Detta protokoll beskriver laserinfångnings mikrodissektion för isolering av brosk och ben från färska frysta delar av mus embryot. Brosk och ben kan snabbt visualiseras genom cresyl violett färgning och samlas just för att ge hög kvalitet RNA för transcriptomic analys.
Laser Capture microdissection (LCM) är ett kraftfullt verktyg för att isolera specifika celltyper eller regioner av intresse från heterogena vävnader. Skelett elementens cellulära och molekylära komplexitet ökar med utvecklingen. Vävnad heterogenitet, såsom vid gränssnittet av brosk och bendefekter element med varandra eller med omgivande vävnader, är ett hinder för studiet av att utveckla brosk och ben. Vårt protokoll ger en snabb metod för vävnads bearbetning och isolering av brosk och ben som ger hög kvalitet RNA för gen uttrycks analys. Färska frysta vävnader av mus embryon är sektioneras och kort cresyl violett färgning används för att visualisera brosk och ben med färger skiljer sig från omgivande vävnader. Diabilder är sedan snabbt uttorkad, och brosk och ben isoleras därefter av LCM. Minimering av exponering för vattenlösningar under denna process upprätthåller RNA-integritet. Mus Meckels brosk och mandibular ben vid E 16.5 har framgångsrikt samlats in och gen uttrycks analys visade differential uttryck av markörgener för osteoblaster, osteocyter, osteoklaster och kondrocyter. Hög kvalitet RNA isolerades också från en rad vävnader och embryonala åldrar. Detta protokoll specificerar provpreparering för LCM inklusive kryoinbäddning, snittning, färgning och torkning av färska frysta vävnader, och exakt isolering av brosk och ben av LCM vilket resulterar i högkvalitativt RNA för transkriptomisk analys.
Rörelseapparaten är ett multikomponentsystem som består av muskler, bindväv, senor, ligament, brosk, och ben, innerveras av nerver och vaskulariserad av blodkärl1. Skelett vävnaderna utvecklas med ökande cellulära heterogenitet och strukturell komplexitet. Brosk och ben utvecklas från samma osteochondroprogenitor härstamning och är mycket relaterade. Embryonala brosk och ben utvecklas i samband med muskler, nerver, blodkärl, och odifferentierad Mesenchyme. Brosk kan också vara omgiven av ben, såsom Meckels brosk och kondylar brosk inom mandibular benet. Dessa vävnader är anatomiskt associerade och interagera med varandra genom extracellulära signaler under utvecklingen. I studiet av genuttryck i utvecklingen av brosk och ben, ett hinder är heterogenitet skelett strukturer består av flera vävnadstyper. Exakt isolering av den specifika vävnaden av intresse är nyckeln för framgångsrik transkriptionell analys.
Laser Capture microdissection (LCM) är ett kraftfullt verktyg för att isolera celltyper eller regioner av intresse inom heterogena vävnader, och är reproducerbar och är känslig för Single cell Level2. Det kan exakt rikta och fånga celler av intresse för ett brett spektrum av nedströms analyser i transcriptomics, genomik, och proteomik3,4. Kvaliteten på det isolerade RNA, DNA, eller protein kan bedömas med en bioanalyzer eller motsvarande plattform. Till exempel indikeras RNA-kvalitet av RNA-integritetnumret (RIN)5.
Här ger vi ett protokoll för snabb färgning och isolering av brosk och ben av LCM från färska frysta vävnader. Vi använder mus embryot för att visa att detta protokoll ger högkvalitativt RNA för efterföljande transkriptomisk analys, såsom RNA-sekvensering (RNA-SEQ).
LCM möjliggör isolering av berikade eller homogena cellpopulationer från heterogena vävnader. Dess fördelar är snabb och exakt avskiljning av celler i deras in vivo -sammanhang, medan potentiella nackdelar är att det är tidskrävande, dyrt och begränsat av behovet av att användaren känner igen distinkta subpopulationer inom ett angivet prov30. Detta protokoll ger information om LCM av mus embryonala brosk och ben, belyser användningen av cresyl violett färgning i ett snabbt f…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av National Institute of Dental and Craniofacial Research (R01DE022988) och Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health och Human Development (P01HD078233). Författarna tackar Biorepository och patologi kärna för tillgång till Leica LMD 6500 plattform vid Icahn School of Medicine vid berget Sinai.
2-Methylbutane | ThermoFisher Scientific | O3551-4 | |
Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | |
Centrifuge tube | ThermoFisher Scientific | 339653 | Conical sterile polypropylene centrifuge tubes, 50 mL |
Cresyl violet acetate | Sigma-Aldrich | C5042 | |
Cryostat | Leica Biosystems | CM3050 S | |
Delicate task wiper | ThermoFisher Scientific | 06-666 | |
Disposable embedding mold | ThermoFisher Scientific | 1220 | |
Distilled water | Invitrogen | 10977-015 | DNase/RNase-Free |
Ethanol, absolute (200 proof) | ThermoFisher Scientific | BP2818 | Molecular biology grade |
Glass PEN membrane slide | Leica Microsystems | 11505158 | |
LCM system | Leica Microsystems | Leica LMD6500 | |
Microscope cover glass | ThermoFisher Scientific | 12-545FP | |
Microscope slides | ThermoFisher Scientific | 12-550-15 | |
OCT compound | Electron Microscopy Sciences | 102094-106 | |
PCR tube with flat cap, 0.5 mL | Axygen | PCR-05-C | LCM collection tubes |
Permanent mounting medium | Vector Laboratories | H-5000 | |
RNA isolation kit | ThermoFisher Scientific | KIT0204 | |
RNase decontamination agent | Sigma-Aldrich | R2020 | RNase decontamination agent for cleaning surfaces |
Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 |