Summary
Les coraux créent des écosystèmes de biodiversèses importants pour les humains et les organismes marins. Cependant, nous ne comprenons toujours pas le plein potentiel et la fonction de nombreuses cellules coralliennes. Ici, nous présentons un protocole développé pour l’isolement, l’étiquetage et la séparation des populations de cellules coralliennes pierreuses.
Abstract
Les récifs coralliens sont menacés en raison de facteurs de stress anthropiques. La réponse biologique du corail à ces facteurs de stress peut se produire au niveau cellulaire, mais les mécanismes ne sont pas bien compris. Pour étudier la réponse des coraux aux facteurs de stress, nous avons besoin d’outils pour analyser les réponses cellulaires. En particulier, nous avons besoin d’outils qui facilitent l’application d’essais fonctionnels pour mieux comprendre comment les populations cellulaires réagissent au stress. Dans la présente étude, nous utilisons le tri cellulaire activé par la fluorescence (FACS) pour isoler et séparer différentes populations cellulaires dans les coraux pierreux. Ce protocole comprend : (1) la séparation des tissus coralliens du squelette, (2) la création d’une suspension à cellule unique, (3) l’étiquetage des cellules coralliennes à l’aide de divers marqueurs pour la cytométrie des débits, et (4) les stratégies de gating et de tri cellulaire. Cette méthode permettra aux chercheurs de travailler sur les coraux au niveau cellulaire pour l’analyse, les essais fonctionnels et les études d’expression génique de différentes populations cellulaires.
Introduction
Les récifs coralliens sont l’un des écosystèmes les plus importants sur Terre. Ils facilitent la biodiversité en fournissant des habitats essentiels pour les poissons et les invertébrés et sont essentiels pour soutenir les communautés anthropiques en fournissant des moyens de subsistance alimentaires et économiques grâce au tourisme1. En tant que principal constructeur de récifs coralliens, l’animal corallien (Phylum: Cnidaria) aide également les communautés côtières en créant de grands cadres de carbonate de calcium qui atténuent les dommages causés par les vagues et les tempêtes2.
Les coraux à l’âge adulte sont des animaux sessiles qui accueillent un large éventail de partenaires endosymbiotiques, y compris les virus, l’archaea, les bactéries, les protistes, les champignons, et plus particulièrement, les membres de la famille algale dinoflage Symbiodiniaceae3. Les changements dans l’environnement peuvent causer des déséquilibres dans cette communauté, entraînant souvent des épidémies et le blanchiment des coraux dans lesquels les Symbiodiniaceae symbiotiques sont expulsés de la colonie de corail, éliminant ainsi la principale source de nutrition pour le corail. Ces deux scénarios causent souvent la mort de l’hôte corallien4,5,6. Les effets des facteurs de stress induits par l’anththénie, tels que le changement climatique rapide, accélèrent les décès massifs de coraux, ce qui entraîne un déclin mondial des récifs coralliens7.
Récemment, de nombreuses méthodes différentes ont été développées pour aider à atténuer la perte de récifs coralliens. Ces méthodes comprennent l’aménagement de coraux sur les récifs existants, la traversée génétique à l’aide de génotypes tolérants thermiquement, et la manipulation cellulaire des communautés microbiennes et symbiotiques hébergées dans le corail8,9. Malgré ces efforts, beaucoup reste inconnu sur la diversité des cellules coralliennes et la fonction cellulaire10,11,12,13. Une compréhension approfondie de la diversité de type de cellules coralliennes et de la fonction cellulaire est nécessaire pour comprendre comment l’organisme corallien se comporte dans des conditions normatives et stressantes. Les efforts visant à maximiser l’efficacité de la restauration et de la préservation bénéficieront d’une meilleure compréhension de la façon dont la diversité cellulaire et le fonctionnement des gènes sont couplés.
Les travaux antérieurs sur la diversité et la fonction cellulaires ont principalement porté sur les études histologiques et l’échantillonnage de l’ARN de tissu entier14,15,16,17. Pour obtenir plus de détails sur la fonction spécifique de type cellulaire dans les coraux, il doit y avoir des méthodes pour l’isolement de populations spécifiques de cellules coralliennes vivantes. Ceci a été fait avec succès dans les organismes modèles non classiques au moyen de la technologie de cytométrie de débit activée par fluorescence (FACS)18. FACS utilise une combinaison de lasers réglés à différentes longueurs d’onde pour mesurer différentes propriétés cellulaires endogènes au niveau de la cellule unique comme la taille relative des cellules, la granularité cellulaire et l’autofluorescence. En outre, les cellules peuvent être marquées par des composés étiquetés fluorescents pour mesurer les propriétés spécifiques et souhaitées18,19.
Jusqu’à présent, l’application de la cytométrie des débits aux cellules coralliennes a été principalement pour l’analyse de Symbiodiniaceae symbiotique et d’autres populations bactériennes en utilisant leur forte, autofluorescence naturelle20,21,22. FACS a également été utilisé pour estimer la taille du génome corallien en utilisant le signal fluorescent marqueur d’ADN par rapport aux cellules d’organisme modèle de référence23,24. L’application efficace du FACS fournit trois outils distincts qui sont utiles pour les études de biologie cellulaire : 1) la description morphologique et fonctionnelle des cellules simples ; 2) l’identification, la séparation et l’isolement de populations cellulaires spécifiques pour des études en aval; et 3) l’analyse des tests fonctionnels au niveau de la cellule unique.
Le développement et l’application de divers marqueurs fluorescents exogènes pour l’étude des cellules coralliennes restent presque inexplorés. Ces marqueurs peuvent inclure des protéines étiquetées, des substrats marqués pour les enzymes ou des réponses fluorescentes à d’autres composés. Ces marqueurs peuvent être utilisés pour identifier les types de cellules qui ont des propriétés uniques, telles que la mise en évidence des cellules qui produisent des quantités variables d’une fonction spécifique compartiment cellulaire, comme les lysosomes. Un autre exemple est l’utilisation de perles étiquetées fluorescentes pour identifier fonctionnellement les cellules compétentes pour la phagocytose, ou l’engloutissement d’un agent pathogène ciblé25. Les populations de cellules actives dans les réponses immunitaires peuvent être facilement identifiées par FACS après l’engloutissement de ces perles exogènement appliquées. Tandis que les méthodes histologiques traditionnelles exigent le tissu préservé et beaucoup d’heures pour approximativer le pourcentage de cellules positives pour l’engloutissement de perle, un essai fonctionnel de FACS pour l’engloutissement d’agent pathogène peut être exécuté relativement rapidement sur des cellules vivantes isolées. En plus d’étudier les réponses spécifiques aux cellules au stress, cette technologie a le potentiel de clarifier l’expression spécifique aux gènes et d’éclairer l’histoire évolutive et développementale des types cellulaires entièrement uniques aux cnidarians, tels que les calicoblastes et les cnidocytes.
Récemment, nous avons effectué un dépistage intensif de plus de 30 marqueurs cellulaires qui ont abouti à l’identification de 24 qui sont capables d’étiqueter les cellules coralliennes, dont 16 sont utiles pour distinguer les populations uniques18, ce qui en fait des grappes de différenciation (CD). Ici, nous décrivons le processus d’isolement des cellules coralliennes dans pocillopora damicornis de l’enlèvement des cellules du squelette de carbonate de calcium à l’identification et l’isolement de populations cellulaires spécifiques avec FACS (figure 1).
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Protocol
1. Dissociation des tissus du squelette de corail par aérographe et compresseur
REMARQUE : Effectuez des marches sur la glace et protégez les mains avec des gants.
- Assembler le kit d’aérographe en connectant le compresseur d’air, le tuyau et l’aérographe(figure 2). Réglez la jauge de pression entre 276 et 483 kPa.
REMARQUE : Le compresseur et le tuyau d’air recommandés pour cette étude ont été prédéfinis à une pression maximale de 393 kPa. L’utilisation à l’extérieur de cette plage de 276-483 kPa peut entraîner soit un retrait inadéquat des cellules du squelette, soit une rupture des membranes cellulaires. Cette aire de répartition peut différer pour chaque espèce et nécessiter un test de viabilité. Un test de viabilité peut être effectué avec un sous-ensemble de la boue cellulaire avec un hémocytomètre simple et un test d’exclusion de teinture de 4, 6,6-diamidino-2-2 (DAPI), visualisé sur un microscope composé. - Préparer 100 ml de support de coloration cellulaire dans un autoclaved, récipient en verre stérile en ajoutant 33 ml de saline tamponnée au phosphate 10x (PBS; sans calcium et magnésium) à une concentration finale de 3,3x, 2 ml de sérum de veau fœtal (FCS; chaleur inactivée à 56 oC pendant 30 min) à 2 % du volume total, et 2 ml de tampon de 1 M HEPES à une concentration finale de 20 m. Puis couronnez-vous à 100 ml d’eau stérile.
REMARQUE : La concentration de 3.3x PBS a été choisie pour imiter la salinité de l’eau de mer, comme démontré dans Rosental et al.18. Cette concentration doit être ajustée pour les espèces présentes dans d’autres environnements pour imiter leur salinité. - Transférer 10 ml de support de coloration cellulaire à une bouteille d’aérographe (étiqueté « F » dans la figure 2) et attachez le couvercle d’adaptateur pour le connecteur d’aérographe.
REMARQUE : De plus grands fragments et des espèces avec des couches de tissu plus épaisses peuvent exiger plus de milieu pour l’élimination adéquate des tissus. - Pour les espèces de coraux ramifiées démontrées ici, utilisez un coupeur d’os pour couper ou couper un fragment de corail d’environ 3 à 5 cm de longueur ou 4 cm2 dans la région.
REMARQUE : Le fragment doit être clair des macroalgues et d’autres organismes multicellulaires parce qu’ils ne peuvent pas être retirés de l’échantillon en aval et contaminer l’échantillon au cours des processus d’analyse et de tri du FACS. Un fragment de 1 cm de P. damicornis donne environ 2 à 10 x 106 cellules après le filtrage, la coloration et le lavage. - Placez le fragment de corail à l’intérieur d’un sac de collecte en plastique et utilisez l’aérographe pour pulvériser le support de coloration cellulaire sur le corail (figure 2). Poursuivre ce processus jusqu’à ce que la plupart du squelette soit exposé. Retirer le squelette restant du sac de collecte.
2. Dissociation des cellules des tissus coralliens
REMARQUE : Effectuez toutes les marches sur la glace et protégez les mains avec des gants.
- Filtrer la boue cellulaire à travers une passoire de cellules en nylon de 40 m dans un tube de centrifugeuse de 50 ml afin d’obtenir une suspension à cellule unique.
REMARQUE : Différentes tailles de maille de paseuse cellulaire peuvent être plus appropriées pour différentes espèces. Cependant, de plus grandes tailles peuvent entraîner une dissociation inadéquate des tissus en raison du passage des débris et des amas cellulaires.- Pour les spécimens avec des couches de mucus plus épaisses, utilisez le piston stérilisé d’une seringue en plastique de 1 ml et broyez-le doucement contre le filtre pour briser les touffes et aider les cellules à passer à travers la passoire. Rincer la passoire et le piston avec des supports de teinture cellulaire dans le tube de centrifugeuse.
- Pelleter les cellules par centrifugation à 4 oC à 450 x g pendant 5 min. Enlever le supernatant et résuspendre les cellules dans 1 ml de support de coloration cellulaire.
3. Coloration cellulaire
REMARQUE : Effectuez toutes les marches sur la glace et protégez les mains avec des gants. Les taches figurant dans ce protocole sont à des fins de représentation. Les taches alternatives nécessiteront différentes concentrations et temps d’incubation.
- Transférer 500 L de cellules résutilisées dans un tube de fond rond de 5 ml et réserver comme échantillon témoin. N’ajoutez pas de tache à cet aliquot.
- À la suspension cellulaire restante, ajoutez 0,42 l de colorant de viabilité DAPI de 12 mM(tableau des matériaux),1 L de 5 M d’espèces réactives d’oxygène (ROS) tache(tableau des matériaux), et 0,1 l de 0,2 M tache de lysosome(Tableau des matériaux). Pipette bien mélanger et incuber sur la glace pendant 30 min dans l’obscurité pour éviter le photoblaching.
REMARQUE : LE DAPI est utilisé dans cet exemple pour servir de tache d’ADN et de colorant de viabilité pour le gating différentiel des cellules mortes sur la machine FACS. Cela suppose que DAPI pénètre les cellules mourantes en raison de l’intégrité de la membrane. La tache ROS émet de la lumière dans la gamme de 520 nm (vert), tandis que le marqueur lysosomal émet de la lumière à environ 668 nm (rouge). - Pellet 500 L des cellules tachées par centrifugation à 4 oC à 450 x g pendant 5 min. Enlever le supernatant et réutiliser la pastille dans 500 l de support de coloration cellulaire. Transférer dans un nouveau tube de fond rond de 5 ml et conserver sur la glace.
4. Démarrage FACS
REMARQUE : Les étapes peuvent varier selon la fonte et le modèle du cytomètre en raison des différences dans les lasers et les canaux. Pour ce protocole, un cytomètre avec 405, 488, 535, et 640 lasers de longueur d’onde nm a été utilisé. Les filtres présentés dans ce protocole sont à des fins de représentation. Les taches cellulaires alternatives peuvent nécessiter un ensemble différent de filtres et de lasers.
- Commencez à créer un nouveau modèle de projet sur le logiciel de trieur et choisissez le panneau laser. Pour la combinaison représentée de taches et de fluorescence naturelle, sélectionnez les quatre lasers (405, 488, 535 et 640 nm).
- Sélectionnez les filtres appropriés pour chaque couleur attendue représentée dans l’expérience.
- Pour détecter l’émission et l’aide DAPI dans la séparation des cellules vivantes et mortes, utilisez un filtre avec un bandpass (BP) de 450/50 (425-475 nm gamme) comme un filtre DAPI, Hoeschst ou Pacific Blue.
- Pour la détection de la lumière émise par le signal vert ROS, utilisez un filtre avec un BP de 530/30 (gamme de longueur d’onde de 515-545 nm) comme un filtre isothiocyanate de fluoresceine (FITC) ou de protéines fluorescentes vertes (GFP). Ce filtre mesurera la concentration de ROS dans chaque cellule.
- Ajoutez un filtre supplémentaire avec un filtre BP de 670/30 (655-685 nm) comme un filtre allophycocyanin (APC) pour la détection de l’émission de taches lysosomales.
REMARQUE : Le canal APC permettra la mesure de l’activité phagocytique. Ce canal détectera également l’autofluorescence générée par les algues symbiotiques coralliennes de la famille Symbiodiniaceae. Ce signal peut être séparé à l’aide d’un canal supplémentaire qui a une longueur d’onde plus longue que le filtre APC, cependant. - Inclure un filtre qui a un BP de 780/60 (750-810 nm gamme), comme la phycoerythrine la plus couramment utilisée, filtre à cyanine (APC-Cy7), qui détecte l’émission d’autofluorescence rouge lointain de Symbiodiniaceae et les aides dans l’isolement des cellules aposymbiotiques.
5. Configuration de gating FACS
REMARQUE : Les étapes peuvent varier selon la fonte et le modèle du cytomètre et du programme d’acquisition couplés au cytomètre.
- Sur l’écran expérimental du projet du logiciel de cytométrie, créez une parcelle de diffusion et sélectionnez la dispersion vers l’avant (FCS) comme mesure pour l’axe X et la dispersion latérale (SSC) pour l’axe Y.
REMARQUE : FCS est en corrélation avec la taille de la cellule et SSC est en corrélation avec la granularité. Cela permettra l’enlèvement de la plupart des débris, car la plupart seront de plus petite taille que les cellules intactes. - Réglez les axes à des échelles logarithémiques ou biexponentielles, car la taille des cellules et la granularité peuvent varier de plusieurs ordres de grandeur(figure 3A), en particulier chez les coraux.
6. Analyse du FACS et isolement cellulaire
REMARQUE : Les étapes peuvent varier selon la fonte et le modèle du cytomètre et du programme d’acquisition couplé.
- Placez le contrôle (c.-à-d. le sous-ensemble cellulaire non souillé) dans la chambre d’échantillon du cytomètre et commencez le processus de lecture. Lorsque l’ordinateur commence à recevoir des données de chaque cellule, ou événement, les points commencent à apparaître sur l’intrigue de diffusion. Pour dégager les débris laissés dans les chambres cytomètres des expériences précédentes, laissez passer environ 30 s avant de commencer l’analyse.
- Dans l’intrigue de dispersion, ajustez la tension du tube photomultiplier (PMT) afin de centrer les points.
REMARQUE : La tension pmT est utilisée pour amplifier la force du signal des photons mesurés ; si la tension pmT est trop faible, moins de cellules seront lues, et si la tension pmT est trop forte, les cellules seront mesurées près de la valeur maximale et différents types de cellules seront indiscernables les uns des autres. Une tension HT adéquate garantit que des événements indépendamment reconnaissables peupleront la parcelle de dispersion. La séparation des événements est plus facile à visualiser en projetant des échelles logarithémiques ou biexponentielles sur les parcelles de dispersion FSC et SSC. - Commencez à enregistrer les événements. Pour conserver l’échantillon, faites une pause dans l’acquisition de données après qu’environ 15 000 événements aient été lus. Dans la plupart des cas, cela sera suffisant pour visualiser les modèles globaux de population cellulaire. Enregistrez plus d’événements si vous analysez et isolent de petites populations de cellules spécialisées.
- Sur le premier graphique de FSC et SSC, créez une sélection, ou porte, des cellules autour de la marque10 2 et plus haut sur l’axe X du FSC. Tout ce qui est inférieur à ce seuil est probablement des débris cellulaires. Dessinez des barrières rectangulaires, qui est une option régulière sur les programmes logiciels de cytométrie d’écoulement et bon pour des populations cellulaires claires et distinctes. Pour les populations cellulaires qui prennent une forme plus irrégulière sur les parcelles de dispersion, utilisez une option de gating polygonal.
REMARQUE : Un seuil minimum de 102 sur la dispersion vers l’avant devrait sélectionner pour les plus petites cellules coralliennes, mais peut permettre la contamination des débris. Pour modifier cela, augmenter la limite inférieure du gating pour être plus conservateur. - Créez une nouvelle parcelle de diffusion exprimant le filtre DAPI sur l’axe X et le filtre APC-Cy7 sur l’axe Y. Pour ce faire, sélectionnez la porte pour les cellules intactes créées dans l’étape 6.4, clic droit, et sélectionnez l’option pour créer une nouvelle parcelle de diffusion. Ajuster les axes à des échelles logarithémiques ou biexponentielles.
REMARQUE : Les étapes nécessaires pour créer une nouvelle parcelle peuvent varier selon les différents logiciels. - Maintenant, retirez l’échantillon de contrôle de la chambre cytomètre et remplacez-le par les cellules tachées. Laissez passer 30 s avant de commencer l’analyse et d’enregistrer les données. Enregistrez environ 15 000 cellules avant de s’arrêter.
REMARQUE : La population distincte (s) sur l’extrémité supérieure de l’échelle APC-Cy7 sont ceux avec l’autofluorescence rouge élevée de Symbiodiniaceae. Aucune tache n’est nécessaire pour visualiser ces ruptures de population, et elles peuvent également être consultées sur l’enregistrement de l’échantillon témoin(figure 3C). Sélectionnez pour les populations de corail seulement, ceux qui sont plus bas sur l’axe Y, pour une plus grande différenciation. - Créez une nouvelle parcelle de diffusion des cellules aposymbiotiques pour visualiser les concentrations de ROS (filtre FITC) et les cellules positives aux lysosomes (filtre APC), utilisant à nouveau des échelles logarithémiques ou biexponentielles.
REMARQUE : S’il y a plusieurs populations cellulaires distinctes qui sont aposymbiotiques, chacune peut être plus distinguée dans sa propre parcelle de dispersion(figure 3C,D). - Comparez le groupe d’échantillons tachés au contrôle, sous-ensemble non souillé en utilisant le premier enregistrement de l’échantillon témoin ou en réintroduisant et en réintérant le groupe témoin. Portez les événements qui sont uniques au groupe d’échantillons tachés.
7. Tri et collecte facS
REMARQUE : Les étapes peuvent varier selon la fonte et le modèle du cytomètre et du programme d’acquisition couplés au cytomètre.
- Avec une sélection de cellules choisies pour recueillir, placez des tubes de microcentrifuge (contenant 250 à 500 l de milieu de culture cellulaire ou tampon de lyse en fonction du nombre de cellules collectées et de la méthode de stockage) dans la chambre de collecte du cytomètre.
REMARQUE : Le cytomètre de débit représenté est capable de trier quatre populations différentes à la fois, et la machine peut être configurée pour contenir une variété d’appareils de collecte, y compris divers tubes de centrifugeuse et 96 plaques de puits. - Une fois que le cytomètre commence à lire l’échantillon et qu’une quantité appropriée de temps s’est écoulée pour éliminer les débris, commencez à trier les populations désirées et collectez entre 20 000 cellules et plusieurs millions.
- Pour plus de 500 000 cellules, ajustez le volume des supports de culture cellulaire ou du tampon de lyse, et le volume du dispositif de collecte.
- Pour les études in vitro, entreposez les cellules sur la glace jusqu’à ce qu’elles soient placées dans un incubateur ou dans un environnement stérilisé.
- Pour les études moléculaires, soit commencez immédiatement le processus d’isolement de l’ADN/ARN/protéine, soit congelez le flash et entreposez-les à -80 oC jusqu’à l’extraction.
- Chaque fois qu’une nouvelle tache, une espèce ou un trieur est utilisé, effectuez un contrôle de pureté sur la population d’intérêt en triant au moins 20 000 cellules d’intérêt en 500 l de support de coloration, puis en ré analysant les cellules triées et en confirmant que les cellules sont lues à l’intérieur de la porte utilisée pour trier initialement(figure 4).
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Representative Results
Dans l’ensemble, ce protocole est utile parce qu’il facilite l’identification et la collecte des populations vivantes de cellules coralliennes qui peuvent être utilisées pour des analyses fonctionnelles. Le flux de travail a commencé avec la séparation mécanique des tissus coralliens du squelette sous-jacent de carbonate de calcium(figure 1). Il s’agit de l’une des étapes initiales les plus importantes parce que la technique incorrecte entraîne une mortalité cellulaire élevée et peut créer de grandes quantités de débris. La séparation enzymatique n’est pas conseillée parce qu’elle peut entraîner une augmentation du cisaillement des tissus et une mortalité cellulaire élevée. La séparation mécanique à l’aide d’un aérographe réduit ces défis(figure 2),réduisant la mortalité cellulaire moyenne à 10 % (données non indiquées). Après la séparation mécanique aérographe-négociée des tissus du squelette, la boue résultante a été filtrée à une suspension de cellule par filtration par une passoire cellulaire. La suspension de cellules a ensuite été tachée d’ADN (DAPI), DE ROS et de marqueurs lysosome et lue par le cytomètre FACS. Une stratégie de gating a ensuite été développée pour isoler des populations cellulaires spécifiques basées sur les marqueurs cellulaires utilisés. Les populations de cellules fermées ont ensuite été triées en tubes de collecte(figure 1).
Lors de l’analyse d’échantillons sur le cytomètre FACS, plusieurs mesures ont été prises afin d’enlever les débris et les cellules mortes de l’échantillon. Les cellules symbiodiniaceae pourraient être enlevées sélectivement si désirées en raison de leur autofluorescence. Tout d’abord, les débris et autres particules noncellulaires qui ne partageaient pas la même forme ou la même granularité que les cellules coralliennes ont été retirés des analyses en créant une sélection de gating sur la diffusion vers l’avant (taille) et latérale (granularité)(figure 3A). Ensuite, les cellules mortes ont été exclues en comparant la suspension non contaminée des cellules de contrôle par rapport à l’échantillon taché par daPI et au canal rouge lointain, puis en éliminant les cellules positives pour une coloration de DAPI élevée dans l’échantillon taché(figure 3B, population cellulaire P6). En parallèle, les cellules hébergeant des Symbiodiniaceae autofluorescentes ont été enlevées en gating contre des cellules avec un signal élevé dans le canal rouge lointain(figure 3B, APC-Cy7). Après ce processus de gating itératif, les cellules restantes pour des analyses représentent les populations intactes de cellules coralliennes vivantes dépourvues de Symbiodiniaceae.
Ces cellules pourraient alors être classées dans différentes sous-populations cellulaires en comparant le contrôle et les échantillons tachés en ajoutant des taches exogènes pour des caractéristiques telles que l’activité ROS et/ou le contenu lysosome(figure 3C). Par exemple, l’examen des données sur les filtres à coloration ROS et lysosome a révélé quatre sous-populations distinctes de cellules coralliennes. Une population cellulaire avait un signal relativement faible pour la teneur lysosomale (filtre APC) et les trois autres avaient un signal élevé dans la teneur lysosomale et une gamme d’activité ROS (filtre FITC) (figure 3C). Chacune de ces sous-populations peut être triée individuellement pour analyse en aval, ou analysée et analysée en sous-populations plus discrètes par l’intersection de la taille, de la granularité, de l’autofluorescence et/ou de la teneur en ADN. Dans cette étude, l’ADN, l’activité ros et la teneur lysosomale ont été utilisés pour identifier de larges caractéristiques des cellules coralliennes. Fait important, ce protocole général peut être adapté à une gamme de marqueurs fluorescents ainsi qu’à des sondes spécifiques d’anticorps qui peuvent être utilisées en conjonction pour l’isolement des populations cellulaires spécialisées d’intérêt telles que les cellules souches.
Figure 1 : Le flux de travail général du processus de tri des cellules coralliennes. Le protocole en vedette permet l’élimination des cellules coralliennes du squelette pour la coloration, qui sont ensuite exécutées à travers le cytomètre FACS, mesurées, analysées et isolées dans les populations cellulaires. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Enlèvement des tissus et des cellules du squelette corallien. Le compresseur d’air (A) force l’air et les médias de coloration cellulaire (F) hors de l’aérographe (E) et travaille à faire sauter le tissu du squelette de corail (C) et crée une boue cellulaire dans le sac (D). La pression maximale de l’air est contrôlée par la jauge de pression (B) sur le compresseur d’air (A). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Sélection de cellules coralliennes vivantes. (A) Les cellules vivantes ont été isolées des débris à l’aide d’une valeur minimale de diffusion vers l’avant de 102. (B) Le filtre APC-Cy7 a été utilisé pour identifier l’autofluorescence rouge, séparant efficacement les cellules hébergées en symbiote, tandis que DAPI a été utilisé pour identifier les cellules très positives pour la coloration de l’ADN. Ceux très positifs pour DAPI étaient indicatifs des cellules mortes et mourantes. (C,D) Des marqueurs supplémentaires pour l’activité ROS et le contenu lysosome ont été utilisés pour différencier davantage différentes populations de cellules coralliennes. Toutes les données ont ensuite été réanalysées sur FlowJo (v10) pour générer ces graphiques. L’étiquette de population insérée et le pourcentage correspond aux photos microscopiques prises de chaque population triée (E). Les pourcentages indiqués dans chaque parcelle sont des cellules totales dans cette parcelle. Barre à l’échelle inférieure à droite 20 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Vérification de pureté des cellules autofluorescentes de Symbiodiniaceae-associées. (A) Les cellules positives pour la fluorescence sur le filtre APC-Cy7 de l’échantillon de contrôle non souillé ont été triées. (B) Ce groupe trié de cellules a ensuite été rediffusé sur le cytomètre et réanalysé dans les mêmes conditions, montrant 94% de pureté. La dispersion vers l’avant (axe X, FSC) a été utilisée pour l’axe d’ancrage, mais est interchangeable avec l’un des autres paramètres. Le même processus peut être effectué sur des échantillons tachés. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Ce protocole a été adapté de Rosental et coll.18 et développé pour l’identification et l’isolement des cellules de P. damicornis. La méthodologie se concentre sur le processus de filtrage des échantillons pour enlever les débris, les cellules non viables, et les cellules hébergées par Symbiodiniaceae par l’examen de facteurs intrinsèques cellulaires, y compris la taille relative des cellules, la granularité des cellules relatives, l’autofluorescence cellulaire, et la présence de membranes cellulaires intactes. Ces techniques peuvent être appliquées à d’autres espèces de coraux. Cependant, les stratégies de gating de FACS peuvent varier en raison des différences spécifiques aux espèces dans les caractéristiques de la population cellulaire.
L’utilité du FACS pour comprendre la santé des coraux réside dans sa capacité à utiliser divers facteurs intrinsèques cellulaires pour identifier et isoler les cellules de façon différentielle. En outre, ce protocole décrit l’utilisation supplémentaire de la coloration cellulaire exogène pour différencier les cellules coralliennes basées sur la viabilité, la concentration réactive d’espèces d’oxygène, et la teneur en lysosome. Sur les plus de 30 marqueurs commerciaux qui ont été testés auparavant dans Rosental et coll.18, 24 cellules P. damicornis étiquetées, dont 16 ont produit un signal différentiel, des grappes de différenciation qui permettraient la sélection des sous-populations cellulaires.
Une des étapes critiques de ce protocole est l’ablation et le filtrage appropriés des tissus pour s’assurer que les amas de tissus sont dissociés et ne bloquent pas le flux laminaire du cytomètre de flux. Un ajustement approprié de la tension PMT est crucial pour la détection et l’analyse précises des événements indépendants de détection cellulaire. Par rapport aux travaux antérieurs18, le processus d’isolement des cellules coralliennes du squelette sous-jacent par l’intermédiaire de perturbations mécaniques des aérographes améliore considérablement les méthodes traditionnelles de grattage en réduisant les débris et en maximisant la viabilité cellulaire (90 %, figure 2 et figure 3A),améliorant ainsi les analyses ultérieures en réduisant les faux positifs dus au bruit.
La méthodologie décrite dans cet article facilite la séparation des populations de cellules coralliennes par une sélection différentielle sur une intersection des caractéristiques morphologiques et fonctionnelles à un niveau qui n’était pas possible auparavant. Avec le développement de méthodologies FACS pour les cellules coralliennes, il est maintenant possible de sélectionner des sous-populations cellulaires spécifiques pour la création de cultures cellulaires définies, ainsi que pour sonder les profils transcriptomiques et épigénétiques associés à des sous-populations cellulaires spécifiques. L’application de ces informations à l’échelle fine fournira un aperçu du type de cellule, du comportement et de la fonction, et peut révéler des caractéristiques associées à l’évolution des types de cellules spécifiques aux cnidaires tels que les calicoblastes et les cnidocytes. En outre, l’application de la technologie FACS au développement d’essais de stress améliorés et de biomarqueurs peut s’avérer utile pour la protection des récifs coralliens gravement menacés.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
NTK tient à remercier l’Université de Miami Research Awards en sciences naturelles et en génie pour le financement de cette recherche. BR tient à remercier Alex et Ann Lauterbach d’avoir financé le Laboratoire d’immunologie comparative et évolutive. Les travaux de BR ont été soutenus par les numéros de la Fondation scientifique israélienne (FSI) : 1416/19 et 2841/19, et HFSP Research Grant, RGY0085/2019. Nous tenons à remercier Zhanna Kozhekbaeva et Mike Connelly pour leur assistance technique. Nous tenons également à remercier l’Université de Miami, Miller School of Medicine’s Flow Cytometry Shared Resource au Sylvester Comprehensive Cancer Center pour l’accès au cytomètre FACS et à Shannon Saigh pour le soutien technique.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Airbrush Kit & Compressor | TCP Global | ABD KIT-H-SET | Paasche H Series Single-Action Siphon Feed Airbrush Kit with Master TC-20 Compressor & Air Hose |
| BD FACSAria II | BD | 644832 | |
| Bone Cutters | Bulk Reef Supply | 205357 | Oceans Wonders Coral Stony Bone Cutter |
| Cell Strainer | Corning | 352340 | 40 um; BD Falcon; individually wrapped; sterile; nylon |
| CellRox Green | Life Technologies | C10444 | 2.5 mM in DMSO; Excitation/Emission: 485/520 nm |
| Collection bag | Grainger | 38UV35 | Reloc Zippit 6"L x 4"W Standard Reclosable Poly Bag with Zip Seal Closure, Clear; 2 mil Thickness |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | 10mg in H2O; Excitation/Emission: 358/461 nm |
| Fetal Calf Serum | Sigma-Aldrich | F2442-100ML | Heat-inactivated at 57 °C for 30 minutes |
| Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line Hemacytometer |
| HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| LysoTracker Deep Red | Life Technologies | L12492 | 1mM in DMSO; Absorption/Emission: 647/668 nm |
| Microcentrifuge tubes | VWR | 87003-294 | 1.7 mL |
| Phophate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 70011-044 | pH 7.4; 10X |
| Round-bottom tubes | VWR | 352063 | 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube |
| Syringe | BD | 309628 | 1 mL BD Luer-Lok Syringe sterile, singe use polycarbonate |
References
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