Summary
Bu protokol, fare embriyosu taze dondurulmuş bölümlerinden kıkırdak ve kemik izolasyonu için lazer yakalama mikrodizeksiyon açıklar. Kıkırdak ve kemik hızla cresyl menekşe boyama ile görselleştirilmiş ve transkripsiyonanalizi için yüksek kaliteli RNA verim hassas toplanabilir.
Abstract
Lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) heterojen dokulardan belirli hücre tipleri veya ilgi bölgeleri izole etmek için güçlü bir araçtır. İskelet elemanlarının hücresel ve moleküler karmaşıklığı gelişme ile birlikte artar. Doku heterojenliği, birbirleriyle veya çevre dokularla kıkırdak ve kemik gelişen çalışma için bir engel dir. Protokolümüz, gen ekspresyonu analizi için yüksek kaliteli RNA sağlayan kıkırdak ve kemiğin doku işleme ve izolasyonhızlı bir yöntem sağlar. Fare embriyolarının taze dondurulmuş dokuları kesitli ve kısa tere mor boyama çevreleyen dokulardan farklı renklerle kıkırdak ve kemik görselleştirmek için kullanılır. Slaytlar daha sonra hızla susuz, ve kıkırdak ve kemik lcm tarafından daha sonra izole edilir. Bu işlem sırasında sulu çözeltilere maruz kalmanın en aza inmesi RNA bütünlüğünü korur. Mouse Meckel'in E16.5'teki kıkırdağı ve mandibuler kemiği başarılı bir şekilde toplanmış ve gen ekspresyonu analiziosteoblastlar, osteositler, osteoklastlar ve kondrositler için marker genlerin diferansiyel ekspresyonu göstermiştir. Yüksek kaliteli RNA da dokular ve embriyonik çağlar bir dizi izole edildi. Bu protokol, kriyoksasyon, kesitleme, boyama ve taze dondurulmuş dokuların susuz kalması ve kıkırdak ve kemiğin LCM ile hassas izolasyonu gibi LCM için numune hazırlamasını ayrıntılarıyla belirterek transkripskopik analiz için yüksek kaliteli RNA sağlar.
Introduction
Kas-iskelet sistemi kas, bağ dokusu, tendon, bağ, kıkırdak ve kemik, sinirler tarafından innerve ve kan damarları tarafından vaskülarize oluşan çok bileşenli bir sistemdir1. İskelet dokuları artan hücresel heterojenlik ve yapısal karmaşıklık ile gelişir. Kıkırdak ve kemik aynı osteokondroprojenitor soydan gelişir ve son derece ilişkilidir. Embriyonik kıkırdak ve kemik kaslar, sinirler, kan damarları ve farklılaşmamış mezenkim ile birlikte gelişir. Kıkırdak da kemik ile çevrili olabilir, Meckel kıkırdak ve mandibuler kemik içinde kondize kıkırdak gibi. Bu dokular anatomik olarak ilişkilidir ve gelişim sırasında hücre dışı sinyaller aracılığıyla birbirleriyle etkileşime geçerler. Kıkırdak ve kemik gelişiminde gen ekspresyonunun incelenmesinde, birden fazla doku tipinden oluşan iskelet yapılarının heterojenliği bir engeldir. İlgi dokusunun hassas izolasyonu başarılı transkripsiyonel analiz için anahtardır.
Lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) heterojen dokular içinde hücre tipleri veya ilgi bölgeleri izole etmek için güçlü bir araçtır, ve tekrarlanabilir ve tek hücre seviyesine duyarlı2. Bu kesin hedef ve transkriptomik, genomik ve proteomik3,4downstream tahliller geniş bir yelpazede için ilgi hücreleri yakalamak . İzole RNA, DNA veya proteinin kalitesi biyoanalizör veya eşdeğer bir platform ile değerlendirilebilir. Örneğin, RNA kalitesi RNA bütünlük numarası (RIN)5ile gösterilir.
Burada, taze dondurulmuş dokulardan LCM tarafından kıkırdak ve kemik hızlı boyama ve izolasyon için bir protokol sağlar. Fare embriyosu kullanarak bu protokolün rna dizilemesi (RNA-seq) gibi sonraki transkripsiyonanalizi için yüksek kaliteli RNA verdiğini gösteriyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Farelerden elde edilen dokular, Ulusal Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Sağlık Enstitüleri Rehberi'ne uygun olarak elde edildi ve çalışma protokolleri Sina Dağı'ndaki Icahn Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı.
1. Taze Dondurulmuş Numunenin Hazırlanması
- Embriyoyu veya ilgi çekici dokuyu inceleyin. Numuneyi en iyi kesme sıcaklığı (OCT) bileşiğiyle tek kullanımlık gömme kalıbına gömün. Numunenin yönünü bir ucu veya iğneile ayarlayın.
- Numuneleri kuru buz/metil-2-bütan banyosunda hızla dondurun. Bir sonraki adıma devam edin veya -80 °C'de saklayın.
NOT: Protokol burada duraklatılmış olabilir.
2. Lazer Yakalama Mikrodisseksiiçin Kriyoding
- Kriyostat'ı çözün ve iç yüzeyleri %70 etanol ile temizleyin. Anti-roll plakasını ve bir çift forceps'ü RNase dekontaminasyon maddesi ile tedavi edin. Kriyostat'ı istenilen kesme sıcaklığına (-18 ila -22 °C) ayarlayın. Kriyosiksiyon sırasında kesitli numune slaytların geçici olarak saklanması için kuru buz üzerine alüminyum folyo bir levha yerleştirerek kuru buzlu kapaklı bir kap hazırlayın.
DİkKAT: Kuru buz son derece soğuktur. Kuru buzu her zaman özenle kullanın ve her kullanırken yalıtımlı eldiven ler giyin. - Taze dondurulmuş numuneyi kuru buz kovasına aktarın. Bir kriyostat numune tutucuüzerine OCT bileşik bir tabaka yerleştirin ve hemen nazik basınç ile OCT üstüne örnek yerleştirin. OCT tamamen dondurulduğunda, tutucuyu numuneyle birlikte kriyostat kesme koluna bağlayın.
- Kesme sıcaklığına dengelemek için numuneyi kriyostatta 15 dk bekletin.
- Dokuyu kesip 12 μm kalınlığında polietilen naftalat (PEN) membran slaytlarında dilimleri toplayın. Membran üzerinde ardışık bölümleri hizalayın. Bir slayt tamamlandıktan sonra, bölümlerin birkaç dakika kurumasını bekleyin ve gerekli tüm slaytlar toplanana kadar kaydırağı kuru buz kabındaki folyoya aktarın.
- Slaytları -80 °C'de bir slayt kutusunda saklayın.
NOT: Kesit kalınlığı, dokunun verimli kesilmesine izin verirken toplanan doku miktarını en üst düzeye çıkarmak için seçilir ve ilgi dokuya bağlı olarak değişebilir. Protokol burada duraklatılmış olabilir. Slaytları RNase kontaminasyonundan uzak tutun. Sıcaklık değişimlerinden kaçının. 6 aya kadar depolanan slaytlardan RNA'nın RNA'ları hala RNA'nın yüksek kalitesini gösterse de, slaytları mümkün olan en kısa sürede kullanmanızı öneririz.
3. Lazer Yakalama Mikrodisseksi için Örnek Hazırlama
- Boyama ve dehidratasyon için çözümler hazırlayın.
- Buz üzerinde üç 50 mL santrifüj tüpü her 45 mL% 80 etanol yerleştirin. Bunları #1, #2 ve #3 olarak etiketleyin. RNase/DNase içermeyen su ile etanol seyreltin.
- Buz üzerinde 50 mL santrifüj tüpüne 45 mL%95 etanol yerleştirin.
- Buz üzerinde 50 mL santrifüj tüpüne 45 mL %100 etanol yerleştirin.
- Oda sıcaklığında 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne 45 mL ksilen yerleştirin.
DİkKAT: Xylene bir duman başlık kullanılmalıdır.
- Bir PEN membran slaytını eldivenli bir ele dayayarak kısa bir süre eritin, sonra 45 mL'de %80 etanol (#1 ve #2) ile 30'şar s'yi iki kez yıkayın ve 50 mL santrifüj tüplerinde ajitasyon ile OKT'yi çıkarın.
NOT: Boyama dan önce OCT kaldırmak için önemlidir, ekim bölümleri gizleme boyama sırasında gevşetilmiş önlemek için. Forceps ajitasyon tarafından yıkanmış değil OCT kaldırılmasını kolaylaştırmak için kullanılabilir. - Alüminyum folyo bir levha üzerine slayt lay. Pipet 0.8 mL% 50 etanol üzerine slayt üzerine% 50 krem menekşe ve leke 30 s. 30 s için% 80 etanol (#3) 45 mL slayt yıkayın ve daha sonra 30 s için geçit ile 30 s ile 45 mL ile% 95 etanol, 100% etanol ve ksilen 50 mL slürfugege.
- Ksilen ve kuru bölümleri boşaltmak için 5 dakika boyunca hassas bir görev silecek üzerinde slaytlar standı.
NOT: Slaytlar LCM önce tamamen kurutulmalıdır.
4. Lazer Yakalama Mikrodisseksi
NOT: LCM yaparken pudrasız nitril eldiven takın.
- LCM mikroskobunu, lazeri ve bilgisayarı açın. Bilgisayarda oturum açın ve yazılımı başlatın. Lazeri başlatmak için anahtarı "Açık" konumuna çevirin. Yeşil ışık (Lazer) açıkken, lazeri etkinleştirmek için kırmızı düğmeye basın ve ardından ışık (Lazer) lazerkullanmaya hazır olduğunu belirten kırmızıya döner.
NOT: Lazer ısınmak için yaklaşık 10 dakika gerekir. - Toplama tüplerini ayarlayın.
- 0,5 mL polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) borunun kapağını kolektöre takın.
NOT: İstenilen PCR tüpleri (0,2 veya 0,5 mL) için eşleşen toplayıcıyı seçin. - Pipet 50 μL çıkarma tamponu (Malzeme Tablosundalistelenen RNA izolasyon kiti tarafından sağlanan) 0,5 mL toplama tüpünün kapağına.
- Toplama cihazını mikroskoba yerleştirin.
- Toplayıcı Aygıtı değiştir penceresinde, toplayıcıyı başvuru noktasına (RP) taşımak için Başvuru Noktasına Taşı düğmesini tıklatın. RP'yi net bir şekilde görüntülemek için odağı ayarlayın. RP'yi görünümün ortasına taşımak için okları tıklatın.
- 0,5 mL polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) borunun kapağını kolektöre takın.
- Numune slaytlarını yükleyin.
- Slayt tutucusunu düşürmek için araç çubuğundaki sol Boşalt düğmesini tıklatın.
- Doku bölümü aşağıya bakacak şekilde kaydırağı tutucuya yerleştirin.
NOT: Bu oryantasyon, yakalanan doku bölümlerinin yerçekimi ile toplama tüpünün kapağına düşmesini sağlar. - Tutucuyu tekrar sahneye yerleştirin.
- Lazer parametrelerini ayarlayın.
- Lazer menüsünün Denetim seçeneğini seçin veya Lazer simgesine tıklayın.
- Bu parametreleri istenilen şekilde ayarlayın: Güç,lazerin gücü; Diyafram, lazer genişliği; ve Hız, Draw ve Cut modunda kesme hızı.
NOT: Lazeri ilgi çekici bir alanda test edin. Daha yüksek güç veya daha büyük diyafram kesmek daha kolay hale getirir ama hücrelere daha fazla zarar verir. Verimli kesim ve doku minimum hasar elde etmek için güç, diyafram ve hız kombinasyonu ayarlayın. Örneğin, Güç = 40, Diyafram = 5 ve Hız = 7 12 μm kesitüzerinde kıkırdak doku için.
- İlgi çekici alanları seçin ve kesin.
- 5x hedefi ile başlayın ve ilgi alanları bulmak ve sonra en iyi ilgi alanı gösterir objektif (5x, 10x veya 40x) geçmek.
NOT: Cresyl menekşe boyama sonra, kıkırdaklar lekeli macenta ve mineralize dokular kahverengi veya siyah görünür, diğer dokulardan ayırt edilebilir. Görüntüler, Dosya menüsünden Görüntüyü Kaydet kullanılarak kaydedilebilir. - Toplayıcıdaki işareti tıklatarak toplama için tüpü (A, B, C, D) seçin.
- Taşı ve Kes veya Çiz ve Kes'iseçin. Taşı ve Kes modunda, örnek elle kesilir, fare veya dokunmatik ekran lı kalem kullanılarak şekilleri serbest el çizin. Draw and Cut modunda, şekiller sonraki kesim için fare veya dokunmatik ekranlı kalemle serbest olarak çizilebilir. Lazer kesimi başlatmak için Başlat Kes düğmesini tıklatın.
- Kesim tamamlandıktan sonra PEN membranlı hedef doku yerçekimi ile toplama tüpünün kapağına düşer. Gerekirse birden fazla ilgi alanını bir araya getirmek için 4,5'i tekrarlayın.
NOT: Doku eksik kesim nedeniyle toplama tüpünün kapağına düşmezse, kesiklerin tekrarlanması veya güç veya diyafram açıklığı nın artırılması gerekebilir. Mineralize kemik (kahverengi veya siyah) doğrudan lazer le kesilemez.
- 5x hedefi ile başlayın ve ilgi alanları bulmak ve sonra en iyi ilgi alanı gösterir objektif (5x, 10x veya 40x) geçmek.
- Kolektörü boşaltın ve PCR tüpünü dikkatlice kapatın. Mikrodissected dokuları kuru buza yerleştirin. Bir sonraki adıma devam edin veya -80 °C'de saklayın.
NOT: Protokol burada duraklatılmış olabilir. Bir sonraki örnek için 4,2 ile 4,6 arası tekrarlayın.
5. Mikrodissected Dokuların Lysis ve RNA İzolasyon
- Mikrodiskoplu dokuları oda sıcaklığında eritin. Santrifüj kısa bir süre ve 42 °C'de 30 dakika boyunca numuneleri kuluçkaya yatırın.
- Kuluçkadan sonra lysis tamponunu 0,5 mL PCR tüpe çevirin. Üreticinin talimatlarına uyarak Bir RNA izolasyon kiti (Malzeme Tablosunabakın) kullanarak DNa işlemi ve RNA ekstraksiyonu gerçekleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
E16.5'teki taze dondurulmuş fare dokularının koronal bölümleri, Meckel'in kıkırdağının (MC), aküler kıkırdağının ve mandibular kemiğinLCM ile izolasyon ve toplanmasını göstermek için kullanıldı. E16.5'teki fare embriyoları parçalandı ve OCT bileşiği ile kriyojenik kalıplara gömülmüştü. Kalıptaki numuneler kuru buz ve metil-2-bütan banyosunda hızla dondurularak -80 °C'de saklandı.
Kıkırdak ve kemik terosmor mor boyama göstermek için koronal düzlemde kriyokesit yapıldı ve mikroskop slaytlar üzerinde örnekler toplandı. Yukarıdaki protokole göre bölümler yıkanmış, lekelenmiş ve susuz kılmıştır (adım 3.2-3.4). Slaytlar hava kurutuldu ve kalıcı montaj ortamı ile monte edildi. İncelenen tüm kıkırdaklar lekeli macenta (MC, kondil kıkırdak, nazal septum kıkırdak, kostal kıkırdak, presfenoid kemiğin kıkırdak primordiyumu, radius ve ulna kıkırdak primordiyum) ve tüm mineralize dokular kahverengi veya siyah lekeli idi(Şekil 1A-E). Hem kıkırdak hem de kemik birden fazla anatomik noktada diğer dokulardan kolayca ayırt edildi.
LCM için, E16.5'teki embriyo kafaları PEN membran slaytlarında 12 μm kalınlığında koronal düzlemde kesitlenmiş ve slayt başına 6-8 ardışık kesit toplanarak -80 °C'de saklanmıştır. OCT kaldırıldı ve kesitler yukarıda açıklanan protokole göre cresyl menekşesi ile boyandı ve susuz kaldı (adım 3.2-3.4). MC, akdeler kıkırdak ve mandibuler kemik bölgeleri LCM ile seçilmiş ve izole edilmiştir(Şekil 2). Seçilen bölgeler toplama tüpünün kapağındaki lysis tamponuna düştü. Sıralama için yeterli RNA elde etmek için, mc 10 bölge, kondylar kıkırdak 10 bölge veya mandibular kemik 4 bölge her toplama tüpü içine, sırasıyla bir örnek olarak havuzlu.
RNA, üreticinin talimatları doğrultusunda bir RNA izolasyon kiti kullanılarak çıkarıldı. Total RNA biyoanalizör kullanılarak analiz edildi (Şekil 3A-B). Cresyl menekşe boyamanın RNA kalitesi üzerindeki etkisini test etmek için, krem menekşe ile boyanmış mandibular kemik örneklerinden ve lekelenmeden alınan örneklerden RNA'yı karşılaştırdık (mineralize doku lekelenmeden görünür, ancak cresyl menekşe boyama, kemiği çevreleyen dokulardan ayırmak için görünürlüğü artırır). Lekeli numuneler (n = 4) ile lekesiz numuneler (n = 4) arasında, bu protokoldeki hızlı cresyl menekşe boyamanın RNA kalitesi üzerinde önemsiz etkisi olduğunu gösteren (P = 0.858, iki kuyruklu Welch'in t-testi, Şekil 3C)arasında anlamlı bir fark gözlenmemiştir. Farklı gelişim evrelerinde çeşitli dokuların LCM'si için protokolümüzü kullandık ve RRI'ler yüksek RNA kalitesini gösteren ölçüldü (Şekil 3D). MC, kondizyler kıkırdak ve mandibuler kemikten ortalama RNA verimi 7.50 ± 1.45 ng, 12,55 ± 2,75 ng ve 33,02 ± 7,63 ng (Şekil 3E) ve verim/alan 19,73 ± 3,82 ng/mm2, 26,70 ± 5,84 ng/mm2ve 17,23 ± 3,98 ng/mm2, sırasıyla (Şekil 3F), dokular arasında anlamlı fark olmaksızın (MC karşı condy cartil, P = 0.383; akülü kıkırdak karşı mandibular kemik, P = 0.260; MC karşı mandibular kemik, P = 0.674).
Kütüphaneler daha önce6,7olarak açıklandığı gibi hazırlandı ve sıralandı. Temsili bir cDNA boyutu yaklaşık 500 bp(Şekil 4A) idi. RNA-seq verileri MultiQC8ile analiz edildi. 18 LCM örneğinden (MC1-6, Meckel'in kıkırdağı; C1-6, aklis kıkırdağı; M1-6, mandibular kemik). Okumalarda her temel pozisyondaki ortalama kalite değerleri FastQC tarafından oluşturuldu ve çok kaliteli çağrılar(Şekil 4B)oluşturuldu. Okuma hizalaması Picard (Şekil 4C) ile analiz edildi. Okumalar yüksek hizalanmış yüzdeleri gösterdi ve hizalanmış okumaların ortalama yüzdesi % 75 idi. Gen kapsamı Picard(Şekil 4D)ile analiz edildi ve bu da transkript boyunca 5''ten 3'e kadar iyi bir temsil olduğunu gösterdi.
Diferansiyel gen ekspresyonu analiziyapıldı 6,7. Mandibular kemik ile MC arasında anlamlı olarak farklı olarak ifade edilen 4.006 gen (P < 0.05) vardı(Şekil 5A). Osteoblastlara veya osteositlere özgü genler(Col1a19, Col1a210, Dkk111, Dmp112, Dstn13, Runx214, Sp715, ve Sparc16) mandibular kemikte MC'ye göre daha yüksek şekilde ifade edilirken, chondrocyte spesifik genler(Acan17, Col2a118, Cola , 191 Col9a220, Col9a321, Comp22, Lect123, ve Sox524) mc mandibular kemiğe göre daha yüksek ifade edildi ( Şekil5B ve Tablo 1). Buna ek olarak, Acp5 25, Csf1r26, Ctsk27, Itgb328ve Oscar29 gibi osteoslast belirteçleri de mc ile karşılaştırıldığında mandibular kemik daha yüksek ifade olarak tespit edildi(Şekil 5B ve Tablo 1), hedeflenen dokuların başarılı izolasyon gösteren.
Şekil 1: E16.5'te fare embriyonun koronal kesitlerinde kıkırdak ve kemiğin temsili teremor mor boyama. (A) Meckel kıkırdağı ve hemimandible. (B) Meckel kıkırdağı, kondizyler kıkırdak ve hemimandible. (C) Burun septumu ve maksilla. (D) Presfenoid kemik ve palatin kemiğin kıkırdak primordium. (E) Yarıçapıkık primordium, ulna kıkırdak primordium, ve costal kıkırdak. C = aklis kıkırdağı; CC = kostal kıkırdak; CP = presfenoid kemiğin kıkırdak primordium; M = hemimandible; MC = Meckel kıkırdağı; MX = maksilla; NS = nazal septum; PL = palatin kemik; Yarıçapın R = kıkırdak primordium; U = ulna kıkırdak primordium. Ölçek çubuğu = 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Temsili bölgeler LCM tarafından izole edilmiş ve RNA-seq için toplanmıştır. (A–C) Temsili lekeli MC(A),akülü kıkırdak (B), ve mc ile hemimandibl zaten izole (C) LCM önce kriyosite. (D–F) Hedeflenen dokular dan sonra A, B ve C bölgeleri LCM tarafından izole edildi. Ölçek çubuğu = 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: RNA kalitesi ve LCM numune miktarı. (A–B) Temsili elektropherogram (A) ve ilişkili jel görüntü (B) bir mandibuler kemik örneği için bir biyoanalizör. (C) Cresyl menekşesi (n = 4) veya lekesiz (n = 4) ile boyanmış mandibuler kemik örneklerinden toplam RNA rRI'leri. (D) LCM tarafından izole edilen farklı dokulardan toplam RNA rRI'leri. Meckel'in E16.5 kıkırdağı (n = 6); E16.5'te akdeler kıkırdak (n = 6); E16.5'te mandibüler kemik (n = 6); E14.5'te nazal septum kıkırdağı (n = 6); Beyin E14.5 (n = 6); Beyin E16.5 (n = 7); Beyin E18.5 (n = 4). (E) Üç dokudan toplam RNA verimi. Her MC veya condylar kıkırdak örneği 10 mikrodiskoplu kıkırdak bölgesinden oluşan bir havuzdu ve mandibuler kemiğin her örneği 4 mikrodiskoplu hemimandiyal bölgeden oluşan bir havuzdu. (F) Her dokudaki birim alan başına verim (ng/mm2). Veriler ortalama ± s.e.m. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: LCM örneklerinden oluşturulan kütüphanelerin ve RNA-seq verilerinin kalitesi. (A) Bir biyoanalizör tarafından belirlenen mandibular kemik örneğinden kütüphanenin temsili cDNA boyutları. (B–D) 18 LCM numunesinden (MC1-6, Meckel kıkırdağı; C1-6, aklis kıkırdağı; M1-6, mandibular kemik) MultiQC ile. (B) Okumalarda her temel konumdaki ortalama kalite değerleri FastQC tarafından oluşturulmuştur. Grafiğin arka planı y eksenini çok kaliteli çağrılara (yeşil), makul kalitede (turuncu) çağrılara ve düşük kalite (kırmızı) çağrılarına böler. (C) Okumaların hizalanması Picard tarafından analiz edildi. Özet, hizalanmış okumayüzdeleri olarak gösterilir. (D) Picard ile analiz edilen normalleştirilmiş gen kapsamı. Çizim, transkript boyunca 5' uçtan (solda) 3' sonuna (sağda) göreceli ortalama kapsamı gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Mandibular kemik ve MC'den Gelen RNA-seq verilerinin Diferansiyel ekspresyon analizi LCM ile izole edilmiştir. (A) 4.006 genin hiyerarşik kümeleme önemli ölçüde farklı ifade (P < 0.05) mandibuler kemik ve MC arasında. Her doku için üç biyolojik kopya kullanıldı. M1-3, mandibular kemik; MC1-3, MC. (B) Mandibular kemik ve MC arasında farklı olarak ifade edilen genlerin kıvrım değişimlerini ve P değerlerini gösteren volkan çizimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Gen | Hücre tipi | log2FoldChange | Ortalama İfade | Ayarlanmış P Değeri |
| Col1a1 | Osteoblast/Osteosit | 2.64 | 12.94 | 2.22E-05 arası |
| Col1a2 | Osteoblast/Osteosit | 3.41 | 12.87 | 8.27E-07 arası |
| Dkk1 | Osteoblast/Osteosit | 7.59 | 2.01 | 5.21E-03 arası |
| Dmp1 | Osteoblast/Osteosit | 9.73 | 3.42 | 3.19E-04 arası |
| Dstn | Osteoblast/Osteosit | 2.51 | 6.87 | 5.73E-07 arası |
| Runx2 | Osteoblast/Osteosit | 1.24 | 8.62 | 4.08E-02 arası |
| Sp7 | Osteoblast/Osteosit | 2.24 | 6.95 | 5.81E-03 arası |
| Sparc | Osteoblast/Osteosit | 3.40 | 12.26 | 5.56E-09 arası |
| Acp5 | Osteoklast | 3.38 | 5.74 | 6.46E-06 arası |
| Csf1r | Osteoklast | 2.01 | 5.80 | 1.17E-04 arası |
| Ctsk | Osteoklast | 3.19 | 7.56 | 5.73E-07 arası |
| Itgb3 | Osteoklast | 2.88 | 5.37 | 2.43E-04 arası |
| Oscar | Osteoklast | 3.41 | 2.67 | 1.63E-04 arası |
| Akdoğan | Kondrosit | -5.23 | 5.01 | 2.76E-04 arası |
| Col2a1 | Kondrosit | -3.61 | 9.47 | 3.29E-03 arası |
| Col9a1 | Kondrosit | -7.01 | 3.58 | 5.51E-03 arası |
| Col9a2 | Kondrosit | -5.40 | 3.76 | 2.60E-03 arası |
| Col9a3 | Kondrosit | -6.63 | 3.80 | 2.90E-02 arası |
| Comp | Kondrosit | -5.86 | 1.54 | 7.51E-03 arası |
| Lect1 | Kondrosit | -7.37 | 1.34 | 2.35E-02 arası |
| Sox5 | Kondrosit | -2.88 | 4.43 | 6.06E-04 arası |
Tablo 1: Kemik ve kıkırdağın çeşitli hücre tiplerinde bilinen genlerin diferansiyel ekspresyonu (mandibuler kemik karşı MC).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
LCM, zenginleştirilmiş veya homojen hücre popülasyonlarının heterojen dokulardan izole edilmesini sağlar. Avantajları arasında hücrelerin in vivo bağlamında hızlı ve hassas bir şekilde yakalanması yer alırken, potansiyel dezavantajları arasında zaman alıcı, pahalı ve kullanıcının belirli bir örnek30içinde farklı alt popülasyonları tanıma ihtiyacı yla sınırlı olması yer almaktadır. Bu protokol fare embriyonik kıkırdak ve kemik LCM ayrıntılarını sağlar, rna-seq tarafından sonraki analiz için yüksek RNA bütünlüğünü korurken hassas doku toplama için kıkırdak ve kemik görselleştirmek için hızlı bir prosedür cresyl menekşe boyama kullanımını vurgulayarak. Bu protokolün bir sınırlaması, burada kullanılan LCM sisteminin mineralize dokular arasında doğrudan kesilememesidir (örneğin, Şekil 2C'dekisiyah mandibuler doku); sonuç olarak, tüm kemik alanı nın kesilmesi gerekir. Özellikle, LCM tarafından izole mikrodissected kemikleştirilmiş bölgeler homojen değildir, ve osteoblastlar, osteositler ve osteoklastlar en az alt popülasyonları içerir(Tablo 1). Bununla birlikte, LCM ile zenginleştirme, bir önceki çalışmamızda mikrodissected kemik dokusunda osteoklastlar gibi belirli alt popülasyonlarda transkripsiyonel değişikliklerin hala RNA-seq6tarafından tespit edilebilen olduğunu gösterdiği için değerlidir.
Gen ekspresyonu analizi için, yüksek RNA kalitesi ve verimi için numune hazırlama ve LCM prosedürünü optimize ettik. Protokolümüz taze donmuş dokularla başlıyor. Taze dondurulmuş doku bölümleri mükemmel miktar ve çıkarılan RNA kalitesi için izin3, mRNA fiksasyon standart yöntemlere duyarlı olduğu gibi31. RNA, RNase kontaminasyonu nedeniyle hızla bozulur ve numune hazırlama, LCM ve RNA yalıtımı boyunca RNase içermeyen bir ortamın bakımı başarılı bir uygulama için çok önemlidir. Kesit işleme sırasında suya maruz kalma RNA kalitesine zararlıdır31,32. Protokolümüz bu tür maruziyeti sınırlar, en yüksek sulu maruziyet seviyesi cresyl menekşe boyama sırasında %50'dir. %50 etanolde %0,1 cresyl menekşeile hızlı bir boyamanın(30s) kıkırdak için ayırt edilebilir bir renk verdiğini ve düşük girişli RNA-seq (Şekil 3C ve Şekil 4)gibi downstream analizi için RNA bütünlüğünü düşürmediğini test ettik. Verim/alan (ng/mm2)yaklaşık 20 ng/mm2 (Şekil 3F),önceki optimize edilmiş yöntemlere benzer veya dahayüksektir 33. MC ve mandibular kemik6hücre yoğunluğuna göre , bu protokol ile bir hücreden ortalama verim hücre başına yaklaşık 5 pg RNA olduğunu tahmin, ve toplam RNA 1-5 ng 200-1.000 hücreleri, düşük girişli RNA-seq6,7,33için kullanılabilir ayıklanabilir . Bu verim verimliliği çok kurulan LCM yöntemleri34daha yüksektir , ve aynı zamanda üstün veya son optimize protokolleri benzer33,35.
Histolojik kesitlerde farklı hücre tiplerini ayırt edebilme yeteneği, ilgi çekici belirli dokuların hassas bir şekilde toplanması için gereklidir. Cresyl menekşe negatif yüklü nükleik asitlere bağlanan hidrofilik, temel bir lekedir36. Bu özellik hücre tipi seçicilik ile karşı boyama için yararlı hale getirir37, ve nöronlar için standart bir histolojik leke38. Cresyl menekşe lcm dokuların çeşitli için, iyi doku morfolojisi ve yüksek RNA kalitesi33,36,39,40sağlayan kullanılmıştır. Diğer boyama yöntemleri ile karşılaştırıldığında, cresyl menekşe boyama sitoplazmik ve nükleer detayları sağlar, ve düşük RNA bozulma oranı32. Burada, teremor boyamanın kıkırdak ve kemik görselleştirmek için kolay ve hızlı bir yöntem olduğunu ve bu yöntemle lekelenmiş dokunun yüksek RNA bütünlüğünü muhafaza ettiğini gösteriyoruz. Ksilen tedavisi genellikle LCM önce dokuların dehidratasyon için kullanılır35,36,41,42. Özellikle düz cam kaydıralar kadar optik olarak net olmayan PEN membran slaytlarında hedeflenen dokuları ayırt etmek için gerekli olan doku morfolojisi35'in görselleştirilmesini geliştirmek için ksilen kullanıyoruz. OCT'yi çıkarmak için ajitasyon olsa bile boyama ve yıkama basamakları sırasında PEN slaytlarından önemli bir kesit kaybı meydana gelmemiş.
Mikrodroplet veya mikroakışkan tabanlı tek hücreli RNA-seq (scRNA-seq) heterojen hücre tipleri ile dokuların transkripsiyonanaliz etmek için yüksek iş letimat yöntemidir ve iskelet biyolojisi43kullanılmaya başlanmıştır . LCM aksine, scRNA-seq tek hücrelere doku enzimatik ve / veya mekanik ayrıştırma içerir. Tek hücre lisyonu hazırlama protokollerinin çoğu dokuların oda sıcaklığında veya 37 °C'de uzun süre kuluçkaya yatırılmasını gerektirir, bu da transkripsiyon44,45'ideğiştirir. Buna ek olarak, kıkırdak ve kemik tek hücrelerin izolasyon fiziksel trabecularization ve mineralizasyon iskelet element karmaşıklığı ile sınırlı olabilir. Hala doğru vivodokuların hücresel çeşitliliğini temsil iskelet dokularından canlı hücrelerin yeterli sayıda izole etmek için teknik bir meydan okumadır , ve hücrelerin eksik bölünmesi hücre tiplerinin tespitinde önyargı neden olabilir43. scRNA-seq farklı hücre türlerinin tanımlanmasına izin verirken, sıralama derinliği düşüktür ve tipik sıralama yaklaşımları 3' transkript uçlarını yakalar ve alternatif birleştirme analizine izin vermez. LCM türetilmiş dokunun toplu RNA-seq hücre farklılıkları homojenize, ancak kapsamlı transkript algılama ve alternatif birleştirme analizi sağlar. LCM bu nedenle özellikle çevre dokulardan kolayca ayrılmaz ve iç kompleks iskelet dokuları için yararlıdır ve dokunun taze dondurulmuş hazırlanması transkripsiyonel profiller ve transkripsiyonel analiz için RNA bütünlüğünü koruyabilir. scRNA-seq bir diğer zayıflık tek hücre hazırlanmasından sonra, hücrelerin mekansal bilgi kaybolur olmasıdır. LCM ve scRNA-seq bir arada tanımlanmış coğrafi yerlerden küçük bir örnek transkriptom çalışmasına izin vermek için geliştirilmiştir (Geo-seq)46, bölgesel gen ekspresyonu çalışmak için LCM kullanarak başka bir yaklaşımdır.
Özetle, bu protokol kıkırdak ve kemik optimize LCM ayrıntılarını sağlar, rna-seq tarafından sonraki analiz için yüksek RNA bütünlüğünü korurken hassas doku toplama için kıkırdak ve kemik görselleştirmek için hızlı bir prosedür cresyl menekşe boyama kullanımını vurgulayarak. Bu protokol, gen ekspresyonu analizi6,7için farklı gelişim aşamalarında kıkırdak ve kemik LCM için başarıyla kullanılmıştır ve diğer dokular için de kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Ulusal Diş ve Kraniyofasiyal Araştırma Enstitüsü (R01DE022988) ve Eunice Kennedy Shriver Ulusal Çocuk Sağlığı ve İnsanGelişimi Enstitüsü (P01HD078233) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar Mount Sinai De Icahn Tıp Okulu'nda Leica LMD 6500 platformuna erişim için Biorepository ve Patoloji Çekirdek teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Methylbutane | ThermoFisher Scientific | O3551-4 | |
| Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | |
| Centrifuge tube | ThermoFisher Scientific | 339653 | Conical sterile polypropylene centrifuge tubes, 50 mL |
| Cresyl violet acetate | Sigma-Aldrich | C5042 | |
| Cryostat | Leica Biosystems | CM3050 S | |
| Delicate task wiper | ThermoFisher Scientific | 06-666 | |
| Disposable embedding mold | ThermoFisher Scientific | 1220 | |
| Distilled water | Invitrogen | 10977-015 | DNase/RNase-Free |
| Ethanol, absolute (200 proof) | ThermoFisher Scientific | BP2818 | Molecular biology grade |
| Glass PEN membrane slide | Leica Microsystems | 11505158 | |
| LCM system | Leica Microsystems | Leica LMD6500 | |
| Microscope cover glass | ThermoFisher Scientific | 12-545FP | |
| Microscope slides | ThermoFisher Scientific | 12-550-15 | |
| OCT compound | Electron Microscopy Sciences | 102094-106 | |
| PCR tube with flat cap, 0.5 mL | Axygen | PCR-05-C | LCM collection tubes |
| Permanent mounting medium | Vector Laboratories | H-5000 | |
| RNA isolation kit | ThermoFisher Scientific | KIT0204 | |
| RNase decontamination agent | Sigma-Aldrich | R2020 | RNase decontamination agent for cleaning surfaces |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 |
References
- Kardon, G. Development of the musculoskeletal system: Meeting the neighbors. Development. 138 (14), 2855-2859 (2011).
- Nichterwitz, S., Chen, G., et al. Laser capture microscopy coupled with Smart-seq2 for precise spatial transcriptomic profiling. Nature Communications. 7, 12139 (2016).
- Liu, A. Laser capture microdissection in the tissue biorepository. Journal of Biomolecular Techniques. 21 (3), 120-125 (2010).
- Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
- Schroeder, A., Mueller, O., et al. The RIN: An RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7 (3), (2006).
- Motch Perrine, S. M., Wu, M., et al. Mandibular dysmorphology due to abnormal embryonic osteogenesis in FGFR2-related craniosynostosis mice. Disease Models & Mechanisms. 12 (5), (2019).
- Holmes, G., O'Rourke, C., et al. Midface and upper airway dysgenesis in FGFR2-craniosynostosis involves multiple tissue-specific and cell cycle effects. Development. 145 (19), (2018).
- Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., Käller, M. MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).
- Tromp, G., Kuivaniemi, H., et al. Structure of a full-length cDNA clone for the preproα1(I) chain of human type I procollagen. Biochemical Journal. 253 (3), 919-922 (1988).
- De Wet, W., Bernard, M., et al. Organization of the human pro-alpha 2(I) collagen gene. Journal of Biological Chemistry. 262 (33), 16032-16036 (1987).
- Bonewald, L. F. The amazing osteocyte. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).
- Toyosawa, S., Shintani, S., et al. Dentin matrix protein 1 is predominantly expressed in chicken and rat osteocytes but not in osteoblasts. Journal of Bone and Mineral Research. 16 (11), 2017-2026 (2001).
- Guo, D., et al.
- Ducy, P., Zhang, R., Geoffroy, V., Ridall, A. L., Karsenty, G. Osf2/Cbfa1: A transcriptional activator of osteoblast differentiation. Cell. 89 (5), 747-754 (1997).
- Nakashima, K., Zhou, X., et al. The novel zinc finger-containing transcription factor osterix is required for osteoblast differentiation and bone formation. Cell. 108 (1), 17-29 (2002).
- Termine, J. D., et al. Osteonectin, a bone-specific protein linking mineral to collagen. Cell. 26 (1), 99-105 (1981).
- Baldwin, C. T., Reginato, A. M., Prockop, D. J. A new epidermal growth factor-like domain in the human core protein for the large cartilage-specific proteoglycan. Evidence for alternative splicing of the domain. Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 15747-15750 (1989).
- Strom, C. M., Upholt, W. B. Isolation and characterization of genomic clones corresponding to the human type II procollagengene. Nucleic Acids Research. 12 (2), 1025-1038 (1984).
- Ninomiya, Y., Olsen, B. R. Synthesis and characterization of cDNA encoding a cartilage-specific short collagen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 81 (10), 3014-3018 (1984).
- Muragaki, Y., Mariman, E. C. M., et al. A mutation in the gene encoding the alpha 2 chain of the fibril-associated collagen IX, COL9A2, causes multiple epiphyseal dysplasia (EDM2). Nature Genetics. 12 (1), 103-105 (1996).
- Brewton, R. G., Wood, B. M., et al. Molecular cloning of the alpha 3 chain of human type IX collagen: linkage of the gene COL9A3 to chromosome 20q13.3. Genomics. 30 (2), 329-336 (1995).
- Newton, G., Weremowicz, S., et al. Characterization of human and mouse cartilage oligomeric matrix protein. Genomics. 24 (3), 435-439 (1994).
- Hiraki, Y., Mitsui, K., et al. Molecular cloning of human chondromodulin-I, a cartilage-derived growth modulating factor, and its expression in Chinese hamster ovary cells. European Journal of Biochemistry. 260 (3), 869-878 (1999).
- Smits, P., Li, P., et al. The transcription factors L-Sox5 and Sox6 are essential for cartilage formation. Developmental Cell. 1 (2), 277-290 (2001).
- Hayman, A. R., Jones, S. J., et al. Mice lacking tartrate-resistant acid phosphatase (Acp 5) have disrupted endochondral ossification and mild osteopetrosis. Development. 122 (10), 3151-3162 (1996).
- Dai, X. -M., Ryan, G. R., et al. Targeted disruption of the mouse colony-stimulating factor 1 receptor gene results in osteopetrosis, mononuclear phagocyte deficiency, increased primitive progenitor cell frequencies, and reproductive defects. Blood. 99 (1), 111-120 (2002).
- Gowen, M., Lazner, F., et al. Cathepsin K knockout mice develop osteopetrosis due to a deficit in matrix degradation but not demineralization. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (10), 1654-1663 (1999).
- Faccio, R., Takeshita, S., Zallone, A., Ross, F. P., Teitelbaum, S. L. c-Fms and the αvβ3 integrin collaborate during osteoclast differentiation. Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 749-758 (2003).
- Kim, N., Takami, M., Rho, J., Josien, R., Choi, Y. A novel member of the leukocyte receptor complex regulates osteoclast differentiation. The Journal of Experimental Medicine. 195 (2), 201-209 (2002).
- Mahalingam, M. Laser Capture Microdissection: Insights into Methods and Applications. Methods in Molecular Biology. 11723, 1-17 (2018).
- Goldsworthy, S. M., Stockton, P. S., Trempus, C. S., Foley, J. F., Maronpot, R. R. Effects of fixation on RNA extraction and amplification from laser capture microdissected tissue. Molecular Carcinogenesis. 25 (2), 86-91 (1999).
- Clément-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
- Farris, S., Wang, Y., Ward, J. M., Dudek, S. M. Optimized method for robust transcriptome profiling of minute tissues using laser capture microdissection and low-input RNA-seq. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 185 (2017).
- Espina, V., Heiby, M., Pierobon, M., Liotta, L. A. Laser capture microdissection technology. Expert Review of Molecular Diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).
- Martuscello, R. T., Louis, E. D., Faust, P. L. A stainless protocol for high quality RNA isolation from laser capture microdissected Purkinje cells in the human post-mortem cerebellum. Journal of Visualized Experiments. (143), (2019).
- Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection. BMC Cell Biology. 11 (95), (2010).
- Takahashi, N., Tarumi, W., Hamada, N., Ishizuka, B., Itoh, M. T. Cresyl violet stains mast cells selectively: Its application to counterstaining in immunohistochemistry. Zoological Science. 34 (2), 147-150 (2017).
- Sheldon, A. R., Almli, L., Ferriero, D. M. Copper/zinc superoxide dismutase transgenic brain in neonatal hypoxia-ischemia. Methods in Enzymology. 353, 389-397 (2002).
- Kolijn, K., Van Leenders, G. J. L. H. Comparison of RNA extraction kits and histological stains for laser capture microdissected prostate tissue. BMC Research Notes. 9, 17 (2016).
- Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
- Filliers, M., et al. Laser capture microdissection for gene expression analysis of inner cell mass and trophectoderm from blastocysts. Analytical Biochemistry. 408 (1), 169-171 (2011).
- Vandewoestyne, M., et al. Laser capture microdissection: Should an ultraviolet or infrared laser be used? Analytical Biochemistry. 439 (2), 88-98 (2013).
- Ayturk, U. RNA-seq in skeletal biology. Current Osteoporosis Reports. 17 (4), 178-185 (2019).
- Van Den Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
- Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: A molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
- Chen, J., et al. Spatial transcriptomic analysis of cryosectioned tissue samples with Geo-seq. Nature Protocols. 12 (3), 566-580 (2017).
