Les coraux créent des écosystèmes de biodiversèses importants pour les humains et les organismes marins. Cependant, nous ne comprenons toujours pas le plein potentiel et la fonction de nombreuses cellules coralliennes. Ici, nous présentons un protocole développé pour l’isolement, l’étiquetage et la séparation des populations de cellules coralliennes pierreuses.
Les récifs coralliens sont menacés en raison de facteurs de stress anthropiques. La réponse biologique du corail à ces facteurs de stress peut se produire au niveau cellulaire, mais les mécanismes ne sont pas bien compris. Pour étudier la réponse des coraux aux facteurs de stress, nous avons besoin d’outils pour analyser les réponses cellulaires. En particulier, nous avons besoin d’outils qui facilitent l’application d’essais fonctionnels pour mieux comprendre comment les populations cellulaires réagissent au stress. Dans la présente étude, nous utilisons le tri cellulaire activé par la fluorescence (FACS) pour isoler et séparer différentes populations cellulaires dans les coraux pierreux. Ce protocole comprend : (1) la séparation des tissus coralliens du squelette, (2) la création d’une suspension à cellule unique, (3) l’étiquetage des cellules coralliennes à l’aide de divers marqueurs pour la cytométrie des débits, et (4) les stratégies de gating et de tri cellulaire. Cette méthode permettra aux chercheurs de travailler sur les coraux au niveau cellulaire pour l’analyse, les essais fonctionnels et les études d’expression génique de différentes populations cellulaires.
Les récifs coralliens sont l’un des écosystèmes les plus importants sur Terre. Ils facilitent la biodiversité en fournissant des habitats essentiels pour les poissons et les invertébrés et sont essentiels pour soutenir les communautés anthropiques en fournissant des moyens de subsistance alimentaires et économiques grâce au tourisme1. En tant que principal constructeur de récifs coralliens, l’animal corallien (Phylum: Cnidaria) aide également les communautés côtières en créant de grands cadres de carbonate de calcium qui atténuent les dommages causés par les vagues et les tempêtes2.
Les coraux à l’âge adulte sont des animaux sessiles qui accueillent un large éventail de partenaires endosymbiotiques, y compris les virus, l’archaea, les bactéries, les protistes, les champignons, et plus particulièrement, les membres de la famille algale dinoflage Symbiodiniaceae3. Les changements dans l’environnement peuvent causer des déséquilibres dans cette communauté, entraînant souvent des épidémies et le blanchiment des coraux dans lesquels les Symbiodiniaceae symbiotiques sont expulsés de la colonie de corail, éliminant ainsi la principale source de nutrition pour le corail. Ces deux scénarios causent souvent la mort de l’hôte corallien4,5,6. Les effets des facteurs de stress induits par l’anththénie, tels que le changement climatique rapide, accélèrent les décès massifs de coraux, ce qui entraîne un déclin mondial des récifs coralliens7.
Récemment, de nombreuses méthodes différentes ont été développées pour aider à atténuer la perte de récifs coralliens. Ces méthodes comprennent l’aménagement de coraux sur les récifs existants, la traversée génétique à l’aide de génotypes tolérants thermiquement, et la manipulation cellulaire des communautés microbiennes et symbiotiques hébergées dans le corail8,9. Malgré ces efforts, beaucoup reste inconnu sur la diversité des cellules coralliennes et la fonction cellulaire10,11,12,13. Une compréhension approfondie de la diversité de type de cellules coralliennes et de la fonction cellulaire est nécessaire pour comprendre comment l’organisme corallien se comporte dans des conditions normatives et stressantes. Les efforts visant à maximiser l’efficacité de la restauration et de la préservation bénéficieront d’une meilleure compréhension de la façon dont la diversité cellulaire et le fonctionnement des gènes sont couplés.
Les travaux antérieurs sur la diversité et la fonction cellulaires ont principalement porté sur les études histologiques et l’échantillonnage de l’ARN de tissu entier14,15,16,17. Pour obtenir plus de détails sur la fonction spécifique de type cellulaire dans les coraux, il doit y avoir des méthodes pour l’isolement de populations spécifiques de cellules coralliennes vivantes. Ceci a été fait avec succès dans les organismes modèles non classiques au moyen de la technologie de cytométrie de débit activée par fluorescence (FACS)18. FACS utilise une combinaison de lasers réglés à différentes longueurs d’onde pour mesurer différentes propriétés cellulaires endogènes au niveau de la cellule unique comme la taille relative des cellules, la granularité cellulaire et l’autofluorescence. En outre, les cellules peuvent être marquées par des composés étiquetés fluorescents pour mesurer les propriétés spécifiques et souhaitées18,19.
Jusqu’à présent, l’application de la cytométrie des débits aux cellules coralliennes a été principalement pour l’analyse de Symbiodiniaceae symbiotique et d’autres populations bactériennes en utilisant leur forte, autofluorescence naturelle20,21,22. FACS a également été utilisé pour estimer la taille du génome corallien en utilisant le signal fluorescent marqueur d’ADN par rapport aux cellules d’organisme modèle de référence23,24. L’application efficace du FACS fournit trois outils distincts qui sont utiles pour les études de biologie cellulaire : 1) la description morphologique et fonctionnelle des cellules simples ; 2) l’identification, la séparation et l’isolement de populations cellulaires spécifiques pour des études en aval; et 3) l’analyse des tests fonctionnels au niveau de la cellule unique.
Le développement et l’application de divers marqueurs fluorescents exogènes pour l’étude des cellules coralliennes restent presque inexplorés. Ces marqueurs peuvent inclure des protéines étiquetées, des substrats marqués pour les enzymes ou des réponses fluorescentes à d’autres composés. Ces marqueurs peuvent être utilisés pour identifier les types de cellules qui ont des propriétés uniques, telles que la mise en évidence des cellules qui produisent des quantités variables d’une fonction spécifique compartiment cellulaire, comme les lysosomes. Un autre exemple est l’utilisation de perles étiquetées fluorescentes pour identifier fonctionnellement les cellules compétentes pour la phagocytose, ou l’engloutissement d’un agent pathogène ciblé25. Les populations de cellules actives dans les réponses immunitaires peuvent être facilement identifiées par FACS après l’engloutissement de ces perles exogènement appliquées. Tandis que les méthodes histologiques traditionnelles exigent le tissu préservé et beaucoup d’heures pour approximativer le pourcentage de cellules positives pour l’engloutissement de perle, un essai fonctionnel de FACS pour l’engloutissement d’agent pathogène peut être exécuté relativement rapidement sur des cellules vivantes isolées. En plus d’étudier les réponses spécifiques aux cellules au stress, cette technologie a le potentiel de clarifier l’expression spécifique aux gènes et d’éclairer l’histoire évolutive et développementale des types cellulaires entièrement uniques aux cnidarians, tels que les calicoblastes et les cnidocytes.
Récemment, nous avons effectué un dépistage intensif de plus de 30 marqueurs cellulaires qui ont abouti à l’identification de 24 qui sont capables d’étiqueter les cellules coralliennes, dont 16 sont utiles pour distinguer les populations uniques18, ce qui en fait des grappes de différenciation (CD). Ici, nous décrivons le processus d’isolement des cellules coralliennes dans pocillopora damicornis de l’enlèvement des cellules du squelette de carbonate de calcium à l’identification et l’isolement de populations cellulaires spécifiques avec FACS (figure 1).
Ce protocole a été adapté de Rosental et coll.18 et développé pour l’identification et l’isolement des cellules de P. damicornis. La méthodologie se concentre sur le processus de filtrage des échantillons pour enlever les débris, les cellules non viables, et les cellules hébergées par Symbiodiniaceae par l’examen de facteurs intrinsèques cellulaires, y compris la taille relative des cellules, la granularité des cellules relatives, l’autofluorescence cellulaire, et la p…
The authors have nothing to disclose.
NTK tient à remercier l’Université de Miami Research Awards en sciences naturelles et en génie pour le financement de cette recherche. BR tient à remercier Alex et Ann Lauterbach d’avoir financé le Laboratoire d’immunologie comparative et évolutive. Les travaux de BR ont été soutenus par les numéros de la Fondation scientifique israélienne (FSI) : 1416/19 et 2841/19, et HFSP Research Grant, RGY0085/2019. Nous tenons à remercier Zhanna Kozhekbaeva et Mike Connelly pour leur assistance technique. Nous tenons également à remercier l’Université de Miami, Miller School of Medicine’s Flow Cytometry Shared Resource au Sylvester Comprehensive Cancer Center pour l’accès au cytomètre FACS et à Shannon Saigh pour le soutien technique.
Airbrush Kit & Compressor | TCP Global | ABD KIT-H-SET | Paasche H Series Single-Action Siphon Feed Airbrush Kit with Master TC-20 Compressor & Air Hose |
BD FACSAria II | BD | 644832 | |
Bone Cutters | Bulk Reef Supply | 205357 | Oceans Wonders Coral Stony Bone Cutter |
Cell Strainer | Corning | 352340 | 40 um; BD Falcon; individually wrapped; sterile; nylon |
CellRox Green | Life Technologies | C10444 | 2.5 mM in DMSO; Excitation/Emission: 485/520 nm |
Collection bag | Grainger | 38UV35 | Reloc Zippit 6"L x 4"W Standard Reclosable Poly Bag with Zip Seal Closure, Clear; 2 mil Thickness |
DAPI | Invitrogen | D1306 | 10mg in H2O; Excitation/Emission: 358/461 nm |
Fetal Calf Serum | Sigma-Aldrich | F2442-100ML | Heat-inactivated at 57 °C for 30 minutes |
Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line Hemacytometer |
HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | H0887 | |
LysoTracker Deep Red | Life Technologies | L12492 | 1mM in DMSO; Absorption/Emission: 647/668 nm |
Microcentrifuge tubes | VWR | 87003-294 | 1.7 mL |
Phophate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 70011-044 | pH 7.4; 10X |
Round-bottom tubes | VWR | 352063 | 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube |
Syringe | BD | 309628 | 1 mL BD Luer-Lok Syringe sterile, singe use polycarbonate |