Este protocolo describe la microdisección de captura láser para el aislamiento del cartílago y el hueso de las secciones congeladas frescas del embrión del ratón. El cartílago y el hueso se pueden visualizar rápidamente mediante la tinción violeta de cresíl y se recogen con precisión para producir ARN de alta calidad para el análisis transcriptómico.
La microdisección de captura láser (LCM) es una poderosa herramienta para aislar tipos de células específicas o regiones de interés de tejidos heterogéneos. La complejidad celular y molecular de los elementos esqueléticos aumenta con el desarrollo. La heterogeneidad tisular, como en la interfaz de elementos cartilaginosos y óseos entre sí o con los tejidos circundantes, es un obstáculo para el estudio del desarrollo del cartílago y el hueso. Nuestro protocolo proporciona un método rápido de procesamiento de tejidos y aislamiento de cartílago y hueso que produce ARN de alta calidad para el análisis de expresión génica. Los tejidos congelados frescos de embriones de ratón se seccionan y la breve tinción violeta de cresilo se utiliza para visualizar el cartílago y el hueso con colores distintos de los tejidos circundantes. Los deslizamientos se deshidratan rápidamente, y el cartílago y el hueso se aíslan posteriormente por LCM. La minimización de la exposición a soluciones acuosas durante este proceso mantiene la integridad del ARN. El cartílago de Mouse Meckel y el hueso mandibular en E16.5 se recopilaron con éxito y el análisis de la expresión génica mostró la expresión diferencial de genes marcadores para osteoblastos, osteocitos, osteoclastos y condrocitos. Arna de alta calidad también se aisló de una gama de tejidos y edades embrionarias. Este protocolo detalla la preparación de muestras para LCM, incluyendo crioema, seccionamiento, tinción y deshidratación de tejidos congelados frescos, y aislamiento preciso de cartílago y hueso por LCM, lo que resulta en ARN de alta calidad para análisis transcriptomic.
El sistema musculoesquelético es un sistema multicomponente compuesto por músculo, tejido conectivo, tendón, ligamento, cartílago y hueso, invadido por los nervios y vascularizado por los vasos sanguíneos1. Los tejidos esqueléticos se desarrollan con el aumento de la heterogeneidad celular y la complejidad estructural. El cartílago y el hueso se desarrollan a partir del mismo linaje osteocondrónrogenitor y están altamente relacionados. El cartílago embrionario y el hueso se desarrollan en asociación con músculos, nervios, vasos sanguíneos y mesenquime indiferenciado. El cartílago también puede estar rodeado de hueso, como el cartílago de Meckel y el cartílago condilar dentro del hueso mandibular. Estos tejidos están anatómicamente asociados e interactúan entre sí a través de señales extracelulares durante el desarrollo. En el estudio de la expresión génica en el desarrollo de cartílago y hueso, un obstáculo es la heterogeneidad de las estructuras esqueléticas compuestas de múltiples tipos de tejido. El aislamiento preciso del tejido específico de interés es clave para un análisis transcripcional exitoso.
La microdisección de captura láser (LCM) es una poderosa herramienta para aislar tipos de células o regiones de interés dentro de tejidos heterogéneos, y es reproducible y es sensible al nivel de una sola célula2. Puede apuntar y capturar con precisión células de interés para una amplia gama de ensayos aguas abajo en transcriptomica, genómica y proteómica3,4. La calidad del ARN, ADN o proteína aisladose se puede evaluar con un bioanalizador o plataforma equivalente. Por ejemplo, la calidad del ARN se indica mediante el número de integridad del ARN (RIN)5.
Aquí, proporcionamos un protocolo para la rápida tinción y aislamiento de cartílago y hueso por LCM de los tejidos congelados frescos. Utilizamos el embrión de ratón para demostrar que este protocolo produce ARN de alta calidad para análisis transcriptomáticos posteriores, como la secuenciación de ARN (RNA-seq).
LCM permite el aislamiento de poblaciones celulares enriquecidas u homogéneas de tejidos heterogéneos. Sus ventajas incluyen la captura rápida y precisa de las células en su contexto in vivo, mientras que las desventajas potenciales incluyen que sea lento, costosa y limitada por la necesidad de que el usuario reconozca subpoblaciones distintas dentro de una muestra especificada30. Este protocolo proporciona detalles de LCM de cartílago embrionario de ratón y hueso, destacando el uso…
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Investigación Dental y Craneofacial (R01DE022988) y el Instituto Nacional de Salud Infantil y Desarrollo Humano Eunice Kennedy Shriver (P01HD078233). Los autores agradecen al Biorepositorio y Al Núcleo de Patología por el acceso a la plataforma Leica LMD 6500 en la Escuela de Medicina de Icahn en el Monte Sinaí.
2-Methylbutane | ThermoFisher Scientific | O3551-4 | |
Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | |
Centrifuge tube | ThermoFisher Scientific | 339653 | Conical sterile polypropylene centrifuge tubes, 50 mL |
Cresyl violet acetate | Sigma-Aldrich | C5042 | |
Cryostat | Leica Biosystems | CM3050 S | |
Delicate task wiper | ThermoFisher Scientific | 06-666 | |
Disposable embedding mold | ThermoFisher Scientific | 1220 | |
Distilled water | Invitrogen | 10977-015 | DNase/RNase-Free |
Ethanol, absolute (200 proof) | ThermoFisher Scientific | BP2818 | Molecular biology grade |
Glass PEN membrane slide | Leica Microsystems | 11505158 | |
LCM system | Leica Microsystems | Leica LMD6500 | |
Microscope cover glass | ThermoFisher Scientific | 12-545FP | |
Microscope slides | ThermoFisher Scientific | 12-550-15 | |
OCT compound | Electron Microscopy Sciences | 102094-106 | |
PCR tube with flat cap, 0.5 mL | Axygen | PCR-05-C | LCM collection tubes |
Permanent mounting medium | Vector Laboratories | H-5000 | |
RNA isolation kit | ThermoFisher Scientific | KIT0204 | |
RNase decontamination agent | Sigma-Aldrich | R2020 | RNase decontamination agent for cleaning surfaces |
Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 |