लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन माउस भ्रूणीय उपास्थि और जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए हड्डी
Summary
यह प्रोटोकॉल माउस भ्रूण के ताजा जमे हुए वर्गों से उपास्थि और हड्डी के अलगाव के लिए लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन का वर्णन करता है। उपास्थि और हड्डी को तेजी से क्रेसिल वायलेट धुंधला द्वारा कल्पना की जा सकती है और ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण के लिए उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए को प्राप्त करने के लिए ठीक से एकत्र किया जा सकता है।
Abstract
लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन (एलसीएम) विशिष्ट कोशिका प्रकार या विषम ऊतकों से ब्याज के क्षेत्रों को अलग करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। कंकाल तत्वों की सेलुलर और आणविक जटिलता विकास के साथ बढ़ जाती है। ऊतक विषमता, जैसे एक दूसरे के साथ या आसपास के ऊतकों के साथ कार्टिलाजिनस और ओसियस तत्वों के इंटरफेस पर, उपास्थि और हड्डी के विकास के अध्ययन में एक बाधा है। हमारा प्रोटोकॉल ऊतक प्रसंस्करण और उपास्थि और हड्डी के अलगाव की एक तेजी से विधि प्रदान करता है जो जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए की पैदावार करता है। माउस भ्रूण के ताजा जमे हुए ऊतकों को खंडित किया जाता है और संक्षिप्त क्रेसिल बैंगनी धुंधला का उपयोग आसपास के ऊतकों से अलग रंगों के साथ उपास्थि और हड्डी की कल्पना करने के लिए किया जाता है। स्लाइड तो तेजी से निर्जलित हैं, और उपास्थि और हड्डी बाद में LCM द्वारा अलग कर रहे हैं । इस प्रक्रिया के दौरान जलीय समाधानों के संपर्क में आने का कमीकरण आरएनए अखंडता को बनाए रखता है। माउस मेकेल के उपास्थि और ई16.5 में मंडीबुलर हड्डी को सफलतापूर्वक एकत्र किया गया और जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण ने ऑस्टियोब्लास्ट, ऑस्टियोसाइट्स, ऑस्टियोप्लास्ट और कॉन्ड्रोसाइट्स के लिए मार्कर जीन की अंतर अभिव्यक्ति दिखाई। उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए को ऊतकों और भ्रूणीय उम्र की एक श्रृंखला से भी अलग किया गया था। यह प्रोटोकॉल विवरण क्रायोएम्बेडिंग, सेक्शनिंग, धुंधला और ताजा जमे हुए ऊतकों को निर्जलित करने सहित एलसीएम के लिए नमूना तैयारी, और एलसीएम द्वारा उपास्थि और हड्डी के सटीक अलगाव के परिणामस्वरूप ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण के लिए उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए।
Introduction
मस्कुलोस्केलेटल सिस्टम मांसपेशियों, संयोजी ऊतक, टेंडन, स्नायु, उपास्थि और हड्डी से बना एक बहुघटक प्रणाली है, जो नसों द्वारा अंतरवत और रक्त वाहिकाओं द्वारा संवहनीहै 1। कंकाल ऊतक सेलुलर विषमता और संरचनात्मक जटिलता में वृद्धि के साथ विकसित होते हैं। उपास्थि और हड्डी एक ही ऑस्टियोकोनड्रोजेनेटर वंश से विकसित होती है और अत्यधिक संबंधित होती है। भ्रूण उपास्थि और हड्डी मांसपेशियों, नसों, रक्त वाहिकाओं, और अविभेदित मेसेंचिम के सहयोग से विकसित होती है। उपास्थि भी हड्डी से घिरा हो सकता है, जैसे मेकेल का उपास्थि और मंडीबुलर हड्डी के भीतर मसाला उपास्थि। ये ऊतक शारीरिक रूप से जुड़े होते हैं और विकास के दौरान बाह्य संकेतों के माध्यम से एक दूसरे के साथ बातचीत करते हैं। उपास्थि और हड्डी के विकास में जीन अभिव्यक्ति के अध्ययन में, एक बाधा कई ऊतक प्रकारों से बना कंकाल संरचनाओं की विषमता है। ब्याज के विशिष्ट ऊतक का सटीक अलगाव सफल प्रतिलेखन विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण है।
लेजर कैप्चर माइक्रोडिससेक्शन (एलसीएम) विषम ऊतकों के भीतर कोशिका प्रकार या ब्याज के क्षेत्रों को अलग करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है, और प्रजनन योग्य है और एकल सेल स्तर2के प्रति संवेदनशील है। यह ठीक से लक्षित और प्रतिलेखन, जीनोमिक्स, और प्रोटेओमिक्स3,4में डाउनस्ट्रीम परख ों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए ब्याज की कोशिकाओं पर कब्जा कर सकते हैं । अलग आरएनए, डीएनए या प्रोटीन की गुणवत्ता का आकलन बायोएनालाइजर या समकक्ष मंच के साथ किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, आरएनए गुणवत्ता आरएनए अखंडता संख्या (आरआईआर)5द्वारा इंगित की जाती है।
यहां, हम ताजा जमे हुए ऊतकों से एलसीएम द्वारा उपास्थि और हड्डी के तेजी से धुंधला और अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। हम माउस भ्रूण का उपयोग करने के लिए प्रदर्शित करता है कि इस प्रोटोकॉल के बाद ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण के लिए उच्च गुणवत्ता आरएनए पैदावार, जैसे आरएनए अनुक्रमण (आरएनए-सीक्यू) ।
Protocol
Representative Results
Discussion
एलसीएम विषम ऊतकों से समृद्ध या समरूप कोशिका आबादी के अलगाव को सक्षम बनाता है। इसके फायदों में वीवो संदर्भ में कोशिकाओं का तेजी से और सटीक कब्जा शामिल है, जबकि संभावित नुकसान में यह समय लेने वाला, महं…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ डेंटल एंड क्रैनियोफेशियल रिसर्च (R01DE022988) और यूनिस कैनेडी श्रिवर नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ चाइल्ड हेल्थ एंड ह्यूमन डेवलपमेंट (P01HD078233) द्वारा समर्थित किया गया था। लेखक माउंट सिनाई में इकाहान स्कूल ऑफ मेडिसिन में लीका एलएमडी 6500 प्लेटफॉर्म तक पहुंच के लिए बायोरेपोसिटररी और पैथोलॉजी कोर का शुक्रिया अदा करते हैं।
Materials
| 2-Methylbutane | ThermoFisher Scientific | O3551-4 | |
| Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | |
| Centrifuge tube | ThermoFisher Scientific | 339653 | Conical sterile polypropylene centrifuge tubes, 50 mL |
| Cresyl violet acetate | Sigma-Aldrich | C5042 | |
| Cryostat | Leica Biosystems | CM3050 S | |
| Delicate task wiper | ThermoFisher Scientific | 06-666 | |
| Disposable embedding mold | ThermoFisher Scientific | 1220 | |
| Distilled water | Invitrogen | 10977-015 | DNase/RNase-Free |
| Ethanol, absolute (200 proof) | ThermoFisher Scientific | BP2818 | Molecular biology grade |
| Glass PEN membrane slide | Leica Microsystems | 11505158 | |
| LCM system | Leica Microsystems | Leica LMD6500 | |
| Microscope cover glass | ThermoFisher Scientific | 12-545FP | |
| Microscope slides | ThermoFisher Scientific | 12-550-15 | |
| OCT compound | Electron Microscopy Sciences | 102094-106 | |
| PCR tube with flat cap, 0.5 mL | Axygen | PCR-05-C | LCM collection tubes |
| Permanent mounting medium | Vector Laboratories | H-5000 | |
| RNA isolation kit | ThermoFisher Scientific | KIT0204 | |
| RNase decontamination agent | Sigma-Aldrich | R2020 | RNase decontamination agent for cleaning surfaces |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 |
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