Summary

Laser Capture Microdissectie van de muis embryonale kraakbeen en bot voor genexpressie analyse

Published: December 18, 2019
doi:

Summary

Dit protocol beschrijft de laser Capture micro dissectie voor de isolatie van kraakbeen en bot uit verse bevroren delen van de muis embryo. Kraakbeen en botten kunnen snel worden gevisualiseerd door Cresylacetaat-Violet kleuring en precies worden verzameld om RNA van hoge kwaliteit te leveren voor transcriptomische analyse.

Abstract

Laser Capture microdissection (LCM) is een krachtig hulpmiddel om specifieke celtypen of regio’s van belang te isoleren van heterogene weefsels. De cellulaire en moleculaire complexiteit van skeletelementen neemt toe met de ontwikkeling. Weefsel heterogeniteit, zoals op het raakvlak van kraakbeen-en osseeuze elementen met elkaar of met omringende weefsels, is een obstakel voor de studie van het ontwikkelen van kraakbeen en botten. Ons protocol biedt een snelle methode van weefsel verwerking en isolatie van kraakbeen en botten die hoge kwaliteit RNA voor genexpressie analyse oplevert. Verse bevroren weefsels van muis embryo’s worden verdeeld en korte Cresylacetaat Violet kleuring wordt gebruikt om kraakbeen en botten te visualiseren met kleuren die verschillend zijn van omringende weefsels. Dia’s worden vervolgens snel gedehydrateerd en kraakbeen en botten worden vervolgens geïsoleerd door LCM. De minimalisatie van blootstelling aan waterige oplossingen tijdens dit proces handhaaft de RNA-integriteit. Het kraakbeen van de muis Meckel en het mandibulaire bot bij E 16.5 werden met succes verzameld en de analyse van genexpressie toonde differentiële expressie van marker genen voor osteoblasten, osteocyten, osteoclasten en chondrocyten. RNA van hoge kwaliteit werd ook geïsoleerd uit een aantal weefsels en embryonale leeftijden. Dit protocol Details monstervoorbereiding voor LCM met inbegrip van cryoinbed ding, snijden, kleuring en dehydrerende verse bevroren weefsels, en precieze isolatie van kraakbeen en bot door LCM resulterend in hoge kwaliteit RNA voor Transcriptomic analyse.

Introduction

Het bewegingsapparaat is een multicomponentsysteem bestaande uit spier, bindweefsel, pees, ligament, kraakbeen, en bot, geïncubeerd door zenuwen en gevasculariseerde door bloedvaten1. De skelet weefsels ontwikkelen met toenemende cellulaire heterogeniteit en structurele complexiteit. Kraakbeen en bot ontwikkelen van dezelfde osteochondroprogenitor lineage en zijn sterk gerelateerd. Embryonaal kraakbeen en bot ontwikkelen in associatie met spieren, zenuwen, bloedvaten, en ongedifferentieerde Mesenchyme. Kraakbeen kan ook worden omgeven door bot, zoals het kraakbeen van Meckel en condylenbaan kraakbeen binnen het mandibulaire bot. Deze weefsels zijn anatomisch geassocieerd en interactie met elkaar via extracellulaire signalen tijdens de ontwikkeling. In de studie van genexpressie bij de ontwikkeling van kraakbeen en botten is één obstakel de heterogeniteit van skelet structuren samengesteld uit meerdere weefsel typen. Nauwkeurige isolatie van het specifieke weefsel van belang is de sleutel voor succesvolle transcriptionele analyse.

Laser Capture microdissection (LCM) is een krachtig hulpmiddel om celtypen of interessegebieden binnen heterogene weefsels te isoleren, en is reproduceerbaar en is gevoelig voor het enkele celniveau2. Het kan zich precies richten en cellen van belang te vangen voor een breed scala van downstream assays in transcriptomics, Genomics, en proteomica3,4. De kwaliteit van het geïsoleerde RNA, DNA of eiwit kan worden beoordeeld met een bioanalyzer of gelijkwaardig platform. De kwaliteit van RNA wordt bijvoorbeeld aangegeven door het RNA-integriteits nummer (RIN)5.

Hier bieden we een protocol voor de snelle kleuring en isolatie van kraakbeen en botten door LCM uit verse bevroren weefsels. We gebruiken het embryo van de muis om aan te tonen dat dit protocol kwalitatief hoogwaardig RNA oplevert voor daaropvolgende transcriptomische analyse, zoals RNA-sequencing (RNA-SEQ).

Protocol

Weefsels van muizen werden verkregen in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide voor de verzorging en het gebruik van proefdieren, en studie protocollen werden goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité aan de Icahn school of Medicine op de berg Sinaï. 1. bereiding van vers bevroren specimen Het embryo of het weefsel van belang ontleden. Sluit het monster in een wegwerp-insluitings mal met optimale snijtemperatuur (OCT) compound. Pas de ori…

Representative Results

Coronale gedeelten van vers bevroren muizen weefsels bij e 16.5 werden gebruikt om de isolatie en verzameling van het kraakbeen (MC), condylenbaan kraakbeen en mandibulaire bot door LCM aan te tonen. Muizen embryo’s bij E 16.5 werden ontleed en ingebed in cryogene mallen met een LGO-compound. Monsters in mallen werden snel bevroren in een droogijs en methyl-2-butaan bad en opgeslagen bij-80 °C. Voor het demonstreren van Cresylacetaat Violet kleuring van kraakbeen en bot, werd cryosectioning i…

Discussion

LCM maakt de isolatie van verrijkte of homogene celpopulaties uit heterogene weefsels mogelijk. De voordelen omvatten snelle en nauwkeurige vangst van cellen in hun in vivo context, terwijl potentiële nadelen omvatten het is tijdrovend, duur, en beperkt door de noodzaak voor de gebruiker om verschillende subpopulaties binnen een gespecificeerd voorbeeld te herkennen30. Dit protocol bevat details van LCM van muis embryonaal kraakbeen en bot, waarbij het gebruik van Cresylacetaat Violet kl…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gesteund door het National Institute of Dental and Craniofacial Research (R01DE022988) en het Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (P01HD078233). De auteurs danken de Biorepository en pathologie kern voor toegang tot het Leica LMD 6500 platform aan de Icahn school of Medicine op de berg Sinaï.

Materials

2-Methylbutane ThermoFisher Scientific O3551-4
Bioanalyzer Agilent G2939BA
Centrifuge tube ThermoFisher Scientific 339653 Conical sterile polypropylene centrifuge tubes, 50 mL
Cresyl violet acetate Sigma-Aldrich C5042
Cryostat Leica Biosystems CM3050 S
Delicate task wiper ThermoFisher Scientific 06-666
Disposable embedding mold ThermoFisher Scientific 1220
Distilled water Invitrogen 10977-015 DNase/RNase-Free
Ethanol, absolute (200 proof) ThermoFisher Scientific BP2818 Molecular biology grade
Glass PEN membrane slide Leica Microsystems 11505158
LCM system Leica Microsystems Leica LMD6500
Microscope cover glass ThermoFisher Scientific 12-545FP
Microscope slides ThermoFisher Scientific 12-550-15
OCT compound Electron Microscopy Sciences 102094-106
PCR tube with flat cap, 0.5 mL Axygen PCR-05-C LCM collection tubes
Permanent mounting medium Vector Laboratories H-5000
RNA isolation kit ThermoFisher Scientific KIT0204
RNase decontamination agent Sigma-Aldrich R2020 RNase decontamination agent for cleaning surfaces
Xylene Sigma-Aldrich 214736

References

  1. Kardon, G. Development of the musculoskeletal system: Meeting the neighbors. Development. 138 (14), 2855-2859 (2011).
  2. Nichterwitz, S., Chen, G., et al. Laser capture microscopy coupled with Smart-seq2 for precise spatial transcriptomic profiling. Nature Communications. 7, 12139 (2016).
  3. Liu, A. Laser capture microdissection in the tissue biorepository. Journal of Biomolecular Techniques. 21 (3), 120-125 (2010).
  4. Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
  5. Schroeder, A., Mueller, O., et al. The RIN: An RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7 (3), (2006).
  6. Motch Perrine, S. M., Wu, M., et al. Mandibular dysmorphology due to abnormal embryonic osteogenesis in FGFR2-related craniosynostosis mice. Disease Models & Mechanisms. 12 (5), (2019).
  7. Holmes, G., O’Rourke, C., et al. Midface and upper airway dysgenesis in FGFR2-craniosynostosis involves multiple tissue-specific and cell cycle effects. Development. 145 (19), (2018).
  8. Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., Käller, M. MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).
  9. Tromp, G., Kuivaniemi, H., et al. Structure of a full-length cDNA clone for the preproα1(I) chain of human type I procollagen. Biochemical Journal. 253 (3), 919-922 (1988).
  10. De Wet, W., Bernard, M., et al. Organization of the human pro-alpha 2(I) collagen gene. Journal of Biological Chemistry. 262 (33), 16032-16036 (1987).
  11. Bonewald, L. F. The amazing osteocyte. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).
  12. Toyosawa, S., Shintani, S., et al. Dentin matrix protein 1 is predominantly expressed in chicken and rat osteocytes but not in osteoblasts. Journal of Bone and Mineral Research. 16 (11), 2017-2026 (2001).
  13. Guo, D., et al. Identification of osteocyte-selective proteins. Proteomics. 10 (20), 3688-3698 (2010).
  14. Ducy, P., Zhang, R., Geoffroy, V., Ridall, A. L., Karsenty, G. Osf2/Cbfa1: A transcriptional activator of osteoblast differentiation. Cell. 89 (5), 747-754 (1997).
  15. Nakashima, K., Zhou, X., et al. The novel zinc finger-containing transcription factor osterix is required for osteoblast differentiation and bone formation. Cell. 108 (1), 17-29 (2002).
  16. Termine, J. D., et al. Osteonectin, a bone-specific protein linking mineral to collagen. Cell. 26 (1), 99-105 (1981).
  17. Baldwin, C. T., Reginato, A. M., Prockop, D. J. A new epidermal growth factor-like domain in the human core protein for the large cartilage-specific proteoglycan. Evidence for alternative splicing of the domain. Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 15747-15750 (1989).
  18. Strom, C. M., Upholt, W. B. Isolation and characterization of genomic clones corresponding to the human type II procollagengene. Nucleic Acids Research. 12 (2), 1025-1038 (1984).
  19. Ninomiya, Y., Olsen, B. R. Synthesis and characterization of cDNA encoding a cartilage-specific short collagen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 81 (10), 3014-3018 (1984).
  20. Muragaki, Y., Mariman, E. C. M., et al. A mutation in the gene encoding the alpha 2 chain of the fibril-associated collagen IX, COL9A2, causes multiple epiphyseal dysplasia (EDM2). Nature Genetics. 12 (1), 103-105 (1996).
  21. Brewton, R. G., Wood, B. M., et al. Molecular cloning of the alpha 3 chain of human type IX collagen: linkage of the gene COL9A3 to chromosome 20q13.3. Genomics. 30 (2), 329-336 (1995).
  22. Newton, G., Weremowicz, S., et al. Characterization of human and mouse cartilage oligomeric matrix protein. Genomics. 24 (3), 435-439 (1994).
  23. Hiraki, Y., Mitsui, K., et al. Molecular cloning of human chondromodulin-I, a cartilage-derived growth modulating factor, and its expression in Chinese hamster ovary cells. European Journal of Biochemistry. 260 (3), 869-878 (1999).
  24. Smits, P., Li, P., et al. The transcription factors L-Sox5 and Sox6 are essential for cartilage formation. Developmental Cell. 1 (2), 277-290 (2001).
  25. Hayman, A. R., Jones, S. J., et al. Mice lacking tartrate-resistant acid phosphatase (Acp 5) have disrupted endochondral ossification and mild osteopetrosis. Development. 122 (10), 3151-3162 (1996).
  26. Dai, X. -. M., Ryan, G. R., et al. Targeted disruption of the mouse colony-stimulating factor 1 receptor gene results in osteopetrosis, mononuclear phagocyte deficiency, increased primitive progenitor cell frequencies, and reproductive defects. Blood. 99 (1), 111-120 (2002).
  27. Gowen, M., Lazner, F., et al. Cathepsin K knockout mice develop osteopetrosis due to a deficit in matrix degradation but not demineralization. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (10), 1654-1663 (1999).
  28. Faccio, R., Takeshita, S., Zallone, A., Ross, F. P., Teitelbaum, S. L. c-Fms and the αvβ3 integrin collaborate during osteoclast differentiation. Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 749-758 (2003).
  29. Kim, N., Takami, M., Rho, J., Josien, R., Choi, Y. A novel member of the leukocyte receptor complex regulates osteoclast differentiation. The Journal of Experimental Medicine. 195 (2), 201-209 (2002).
  30. Mahalingam, M. Laser Capture Microdissection: Insights into Methods and Applications. Methods in Molecular Biology. 11723, 1-17 (2018).
  31. Goldsworthy, S. M., Stockton, P. S., Trempus, C. S., Foley, J. F., Maronpot, R. R. Effects of fixation on RNA extraction and amplification from laser capture microdissected tissue. Molecular Carcinogenesis. 25 (2), 86-91 (1999).
  32. Clément-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
  33. Farris, S., Wang, Y., Ward, J. M., Dudek, S. M. Optimized method for robust transcriptome profiling of minute tissues using laser capture microdissection and low-input RNA-seq. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 185 (2017).
  34. Espina, V., Heiby, M., Pierobon, M., Liotta, L. A. Laser capture microdissection technology. Expert Review of Molecular Diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).
  35. Martuscello, R. T., Louis, E. D., Faust, P. L. A stainless protocol for high quality RNA isolation from laser capture microdissected Purkinje cells in the human post-mortem cerebellum. Journal of Visualized Experiments. (143), (2019).
  36. Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection. BMC Cell Biology. 11 (95), (2010).
  37. Takahashi, N., Tarumi, W., Hamada, N., Ishizuka, B., Itoh, M. T. Cresyl violet stains mast cells selectively: Its application to counterstaining in immunohistochemistry. Zoological Science. 34 (2), 147-150 (2017).
  38. Sheldon, A. R., Almli, L., Ferriero, D. M. Copper/zinc superoxide dismutase transgenic brain in neonatal hypoxia-ischemia. Methods in Enzymology. 353, 389-397 (2002).
  39. Kolijn, K., Van Leenders, G. J. L. H. Comparison of RNA extraction kits and histological stains for laser capture microdissected prostate tissue. BMC Research Notes. 9, 17 (2016).
  40. Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
  41. Filliers, M., et al. Laser capture microdissection for gene expression analysis of inner cell mass and trophectoderm from blastocysts. Analytical Biochemistry. 408 (1), 169-171 (2011).
  42. Vandewoestyne, M., et al. Laser capture microdissection: Should an ultraviolet or infrared laser be used?. Analytical Biochemistry. 439 (2), 88-98 (2013).
  43. Ayturk, U. RNA-seq in skeletal biology. Current Osteoporosis Reports. 17 (4), 178-185 (2019).
  44. Van Den Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
  45. Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: A molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
  46. Chen, J., et al. Spatial transcriptomic analysis of cryosectioned tissue samples with Geo-seq. Nature Protocols. 12 (3), 566-580 (2017).

Play Video

Cite This Article
Wu, M., Kriti, D., van Bakel, H., Jabs, E. W., Holmes, G. Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis. J. Vis. Exp. (154), e60503, doi:10.3791/60503 (2019).

View Video