkte funksjoner i ondartet svulster i forhold til godartet papillomer19,20. Men nyere studier har i stor grad økt vår forståelse på klonal opprinnelsen til tumor dannelse i DMBA-TPA-modellen21. 22i. 23. det ble demonstrert at både benmarg-avledet epitelceller og hårsekken stamceller bidrar til tumor formasjon22. Stage-spesifikke avstamning tracing studier har avduket at godartet papillomer er av monoklonale opprinnelse, men de rekruttere nye epitel celle populasjoner21,23. Men bare én av celle kloner fungerer som en driver for kreft; den inneholder en HRAS mutasjon23. Progresjon til kreft formasjon er forbundet med en klonal feie23.
Kreftfremkallende DMBA initierer papilloma formasjon og TPA fremmer tumor vekst. Derfor kan tumor innvielsen bli studert separat fra kampanjen ved å avbryte eksperimentet før den TPA behandlingsperioden. Som tumorprogresjon er studert ukentlig det gir en stor mulighet for detaljert tumor vekst analyse gjennom studien. Fordi svulster er generert av eksterne kjemikalier, en kreftfremkallende mutasjon i germline er unødvendig. Dermed studere virkningene av en genetisk bakgrunn (f. eks knockout/transgene g. Wild type) på tumorigenesis er enkel2. I sum er DMBA/TPA hudkreft modellen en spesielt nyttig tilnærming for å studere rollen til immunsystemet i tumorprogresjon samt for evaluering av tumor innvielse og forfremmelse trinn uavhengig eller uavhengig.
Figur 1: DMBA-TPA-indusert hud kreft modell omriss. Kreftfremkallende DMBA brukes lokalt for å indusere DNA-mutasjoner i startfasen av modellen. Veksten-fremme agent TPA administreres 2x i uken for å forbedre celle spredning i løpet av kampanje fasen, som fører til utvikling av papillomer i huden. Dyr blir ofret etter papilloma responsen når et platå, vanligvis innen uker 15 – 20, avhengig av den genetiske bakgrunnen til musene. En liten andel av papillomer kan videreutvikle seg i SCCs i løpet av 20 – 50 uker. For å studere tidlige hendelser i initiering og tidlig forfremmelse fasen, kan prøvene samles (f. eks, kort tid etter den andre TPA-programmet). En representativ fotografi og hematoksylin og eosin farget tverrsnitt av papillomer på en C57BL/6 mus huden etter 19 ukers behandling er vist. Scale bar = 0,1 mm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen som beskrives her, er godkjent av Finlands nasjonale komité for dyreetikk (Protokollnummer ESAVI/23659/2018).
1. eksperimentelle dyr, reagenser og utstyr
- Bruk mus som passer til alder og sex. Start studien på 7 – 9 ukers alder, fordi huden i de fleste mus er i telogen (hvile fasen) rundt den alderen2.
- Observere oppførselen til dyrene i løpet av studien, og hvis de kjemper, som ofte skjer med menn, huse dem separat. Kamper kan forårsake kutt i huden, som fremmer tumor dannelse. Kvinnelige mus foretrekkes på grunn av deres mindre aggressiv atferd. Den typiske eksperimentelle gruppestørrelsen varierer mellom 8 – 20 dyr per gruppe24,25,26,27.
Merk: kraft beregninger basert på biologisk varians sett i tidligere studier bidrar til å velge en tilstrekkelig stor gruppe størrelse. Stammene som brukes som eksempler i denne artikkelen, inkluderer Balb/c og C57BL/6. Imidlertid, mange annet musen belastninger som SENCAR og FVB ha blitt anvendt med det DMBA-TPA-modell, likeledes idet Wistar og Sprague-Dawley rotter2,28,29. En lisens fra den nasjonale eller lokale komiteen av animalsk arbeid er nødvendig før initiering av studien. I tillegg til generelle velferds hensyn, er modellspesifikke endepunkter vanligvis plateepitelkreft (SCC) og en infeksjon i huden. Riper i huden på grunn av kløe etter påføring av tumorigene kjemikalier i aceton er typisk, men ellers dyrene skal ikke vise tegn til ubehag. Veiing regelmessig (for eksempel 2x i måneden) bidrar til å evaluere dyrenes velferd. - Bruk DMBA og TPA, både fortynnet i aceton. Arbeids konsentrasjonen av DMBA er 250 g/L. En dose for ett dyr er 50 μg av DMBA i 200 μL av aceton. Lager konsentrasjonen av TPA er 125 g/L og behandlings konsentrasjonen 25 g/L. En TPA-dose for ett dyr er 5 μg i 200 μL av aceton.
Forsiktig: DMBA er skadelig ved svelging og kan forårsake kreft. Aceton fordamper raskt og er brannfarlig. Det kan føre til svimmelhet og irritere øyne. Bruk en pustemaske og/eller arbeid under en vakuum flyt. Bytt hansker etter håndtering av noen av disse kjemikaliene. Individuelt ventilerte bur hindrer spredning av kjemikaliene i huset til musene. Etter påføring skal du samle opp pipette-tipsene som brukes til å håndtere DMBA og kvitte deg med farlig avfall.
Merk: DMBA må beskyttes mot lys. Den fortynnede TPA oppbevares i-20 ° c, fortrinnsvis beskyttet mot lys. - Anskaffe følgende utstyr: en skala, en vanlig barbermaskin for pelsen, Pipetter og tips av en passende størrelse, en vanlig linjal, et digitalt kamera, en notisblokk og en penn eller en datamaskin for innspilling av papillomer, en inhalert anestesi system eller en mus restrainer med en åpning på baksiden toppen, og en karbondioksid narkose system for å ofre mus.
2. Skin papilloma induksjon og Promotion
- Barbere baksiden hud og veie dyret. Senere, barbere huden når det trengs, men ikke på tidspunktet for kjemisk eksponering.
Merk: Vær forsiktig når du barberer deg rundt papillomer og unngår å gjøre noen kutt på huden. Veie hver dyr enhver 2 ukens å legge merke til alle muligheter vekt forlis. - Påfør 50 mikrogram DMBA i 200 μL av aceton lokalt på det barberte området ved hjelp av en pipette 48 h etter barbering av pelsen. Hvis nødvendig, holde dyret ved hjelp av lys inhalasjon anestesi eller en mus restrainer.
- Etter 7 dager, gi den første TPA-dosen. Påfør 5 mikrogram TPA i 200 μL av aceton lokalt med en pipette 2x i uken, fortrinnsvis mandag og torsdag eller tirsdag og fredag.
- Tell, ta opp og fotografer papillomer hver uke. En håndgripelig masse større enn 1 mm i diameter regnes som en papilloma hvis den holder seg lenger enn 1 uke. Merk hver enkelt papilloma på et kart, og Vis størrelsen hver uke. Lagre digitale fotografier.
3. Animal offer og sample Collection
- Fortsett behandlingen til tumor responsen når et platå. Vanligvis papilloma byrden forventes å øke 10 – 20 uker etter initiering, avhengig av musen belastningen brukes. Platået er ventet i 15-20 uker. En liten andel av papillomer (under 3%) kan utvikle seg til SCCs innen 20 – 50 uker2.
- Ofre dyrene 24 h etter siste TPA-programmet. Bruk karbondioksid narkose med cervical forvridning eller en annen egnet metode.
- Avhengig av forskningsspørsmål, samle passende Prøvemateriale fra dyrene30,31.
- For eksempel ta blodprøver før offer og skille plasma.
- Skjær deler av huden for immunhistokjemi (IHC) farging (f. eks, hematoksylin og eosin, voksende eller inflammatoriske celler).
- Bruk biopsi slag for å samle hud biter med enten papilloma vev eller ikke-papilloma (behandlet) hud for genuttrykk (f. eks qPCR) og/eller protein analyser (f. eks Western Blot eller ELISA).
- Samle et stykke av milten og hud-drenering lymfeknuter for Flow flowcytometri analyse hvis mer detaljert analyse av immun cellen populasjoner er ønsket. Du kan også skille epidermal og dermal lag for videre analyser.
4. statistikk
- Tegn en Kaplan-Meier overlevelse kurve av papilloma-fritid og bruke mantel-Cox log-Rank test for overlevelse. Tegn en lineær kurve på antall papillomer per uke. Fordi dette er telle data, kan du bruke en ikke-lineær regresjon modell. Rådfør deg med en statistiker om nødvendig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det viktigste utfallet er overlevelse (dvs. papilloma fri) tid mellom behandling eller genotype grupper. Det sekundære resultatet er antall papillomer per uke i hver gruppe (figur 2). De forventede resultatene er en statistisk signifikant forskjell i papilloma fritid og i antall papillomer mellom de eksperimentelle (to eller flere) grupper. Det anbefales å telle antall papillomer og tegne en kurve under forfremmelse (TPA) fase for å få et inntrykk av forskjellene mellom gruppene på det stadiet. Å avslutte eksperimentet for tidlig kan skjule en statistisk signifikant forskjell.
Figur 2: de viktigste resultatene av DMBA-TPA-indusert hud kreft modell. Representative bilder av papillomer på musen hud og de to viktigste utfall. Data ble kombinert fra fire separate eksperimenter. Merk: eksperimenter med Balb/C og C57BL/6 mus ble gjort separat. (A) en overlevelse tomten av papilloma fritiden. Stiplet linje = Balb/c og heltrukket linje = C57BL/6. (B) gjennomsnittlig antall papillomer per mus. Stiplet linje = Balb/c og heltrukket linje = C57BL/6. Feil stolper = SEM. (C) en Balb/C mus med papillomer på 11 UKER etter DMBA behandling. (D) en C57BL/6-mus med papillomer ved 11 UKER etter DMBA-behandling. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Histologi, mRNA, og celle-og proteinanalyse kan gjennomføres for å utforske de underliggende mekanismene for de observerte forskjellene. For eksempel, histologiske analyser er egnet for å studere strukturen av papillomer, morfologi av huden (epidermal og dermal tykkelse), ulike biologiske prosesser (spredning, apoptose, angiogenese), eller infiltrasjon av immunceller32 (Figur 3). Huden er ideell for pålitelige kvantifisering av morfologiske og IHC parametre av State-of-Art image analyse systemer30,31,32,33. Gene og protein uttrykk fra (papilloma) hud prøvene kan lett studert med standard metoder30. Flow flowcytometri er et nyttig verktøy for analyse av ulike immun celle populasjoner av milten og huden-drenering lymfeknuter, som tidligere beskrevet30. Valget av analytiske metoder avhenger av forsknings spørsmålet og må tas i betraktning før eksperimentet starter.
Figur 3: histologiske analyse av inflammatorisk celle infiltrasjon i DMBA-TPA-modellen. Representative histologiske tverrsnitt fra PFA-Fixed parafin-innebygd hud i DMBA-TPA-modellen. Skin seksjoner ble farget med en macrophage markør F4/80 (brun). Skala bars = 200 μm. (A) bare noen få F4/80 positive makrofager ble sett i normal, ubehandlet hud. (B) macrophage infiltrasjon i dermis var tydelig på tidlig stadium av kreft forfremmelse, på 2 uker og 36 h etter den andre TPA-administrasjonen. Også epidermal hyperproliferation ble sett på 2 uker, som vist ved tykkelse av epidermis. (C) ikke-papilloma hud ved 19 uker fortsatt viste en bemerkelsesverdig infiltrasjon av makrofager. (D) en sterk opphopning av makrofager ble sett under papillomer i DERMIS av DMBA-TPA behandlede dyr. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DMBA-TPA-indusert hudkreft er en av de mest brukte kreft modeller fordi det er svært reproduserbar og gir informasjon om tumorprogresjon fra innvielse til kreft. Nøkkelen utfallet mål, papilloma formasjon, er lett og pålitelig kvantitativ. Modellen adresserer både tumor initiering (tumor-fri overlevelse) og progresjon (tumor tall og størrelser) samtidig. Modellen er egnet for å studere ulike forbindelser, slik som potensielle legemiddel, og virkningene av individuelle gener på tumorprogresjon i genmodifiserte dyr. Ved anvendelse av modellen for en gitt stamme, er det tilrådelig å studere den eksisterende litteraturen for å oppnå en idé om hvordan belastningen reagerer i modellen (for eksempel for å finne ut hvor raskt den første papillomer vil vises). Ved bruk av genmodifiserte mus, anbefales bruk av Wild type littermates alltid. Bruk av potensielle ekstra kontroller, for eksempel erstatte enten DMBA eller TPA eller begge av aceton, er svært diskuteres, fordi det er kjent at å fjerne enten DMBA eller TPA eller invertere deres administrasjons ordre er svært usannsynlig å resultere i induksjon av papilloma vekst34. Når det er viktig å studere tumor initiering (dvs. ved administrering av DMBA alene), kan det oppnås ved å ofre dyrene etter DMBA dose. Når man studerer effekten av et enkelt gen i en transgene-eller knockout-innstilling, anbefales det å ta prøver fra ubehandlede dyr for å avdekke mulige forskjeller som kan eksistere før tumor dannelse mellom genetisk konstruert og vill type stammer30,31.
Selv om DMBA-TPA-modellen er relativt enkel å utføre teknisk, er nøyaktig timing avgjørende for suksess. Anvendelsen av DMBA og den vanlige anvendelsen av TPA er både avgjørende for tumor utvikling34. En nøye ukentlig undersøkelse av papillomer er avgjørende for å samle alle data. Det må bemerkes at enkelte behandlinger eller genetisk bakgrunn kan føre papillomer å vokse og senere krympe eller forsvinne30. Noen ganger, andre noncancerous lesjoner og SCCs oppstår. I dette tilfellet anbefales histologiske undersøkelse av lesjon. Et annet kritisk skritt er å sikre at TPA er den eneste tumor Promotor. Skin Trauma induserer produksjon av cytokiner som kan påvirke tumor forfremmelse2,34. Således må iatrogenic såret i huden under barbering unngås, og aggressive, kamp mus skal være plassert separat. Foruten kampen, annet aspektene av dyr velferd er likeledes betydelig. Vekttap, kjedelig og viklet pels, og apatisk atferd er tegn på ubehag. Ubehaget er ikke bare et etisk problem, fordi negativ energibalanse hemmer tumorveksten34.
DMBA-TPA-modellen gir en mulighet for mange modifikasjoner. Fordi noen stammer er kjent for å være mer følsomme enn andre, en nøye utvalg gjør det mulig å planlegge eksperimentet og justere mengden og hyppigheten av TPA søknad18,35. Modellen er i hovedsak brukt for å utvikle hudkreft, men lokal applikasjon til mage-tarmkanalen er et alternativ36. I tillegg har en modifisert versjon av modellen blitt brukt til å studere tumor utvikling i luftrøret37. Fordi tumor utviklingen kan reguleres med DMBA-og TPA-applikasjoner, gjør modellen det mulig å studere resultatene etter å ha endret miljømessige aspekter som kosthold og døgnrytme38. Ved å skille tumor initiering (DMBA) og forfremmelse (TPA), modellen gjør det mulig å studere de to prosessene uavhengig. For eksempel, ofre musene etter DMBA behandling tillater å studere mekanismen for behandling eller effekten av et gen av interesse i tumor initiering2,34. Å studere de tidlige hendelsene i tumor initiering og forfremmelse, dyr kan bli ofret på et tidlig tidspunkt. Eksempler kan for eksempel samles inn kort tid etter den andre TPA-administrasjonen (for eksempel 3 h, 12 h, 36 h eller 48 h etter)30,31. Det er også verdt å merke seg at den klassiske DMBA-TPA to-trinns kreft modellen kan endres ved hjelp av ulike kjemikalier eller ved å bruke den "tredje" kjemiske. Disse gjennomgås av Abel et al2.
DMBA-TPA-modellen har blitt brukt i flere ti år for ulike formål34. Det har vært brukt for å studere virkningene av ulike legemiddel, 24,25,26 og gener31,32,39,40 men også for å studere ernæring27, den døgnrytme38, og utvikling av diagnostiske verktøy41. Som svulster form fra huden, gir modellen en unik mulighet til å samle tumor vevsprøver på ulike stadier av progresjon21. Ved innføring av nye chemopreventive agenter eller immunomodulators, er det tilrådelig å først samle data om hvordan belastningen har reagert i DMBA-TPA-modellen i tidligere studier. Hvis ikke tilgjengelig, en prestudy uten potensiell terapeutisk agent anbefales å bestemme timing og antall papillomer samt varians i disse parametrene. Eksisterende data fra publiserte studier kan også bidra til å bestemme doseringen av testet sammensatte24,27, men hvis utilgjengelig, ved hjelp av en seriell fortynning av testet sammensatte muliggjør evaluering av dose responsen av agenten studerte25,26.
Betennelse er avgjørende for menneskelig tumorigenesis, som det er involvert i alle faser av tumorprogresjon: innvielsen, kampanjen, og konverteringen til kreft42,43. Den kjemisk induserte hud kreft modellen er en betennelse-drevet kreft modell. Pro-inflammatorisk cytokin respons og infiltrasjon av inflammatoriske celler til den behandlede huden er allerede tydelig i den tidlige fasen av modellen. De første infiltrere cellene er nøytrofile, etterfulgt av akkumulering av makrofager, T-celler, etc.30,31. Disse cellene skape en inflammatorisk mikromiljøet i huden, og et kors snakk mellom inflammatoriske og epidermal celler er igangsatt, fører til produksjon av cytokiner, chemokiner, og prostaglandiner som driver tumor initiering og vekst lokalt. Som DMBA-TPA-modellen er en betennelse-drevet modell, det inkluderer ikke noen andre aspekter av klinisk kreft. Selv om det er kjent at SCCs til slutt kan forårsake metastasering i DMBA-TPA-modellen, bare en liten del av papillomer utvikle seg til SCCs2,23. Følgelig er metastasering en sjelden funksjon i DMBA-TPA-modellen, selv om noen følsomme outbred bestander som CD-1 eller SENCAR kan ha en økt sannsynlighet for å utvikle metastasering44. Utseendet til SCC er ofte betraktet som en dyrevelferd problemet og dermed et endepunkt criterium. Derfor, til tross for eksistensen av metastasering i modellen, noen andre modeller som transplantasjon eller genetisk konstruert modeller er mer egnet for å studere metastasering45. En annen begrensning av modellen er at det krever en overflate for å bruke kjemikaliene. Således, studere kreft progresjon i et bestemt indre organ er ute av omfanget av modellen.
En annen vanlig hudkreft modellen er UV-stråling modellen46. Modellen kan sammenlignes med DMBA-TPA-modellen fordi ingen av disse to modellene trenger celle transplantasjon eller genetisk modifisering for å forårsake kreft. Den grunnleggende forskjellen mellom modellene er at UV-stråling modellen induserer aggressiv SSC formasjon, mens tumor utfallet i DMBA-TPA-modellen er generelt godartet papillomer. Hvis UV-stråling er kombinert med anvendelse av kjemiske kreftfremkallende eller i mus stammer med en genetisk bakgrunn som gjør belastningen utsatt for kreftutvikling, selv melanom formasjon kan skje. De vanligste mutasjoner i UV-stråling modellen deaktivere p53 genet, en avgjørende svulst Suppressor genet hos mennesker46, mens de vanligste MUTASJONER i DMBA-TPA modellen aktivere HRAS-genet23. UV-stråling fører også immunsuppresjon46,47, som kan være en forvirrende faktor når studere aspekter av immunsystemet. Disse to modellene fungerer imidlertid også sammen. UV-stråling kan brukes som et fremmende middel med DMBA eller som en initiering agent med TPA46.
Et rimelig spørsmål er om DMBA-TPA-modellen etterligner menneskelig kreft. En liten andel av papillomer utvikles til SCCs. Likevel er det premaligne stadiet av menneskelig SCC aktinisk keratose, og det skiller seg fra den papilloma formasjonen sett i modellen. Likevel, papilloma formasjon som ligner på modellen er oppdaget i menneskelige individer behandlet for melanom med vemurafenib. Dette tyder på at HRAS-muterte stamceller som er essensielle for kreft i DMBA-TPA-modellen også finnes på Human Skin34. Videre er det rapportert at opptaket av 2-deoxy-2-[18f]-fluoro-D-glukose (18f-FDG) papillomer og microinvasive SCCs er høyere enn i den omkringliggende huden, men ikke så høy som i en fullt invasiv SCC, reflekterer likheten av premaligne stadier41. Hvis du bruker DMBA-TPA-modellen for evaluering av toksisitet, må man huske at repetisjon av eksponeringen har en stor effekt på tumor forfremmelse34. Minst noen av de molekylære mekanismene er felles for modellen og menneskelig hud.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av Academy of Finland (tilskudd 25013080481 og 25013142041 (I.J.), 286377 og 295814 (M.P.), 287907 (TJ)), Päivikki og Sakari Sohlberg Foundation (M.P., TJ), Finnish Medical Foundation (T.P.), The konkurrerende State Research Finansiering av Expert ansvar området Tampere University Hospital (Grant 9V049 og 9X044 (M.P.), 9X011 og 9V010 (TJ)), den konkurransedyktige State Research finansiering av Expert ansvarsområde av Fimlab Laboratories (Grant X51409 (I.J.)), Tays Support Foundation (I.J., M.P., TJ), Tampere tuberkulose Foundation (I.J., M.P., TJ), den finske Cultural Foundation (M.V.), Paulo Foundation (T.P.), Cancer Society of Finland (M.P.), og Emil Aaltonen Foundation (T.P.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1000 ul RPT XL Graduated Filter Tip (Sterile), Refill | Starlab | S1182-1730-C | |
| 300 ul RTP Graduated Filter Tip (sterile), Refill | Starlab | S1180-9710-C | |
| 7,12-Dimethylbenz[a]anthracene (DMBA) | Sigma | D3254-100MG | Harmful if swallowed and may cause cancer. Store protected from light. |
| Acetone | Sigma | 1000141011 | Evaporates rapidly and is inflammable. |
| Attane vet 1000 mg/g | Piramal Critical Care Limited | Liquid isoflurane for inhalation | |
| Battery-Operated Clipper Isis | Albert Kerlb GmbH | GT421 | For shaving the fur |
| CONTRAfluran-Restgasfilter | ZeoSys GmbH | For anesthesia | |
| Linex Nature N1030 Ruler 30 cm | Staples Business Advantage | 60383 | For measuring papillomas |
| Medium CO2 Chamber 300 x 200 x 200mm - Red | VetTech Solutions Ltd | AN045AR | For sacrifice |
| Mekasoft | Mekalasi | 23008 | Table cover |
| Mice (Balb/c JRj) | Janvier labs | Other strains also possible | |
| Mice (C57BL/6JRj) | Janvier labs | Other strains also possible | |
| Panasonic Lumix DMC-FS5 Digital Camera | Panasonic | ||
| Paraformaldehyde | Merck | 30525-89-4 | For histology samples |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate aka 12-Otetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) | Enzo | BML-PE160-0001 | |
| Precision balance PLJ-C/PLJ-G | KERN & SOHN GmbH | PLJ 600-3CM | |
| Pre-Set CO2 System-2 Chamber-S/S Housing | VetTech Solutions Ltd | AN044BX | For sacrifice |
| RNAlater | Qiagen | 76104 | For nucleic acid samples |
| Tacta pipette 100-1000 ul | Sartorius | LH-729070 | |
| Tacta pipette 20-200 ul | Sartorius | LH-729060 | |
| UNO Anaesthetic Key Filler | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia | |
| UNO Face Mask for Mouse | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia | |
| UNO FM2200 Flowmeter | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia | |
| UNO Gas Exhaust Unit | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia | |
| UNO Induction Box | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia | |
| UNO200VAP Vaporizer | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia |
References
- DiGiovanni, J. Multistage carcinogenesis in mouse skin. Pharmacology & Therapeutics. 54 (1), 63-128 (1992).
- Abel, E. L., Angel, J. M., Kiguchi, K., DiGiovanni, J. Multi-stage chemical carcinogenesis in mouse skin: fundamentals and applications. Nature Protocols. 4 (9), 1350-1362 (2009).
- Perez-Losada, J., Balmain, A. Stem-cell hierarchy in skin cancer. Nature Reviews. Cancer. 3 (6), 434-443 (2003).
- Bonham, K., et al. Activation of the cellular Harvey ras gene in mouse skin tumors initiated with urethane. Molecular Carcinogenesis. 2 (1), 34-39 (1989).
- Quintanilla, M., Brown, K., Ramsden, M., Balmain, A. Carcinogen-specific mutation and amplification of Ha-ras during mouse skin carcinogenesis. Nature. 322 (6074), 78-80 (1986).
- Nelson, M. A., Futscher, B. W., Kinsella, T., Wymer, J., Bowden, G. T. Detection of mutant Ha-ras genes in chemically initiated mouse skin epidermis before the development of benign tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (14), 6398-6402 (1992).
- Morris, R. J. A perspective on keratinocyte stem cells as targets for skin carcinogenesis. Differentiation. 72 (8), 381-386 (2004).
- Chung, Y. W., Kim, H. K., Kim, I. Y., Yim, M. B., Chock, P. B. Dual function of protein kinase C (PKC) in 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA)-inducec manganese superoxide dismutase (MnSOD) expression: activation of CREB and FOXO3a by PKC-alpha phosphorylation and by PKC-mediated inactivation of Akt, respectively. The Journal of Biological Chemistry. 286 (34), 29681-29690 (2011).
- Su, Z., et al. Tumor promoter TPA activates Wnt/β-catenin signaling in a casein kinase 1-dependent manner. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (32), 7522-7531 (2018).
- Swann, J. B., et al. Demonstration of inflammation-induced cancer and cancer immunoediting during primary tumorigenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 652-656 (2008).
- Wang, L., Yi, T., Zhang, W., Pardoll, D. M., Yu, H. IL-17 enhances tumor development in carcinogen-induced skin cancer. Cancer Research. 70 (24), 10112-10120 (2010).
- He, D., et al. IL-17 mediated inflammation promotes tumor growth and progression in the skin. PLoS One. 7 (2), 32126 (2012).
- Roussel, L., et al. IL-17 promotes p38 MAPDK-dependent endothelial activation enhancing neutrophil recruitment to sites of inflammation. Journal of Immunology. 184 (8), 4531-4537 (2010).
- Wanqiu, H., Young-Hee, J., Hyun, S. K., Byung, S. K. Interleukin-6 (IL-6) and IL-17 synergistically promote viral persistence by inhibition cellular apoptosis and cytotoxic T cell function. Journal of Virology. 88 (15), 8479-8489 (2014).
- Yusuf, N., et al. Antagonistic roles of CD4+ and CD8+ T-cells in 7,12-dimethylbenz(a)anthracene cutaneous carcinogenesis. Cancer Research. 68 (10), 3924-3930 (2008).
- Gong, L., et al. Promoting effect of neutrophils on lung tumorigenesis is mediated by CXCR2 and neutrophil elastase. Molecular Cancer. 12 (1), 154 (2013).
- Vestweber, D., Wessel, F., Nottebaum, A. F. Similarities and differences in the regulation of leukocyte extravasation and vascular permeability. Seminars in Immunopathology. 36 (2), 177-192 (2014).
- Woodworth, C. D., et al. Strain-dependent differences in malignant conversion of mouse skin tumors is an inherent property of the epidermal keratinocyte. Carcinogenesis. 25 (9), 1771-1778 (2004).
- Tennenbaum, T., et al. The suprabasal expression of alpha 6 beta 4 integrin is associated with a high risk for malignant progression in mouse skin carcinogenesis. Cancer Research. 53 (20), 4803-4810 (1993).
- Hennings, H., Shores, R., Mitchell, P., Spangler, E. F., Yuspa, S. H. Induction of papillomas with a high probability of conversion to malignancy. Carcinogenesis. 6 (11), 1607-1610 (1985).
- Auto, Y., et al. Time-Series Analysis of Tumorigenesis in a Murine Skin Carcinogenesis Model. Scientific Reports. 8 (1), 12994 (2018).
- Park, H., et al. Bone marrow-derived epithelial cells and hair follicle stem cells contribute to development of chronic cutaneous neoplasms. Nature Communications. 9 (1), 5293 (2018).
- Reeves, M. Q., Kandyba, E., Harris, S., Del Rosario, R., Balmain, A. Multicolour lineage tracing reveals clonal dynamics of squamous carcinoma evolution from initiation to metastasis. Nature Cell Biology. 20 (6), 699-709 (2018).
- Dao, V., et al. Prevention of carcinogen and inflammation-induced dermal cancer by oral rapamycin includes reducing genetic damage. Cancer Prevention Research. 5, Philadelphia Pa. 400-409 (2015).
- Yeong, L. T., Abdul Hamid, R., Saiful Yazan, L., Khaza’ai, H., Mohtarrudin, N. Low dose triterpene-quinone fraction from Ardisia crispa root precludes chemical-induced mouse skin tumor promotion. BMC Complementary and Alternative Medicine. 15 (1), 431 (2015).
- Kong, Y. H., Xu, S. P. Salidroside prevents skin carcinogenesis induced by DMBA/TPA in a mouse model through suppression of inflammation and promotion of apoptosis. Oncology Reports. 39 (6), 2513-2526 (2018).
- Jung, M., Bu, S. Y., Tak, K. H., Park, J. E., Kim, E. Anticarcinogenic effect of quercetin by inhibition of insulin-like growth factor (IGF)-1 signaling in mouse skin cancer. Nutrition Research and Practice. 7 (6), 439-445 (2013).
- Hu, Y. Q., Wang, J., Wu, J. H. Administration of resveratrol enhances cell-cycle arrest followed by apoptosis in DMBA-induced skin carcinogenesis in male Wistar rats. European review for medical and pharmacological sciences. 13, 2935-2946 (2016).
- Schweizer, J., Loehrke, H., Hesse, B., Goerttler, K. 7,12-Dimethylbenz[a]anthracene/12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate-mediated skin tumor initiation and promotion in male Sprague-Dawley rats. Carcinogenesis. 3 (7), 785-789 (1982).
- Vähätupa, M., et al. T-cell-expressed proprotein convertase FURIN inhibits DMBA/TPA-induced skin cancer development. Oncoimmunology. 5 (12), 1245266 (2016).
- May, U., et al. Resistance of R-Ras knockout mice to skin tumour induction. Scientific Reports. 5, 11663 (2015).
- Krajewska, M., et al. Image analysis algorithms for immunohistochemical assessment of cell death events and fibrosis in tissue sections. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (7), 649-663 (2009).
- Järvinen, T. A., Ruoslahti, E. Target-seeking antifibrotic compound enhances wound healing and suppresses scar formation in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21671-21676 (2010).
- Schwarz, M., Münzel, P. A., Braeuning, A. Non-melanoma skin cancer in mouse and man. Archives of Toxicology. 87 (5), 783-798 (2013).
- Slaga, T. J. SENCAR mouse skin tumorigenesis model versus other strains and stocks of mice. Environmental Health Perspectives. 68, 27-32 (1986).
- Goerttler, K., Loehrke, H., Schweizer, J., Hesse, B. Systemic two-stage carcinogenesis in the epithelium of the forestomach of mice using 7,12-dimethylbenz(a)anthracene as initiator and the phorbol ester 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate as promoter. Cancer Research. 39 (4), 1293-1297 (1979).
- Topping, D. C., Nettesheim, P. Promotion-like enhancement of tracheal carcinogenesis in rats by 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate. Cancer Research. 40, 4352-4355 (1980).
- Wille, J. J. Circadian rhythm of tumor promotion in the two-stage model of mouse tumorigenesis. Cancer Letters. 190 (2), 143-149 (2003).
- Lee, Y. S., et al. Inhibition of skin carcinogenesis by suppression of NF-κB dependent ITGAV and TIMP-1 expression in IL32γ overexpressed condition. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 37 (1), 293 (2018).
- Kiss, A., et al. Cell type-specific p38δ targeting reveals a context-, stage-, and sex-dependent regulation of skin carcinogenesis. International Journal of Molecular Sciences. 20 (7), 1532 (2019).
- Tomo-o, I., et al. Positron emission tomography imaging of DMBA/TPA mouse skin multi-step tumorigenesis. Molecular Oncology. 4 (2), 119-125 (2010).
- Mantovani, A., Allavena, P., Sica, A., Balkwill, F. Cancer-related inflammation. Nature. 454 (7203), 436-444 (2008).
- Crusz, S. M., Balkwill, F. R. Inflammation and cancer: advances and new agents. Nature Reviews. Clinical Oncology. 12 (10), 584-596 (2015).
- Hennings, L., et al. Malignant conversion and metastasis of mouse skin tumors: a comparison of SENCAR and CD-1 mice. Environmental Health Perspectives. 68, 69-74 (1986).
- Gómez-Cuadrado, L., Tracey, N., Ma, R., Qian, B., Brunton, V. G. Mouse models of metastasis: progress and prospects. Disease Models & Mechanisms. 10 (9), 1061-1074 (2017).
- Ouhtit, A., Ananthaswamy, H. N. A model for UV-induction of skin cancer. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 1 (1), 5-6 (2001).
- Day, C. -P., Marchalik, R., Merlino, G., Michael, H. T. Mouse models of UV-induced melanoma: genetics, pathology, and clinical relevance. Laboratory Investigation. 97 (6), 698-705 (2017).
![Kjemisk-indusert Skin kreft modell bruke Dimethylbenz [a] Anthracene og 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-acetate (DMBA-TPA)](https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/60445.jpg)
