Summary

Microdissection de capture laser du cartilage embryonnaire de souris et de l'os pour l'analyse d'expression génique

Published: December 18, 2019
doi:

Summary

Ce protocole décrit la microdissection de capture de laser pour l’isolement du cartilage et de l’os des sections congelées fraîches de l’embryon de souris. Le cartilage et l’os peuvent être rapidement visualisés par la coloration violette de cresyl et rassemblés précisément pour produire l’ARN de haute qualité pour l’analyse transcriptomique.

Abstract

La microdissection de capture au laser (LCM) est un outil puissant pour isoler des types de cellules ou des régions d’intérêt spécifiques des tissus hétérogènes. La complexité cellulaire et moléculaire des éléments squelettiques augmente avec le développement. L’hétérogénéité tissulaire, comme à l’interface des éléments cartilagineux et osseux les uns avec les autres ou avec les tissus environnants, est un obstacle à l’étude du développement du cartilage et des os. Notre protocole fournit une méthode rapide de traitement des tissus et l’isolement du cartilage et des os qui donne un ARN de haute qualité pour l’analyse de l’expression génique. Les tissus congelés frais des embryons de souris sont sectionnés et de brèves taches violettes cresyl est utilisée pour visualiser le cartilage et les os avec des couleurs distinctes des tissus environnants. Les glissements sont alors rapidement déshydratés, et le cartilage et l’os sont isolés par la suite par LCM. La minimisation de l’exposition aux solutions aqueuses au cours de ce processus maintient l’intégrité de l’ARN. Le cartilage et l’os mandibulaire de Mouse Meckel à E16.5 ont été avec succès rassemblés et l’analyse d’expression de gène a montré l’expression différentielle des gènes de marqueur pour des ostéoblastes, des osteocytes, des osteoclastes, et des chondrocytes. L’ARN de haute qualité a également été isolé à partir d’une gamme de tissus et d’âges embryonnaires. Ce protocole détaille la préparation de l’échantillon pour le LCM, y compris la cryoembedding, le sectionnement, la coloration et la déshydratation des tissus frais congelés, et l’isolement précis du cartilage et de l’os par LCM ayant pour résultat l’ARN de haute qualité pour l’analyse transcriptomique.

Introduction

Le système musculo-squelettique est un système multicomposant composé de muscle, tissu conjonctif, tendon, ligament, cartilage et os, innervé par les nerfs et vascularisé par les vaisseaux sanguins1. Les tissus squelettiques se développent avec l’hétérogénéité cellulaire croissante et la complexité structurale. Le cartilage et l’os se développent à partir de la même lignée osteochondroprogenitor et sont fortement liés. Le cartilage et l’os embryonnaires se développent en association avec des muscles, des nerfs, des vaisseaux sanguins, et le mésenchyme indifférencié. Le cartilage peut également être entouré par l’os, tel que le cartilage de Meckel et le cartilage condylar dans l’os mandibulaire. Ces tissus sont anatomiquement associés et interagissent les uns avec les autres par des signaux extracellulaires au cours du développement. Dans l’étude de l’expression génique dans le développement du cartilage et de l’os, un obstacle est l’hétérogénéité des structures squelettiques composées de plusieurs types de tissus. L’isolement précis du tissu spécifique d’intérêt est la clé pour l’analyse transcriptionnelle réussie.

La microdissection de capture au laser (LCM) est un outil puissant pour isoler les types de cellules ou les régions d’intérêt dans les tissus hétérogènes, et est reproductible et est sensible au niveau cellulaire unique2. Il peut précisément cibler et capturer des cellules d’intérêt pour un large éventail d’essais en aval dans la transcriptomique, la génomique et la protéomique3,4. La qualité de l’ARN, de l’ADN ou de la protéine isolés peut être évaluée à l’aide d’un bioanalyseur ou d’une plate-forme équivalente. Par exemple, la qualité de l’ARN est indiquée par le numéro d’intégrité de l’ARN (RIN)5.

Ici, nous fournissons un protocole pour la coloration rapide et l’isolement du cartilage et de l’os par LCM des tissus congelés frais. Nous utilisons l’embryon de souris pour démontrer que ce protocole donne de l’ARN de haute qualité pour l’analyse transcriptomique ultérieure, comme le séquençage de l’ARN (ARN-seq).

Protocol

Les tissus de souris ont été obtenus conformément au National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, et les protocoles d’étude ont été approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’École de médecine Icahn du Mont Sinaï. 1. Préparation de spécimens congelés frais Disséquer l’embryon ou le tissu d’intérêt. Intégrer l’échantillon dans un moule d’intégration jetable avec une température de coupe opti…

Representative Results

Des sections coronales des tissus congelés frais de souris à E16.5 ont été employées pour démontrer l’isolement et la collection du cartilage de Meckel (MC), du cartilage condylar, et de l’os mandibulaire par LCM. Les embryons de souris à E16.5 ont été disséqués et incorporés dans des moules cryogéniques avec composé d’OCT. Les échantillons dans les moules ont été rapidement congelés dans un bain de glace sèche et de méthyl-2-butane et stockés à -80 oC. Pour démontrer la…

Discussion

LCM permet l’isolement des populations cellulaires enrichies ou homogènes des tissus hétérogènes. Ses avantages incluent la capture rapide et précise des cellules dans leur contexte in vivo, tandis que les inconvénients potentiels incluent qu’il est long, coûteux, et limité par la nécessité pour l’utilisateur de reconnaître les sous-populations distinctes dans un échantillon spécifié30. Ce protocole fournit des détails de LCM du cartilage embryonnaire de souris et de l’os, …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par le National Institute of Dental and Craniofacial Research (R01DE022988) et l’Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (P01HD078233). Les auteurs remercient le Biorepository and Pathology Core pour l’accès à la plate-forme Leica LMD 6500 à l’école de médecine Icahn à Mount Sinai.

Materials

2-Methylbutane ThermoFisher Scientific O3551-4
Bioanalyzer Agilent G2939BA
Centrifuge tube ThermoFisher Scientific 339653 Conical sterile polypropylene centrifuge tubes, 50 mL
Cresyl violet acetate Sigma-Aldrich C5042
Cryostat Leica Biosystems CM3050 S
Delicate task wiper ThermoFisher Scientific 06-666
Disposable embedding mold ThermoFisher Scientific 1220
Distilled water Invitrogen 10977-015 DNase/RNase-Free
Ethanol, absolute (200 proof) ThermoFisher Scientific BP2818 Molecular biology grade
Glass PEN membrane slide Leica Microsystems 11505158
LCM system Leica Microsystems Leica LMD6500
Microscope cover glass ThermoFisher Scientific 12-545FP
Microscope slides ThermoFisher Scientific 12-550-15
OCT compound Electron Microscopy Sciences 102094-106
PCR tube with flat cap, 0.5 mL Axygen PCR-05-C LCM collection tubes
Permanent mounting medium Vector Laboratories H-5000
RNA isolation kit ThermoFisher Scientific KIT0204
RNase decontamination agent Sigma-Aldrich R2020 RNase decontamination agent for cleaning surfaces
Xylene Sigma-Aldrich 214736

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Cite This Article
Wu, M., Kriti, D., van Bakel, H., Jabs, E. W., Holmes, G. Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis. J. Vis. Exp. (154), e60503, doi:10.3791/60503 (2019).

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