Summary
このプロトコルは、マウス胚の新鮮な凍結切片から軟骨および骨を分離するためのレーザー捕捉マイクロセクションを記述する。軟骨および骨はクレシルバイオレット染色によって急速に視覚化され、正確に集めることができるので、トランスクリプト工学的分析のための高品質のRNAを得ることができます。
Abstract
レーザー捕捉マイクロダイセクション(LCM)は、異種組織から目的の特定の細胞タイプまたは領域を分離するための強力なツールです。骨格要素の細胞および分子複合体は、発達とともに増加する。軟骨および骨の界面や周囲の組織との界面など、組織の不均一性は、軟骨および骨を発達させる研究の障害の1つである。当社のプロトコルは、遺伝子発現解析のための高品質RNAを生み出す軟骨および骨の組織処理および単離の迅速な方法を提供します。マウス胚の新鮮な凍結組織は切り離され、短いクレシルバイオレット染色は、周囲の組織とは異なる色で軟骨および骨を視覚化するために使用される。その後、スライドは急速に脱水され、軟骨と骨はLCMによってその後単離される。このプロセス中の水溶液への暴露の最小化は、RNAの完全性を維持します。E16.5におけるマウスメッケルの軟骨と下顎骨の採取に成功し、遺伝子発現解析により骨芽細胞、骨細胞、破骨細胞、軟骨細胞のマーカー遺伝子の微分発現が示された。高品質のRNAはまた、組織および胚性年齢の範囲から単離された。このプロトコルは、低温栓、断面、染色および脱水新鮮な凍結組織を含むLCMのサンプル調製、およびLCMによる軟骨および骨の正確な分離を詳細に説明し、転写分析のための高品質RNAをもたらす。
Introduction
筋骨格系は、筋肉、結合組織、腱、靭帯、軟骨、および骨からなる多成分系であり、神経によって内在し、血管1によって血管化される。骨格組織は、細胞の不均一性と構造的複雑さの増加に伴って発症する。軟骨と骨は、同じ骨軟骨葉ゲニター系統から発症し、非常に関連しています。胚軟骨と骨は、筋肉、神経、血管、未分化間感に関連して発症する。軟骨はまた、メッケルの軟骨や下顎骨内の軟骨軟骨などの骨に囲まれていてもよい。これらの組織は解剖学的に関連しており、発達中に細胞外シグナルを介して互いに相互作用する。軟骨および骨の発達における遺伝子発現の研究において、1つの障害は、複数の組織型からなる骨格構造の不均一性である。目的の特定の組織の正確な分離は、転写分析を成功させるために重要です。
レーザー捕捉マイクロダイセクション(LCM)は、異種組織内の目的の細胞の種類または領域を分離するための強力なツールであり、再現性があり、単一細胞レベル2に敏感である。これは、トランスクリプトミクス、ゲノミクス、およびプロテオミクス3、4における幅広い下流アッセイに対して目的の細胞を正確に標的にし、捕捉することができる。単離されたRNA、DNA、またはタンパク質の品質は、バイオアナライザまたは同等のプラットフォームで評価することができます。例えば、RNA品質は、RNA完全性数(RIN)5で示される。
ここでは、新鮮な凍結組織からのLCMによる軟骨および骨の迅速な染色および単離のためのプロトコルを提供する。マウス胚を使用して、このプロトコルがRNAシーケンシング(RNA-seq)などの後続のトランスクリプトミクス解析のために高品質のRNAを生成することを実証します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
マウスからの組織は、実験動物のケアと使用のための国立衛生ガイドに従って取得され、研究プロトコルは、マウントシナイのイカーン医学部の制度的動物ケアと使用委員会によって承認されました。
1. 新鮮な冷凍標本の調製
- 目的の胚または組織を解剖する。最適な切断温度(OCT)化合物を使用して、使い捨て埋め金型にサンプルを埋め込みます。先端または針で試料の向きを調整します。
- ドライアイス/メチル-2-ブタン浴でサンプルを急速に凍結します。次のステップに進むか、-80 °Cで保存します。
注:プロトコルはここで一時停止できます。
2. レーザー捕捉マイクロダイセクション用クライオセクション
- 70%エタノールでクライオスタットときれいな内部表面を解凍します。RNase除染剤でアンチロールプレートと鉗子のペアを処理します。クライオスタットを所望の切断温度(-18~-22°C)に設定します。ドライアイスで蓋付き容器を準備し、凍結切除中に断面サンプルスライドを一時的に保管するために、ドライアイスにアルミニウム箔のシートを置きます。
注意:ドライアイスは非常に寒いです。ドライアイスは常に注意して取り扱い、取り扱う時は必ず絶縁手袋を着用してください。 - 新鮮な冷凍試料をドライアイスのバケツに移します。OCT化合物の層をクライオスタット標本ホルダーの上に置き、直ちに優しい圧力でOCTの上に標本を置きます。OCTが完全に凍結したら、ホルダーを試料でクライオスタット切断アームに固定します。
- サンプルをクライオスタットに15分間残して、切断温度に平衡化します。
- 組織をセクションし、12μmの厚さでポリエチレンナフタレート(PEN)膜スライド上のスライスを収集します。膜上で連続した断面を揃えます。1つのスライドが完了したら、セクションを数分間乾燥させ、必要なスライドがすべて収集されるまでドライアイス容器内のホイルにスライドを移します。
- スライドを -80 °C のスライド ボックスに保管します。
注:セクションの厚さは、組織の効率的な切断を可能にしながら、収集された組織の量を最大化するために選択され、および目的の組織によって異なる場合があります。プロトコルはここで一時停止できます。スライドを RNase 汚染から解放します。温度変化を避けてください。最大 6 か月間保存されたスライドからの RNA の RIN は、まだ RNA の高品質を示している可能性がありますが、できるだけ早くスライドを使用することをお勧めします。
3. レーザーキャプチャマイクロダイズセクションのサンプル調製
- 染色および脱水のための解決策を準備する。
- 氷上の3つの50 mL遠心管のそれぞれに80%エタノールの45 mLを置きます。#1、#2、#3としてラベル付けします。RNase/DNaseフリーウォーターでエタノールを希釈します。
- 氷上の50 mL遠心管に95%エタノールの45 mLを入れます。
- 氷上の50 mL遠心管に100%エタノールの45 mLを入れます。
- 室温で50mL遠心管にキシレン45mLを入れます。
注意:キシレンはヒュームフードに使用する必要があります。
- PEN膜スライドを手袋の手に当てて簡単に解凍し、50 mL遠心管で攪拌を加えて80%エタノール(#1および#2)の45 mLでそれぞれ30sを2回洗浄し、OCTを除去します。
注:染色前にOCTを除去し、染色中にOCTが緩むのを防ぎ、切片を隠さないようにすることが重要です。鉗子は攪拌によって洗い流されないOCTの除去を促進するために使用することができる。 - アルミ箔のシートにスライドを敷きます。ピペット 0.8 mL 0.1% クレシルバイオレットを 50% エタノールでスライドに上し、30 s の染色を行い、スライドを 80% エタノール (#3) の 45 mL で 30 s で 30 s に洗浄し、次に 95% エタノール、100% エタノール、およびキシレンを 50 mL セントリフュージ チューブで 30 s ずつ 30 mL ずつ脱水します。
- キシレンとドライセクションを排出するために5分間繊細なタスクワイパーにスライドを立ちます。
注:スライドはLCMの前に完全に乾燥する必要があります。
4. レーザーキャプチャマイクロダイセクション
注:LCMを行いながら、粉末フリーのニトリル手袋を着用してください。
- LCM顕微鏡、レーザー、およびコンピュータの電源を入れます。コンピュータにログオンし、ソフトウェアを起動します。キーを「オン」の位置に回してレーザーを起動します。緑色のライト(レーザー)が点灯したら、赤いボタンを押してレーザーを作動させ、レーザーが使用する準備ができていることを示す光(レーザー)が赤色に変わります。
注:レーザーは、ウォームアップに約10分を必要とします。 - 回収管を設定します。
- 0.5 mLポリメラーゼ連鎖反応(PCR)チューブのキャップをコレクターに挿入します。
注:目的の PCR チューブ(0.2 または 0.5 mL)の一致するコレクターを選択します。 - ピペット50μLの抽出緩衝液(材料の表に記載されたRNA分離キットによって提供される)を0.5 mL回収管のキャップに入れた。
- 回収装置を顕微鏡に挿入します。
- 「コレクター・デバイスの変更」ウィンドウで、「参照ポイントに移動」ボタンをクリックして、コレクターを基準点(RP)に移動します。RP をはっきりと表示するようにフォーカスを調整します。矢印をクリックして RP をビューの中央に移動します。
- 0.5 mLポリメラーゼ連鎖反応(PCR)チューブのキャップをコレクターに挿入します。
- 積み込み標本スライド。
- ツールバーの左の[アンロード]ボタンをクリックして、スライドホルダーを下げます。
- 組織部を下向きにして、スライドをホルダーに入します。
注:この向きは捕獲されたティッシュセクションが重力によって集出管の帽子に落ちるように保障する。 - ホルダーをステージに挿入し直します。
- レーザー パラメータを設定します。
- レーザーメニューの[コントロール]オプションを選択するか、[レーザー ]アイコンをクリックします。
- 必要に応じてこれらのパラメータを調整する:パワー、レーザーのパワー。絞り、レーザーの幅;と速度、描画とカットモードでの切断の速度。
注:対象外の領域でレーザーをテストします。より高い力またはより大きい開口部は切り取りが容易になるが、細胞に多くの損傷を引き起こす。力、絞り、および速度の組み合わせを調整して、組織の効率的な切断と最小限の損傷を得る。たとえば、12 μm セクションの軟骨組織の場合、Power = 40、絞り = 5、速度 = 7 です。
- 対象領域を選択して切り取ります。
- 5倍の目標から始めて関心のある領域を見つけ、関心のある領域を最もよく示す目標 (5x、10x、または 40x) に切り替えます。
注:クレシルスミレ染色後、軟骨はマゼンタに染色され、ミネラル化された組織は茶色または黒色に見え、他の組織と区別できる。イメージは、[ファイル]メニューの [名前を付けてイメージを保存]を使用して保存できます。 - コレクターのマークをクリックして、収集するチューブ(A、B、C、D)を選択します。
- [移動] を選択し、[切り取り] または [描画して切り取り] を選択します。移動およびカットモードでは、マウスまたはタッチスクリーンペンを使用して形状をフリーハンドで描画し、標本を手動でカットします。描画モードと切り取りモードでは、後続の切り取りのためにマウスまたはタッチスクリーン ペンを使用して図形をフリーハンドで描画できます。[カットの開始]ボタンをクリックして、レーザー切断を開始します。
- カットが完了すると、PEN膜を有する標的組織は重力によって回収管のキャップに落ちる。必要に応じて、4.5 を繰り返して複数の対象エリアをプールします。
注:不完全な切断のために組織が回収管のキャップに落ちない場合は、切り傷を繰り返したり、パワーや絞りを増やしたりする必要があります。ミネラル化された骨(茶色または黒)はレーザーで直接切断することはできません。
- 5倍の目標から始めて関心のある領域を見つけ、関心のある領域を最もよく示す目標 (5x、10x、または 40x) に切り替えます。
- コレクターをアンロードし、PCRチューブを慎重に閉じます。マイクロセク剖された組織をドライアイスに入れ、次のステップに進むか、-80 °Cで保存します。
注:プロトコルはここで一時停止できます。次のサンプルについては、4.2 ~ 4.6 を繰り返します。
5. 微分組織のライシスとRNA単離
- マイクロセ剖した組織を室温で解凍します。遠心分離機を短時間でインキュベートし、42°Cで30分間サンプルをインキュベートします。
- インキュベーション後、lysisバッファーを0.5 mL PCRチューブにスピンダウンします。RNA分離キットを使用してDNase処理とRNA抽出を実行します(材料表を参照)。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
E16.5の新鮮な凍結マウス組織のコロナセクションは、メッケル軟骨(MC)、結節軟骨、およびLCMによる下顎骨の分離および採取を実証するために使用された。E16.5のマウス胚を解剖し、OCT化合物で極低温型に埋め込んだ。金型中のサンプルをドライアイスおよびメチル-2-ブタン浴中で急速に凍結し、-80°Cで保存した。
軟骨および骨のクレシルスミレ染色を実証するために、コロナ面での凍結切除を行い、顕微鏡スライド上でサンプルを採取した。上記のプロトコルに従って切片を洗浄、染色、脱水した(ステップ3.2~3.4)。スライドを空気乾燥し、永久取り付け媒体で取り付けた。検査したすべての軟骨は、染色マゼンタ(MC、顆粒軟骨、鼻中隔軟骨、肋軟骨、前駆骨の軟骨原始、半径および尺骨の軟骨原始)であり、すべてのミネラル化された組織は茶色または黒色に染色された(図1A-E)。軟骨と骨の両方が、複数の解剖学的部位で他の組織と容易に区別された。
LCMの場合、E16.5の胚の頭部を12μmの厚さでPEN膜スライド上のコロナプレーンに切り分け、スライドごとに6~8個の連続したセクションを集め、-80°Cで保存した。OCTを除去し、切片をクレシルバイオレットで染色し、上記のプロトコルに従って脱水した(ステップ3.2~3.4)。MC、コンダイラー軟骨、および下顎骨領域を選択し、LCMにより単離した(図2)。選択された領域は、回収管のキャップ内のリシスバッファーにドロップしました。シーケンシングに十分なRNAを得るために、MCの10領域、10の角膜軟骨の10領域、または下顎骨の4つの領域をそれぞれ1つのサンプルとして各回収管にプールしました。
RNAは、メーカーの指示に従ってRNA分離キットを使用して抽出した。総RNAをバイオアナライザを用いて分析した(図3A-B)。クレシルスミレ染色がRNAの品質に及ぼす影響を調べた場合、クレシルバイオレットで染色した下顎骨サンプルのRNAと染色せずに試料を比較した(染色せずにミネラル化した組織は目に見えるが、クレシルバイオレット染色は周囲の組織と骨を区別する視認性を高める)。染色されたサンプル(n=4)と染色しないサンプル(n=4)との間に有意な差は認められなかったが、このプロトコルにおけるクイッククレシルスミレ染色がRNA品質に有意でない影響を及ぼすことを示す(P=0.858、両側ウェルチのt検定、図3C)。我々は、異なる発達段階で様々な組織のLCMに対するプロトコルを使用し、RINを測定し、高いRNA品質を示す(図3D)。MCからのRNAの平均収率、コンダイラー軟骨、下顎骨は7.50±1.45ngであった。 12.55 ± 2.75 ng、および 33.02 ± 7.63 ng (図 3E) と収率/面積は 19.73 ± 3.82 ng/mm2, 26.70 ± 5.84 ng/mm2, 17.23 ± 3.98 ng/mm2, (図 3 F)P = 0.383; 軟骨軟骨対下顎骨, P = 0.260;MC 対 下顎骨, P = 0.674).
ライブラリを準備し、前に説明したように順序付け6,7.代表的なcDNAサイズは約500bpであった(図4A)。RNA-seqデータはマルチQC8で分析した。我々は、18 LCMサンプル(MC1-6、メッケルの軟骨;)C1-6, コンジラー軟骨;M1-6、下顎骨)。読み取りの各基本位置の平均品質値は FastQC によって生成され、非常に良好な品質のコールを示します (図 4B)。読み取りアライメントをピカールで分析しました (図 4C)。読み取りは高い整列パーセンテージを示し、整列された読み取りの平均パーセンテージは75%でした。遺伝子カバレッジをピカール(図4D)で分析し、5'から3'末端までの転写物に沿って良好な表現を示した。
微分遺伝子発現解析を行った6、7.下顎骨とMCとの間に有意に微分発現された4,006個の遺伝子(P< 0.05)があった(図5A)。骨芽細胞または骨細胞に特異的な遺伝子(Col1a1 9、Col1a210、Dkk111、Dmp1 12、Dstn 13、Runx2 14、Sp7 15、およびSparc16)は、MCと比較して下顎骨においてより高発現し、軟骨細胞特異的遺伝子(Acan17、Cola2a18、 Col9a220,Col9a3 21,Comp 22,Lect1 23,およびSox524)は、MCにおいて下顎骨と比較してより高発現していた(図5B及び表1)。さらに、Acp525、Csf1r 26、Ctsk 27、Itgb3 28、およびOscar29などの破骨細胞マーカーは、MC(図5Bおよび表1)と比較して下顎骨においてより高発現として同定され、標的組織の分離に成功したことを示す。
図1:E16.5におけるマウス胚の冠状片に軟骨および骨の代表的なクレシルスミレ染色。(A)メッケルの軟骨とヘミカン。(B)メッケルの軟骨、軟骨、軟骨、およびヘミカンド。(C) 鼻中隔と上顎。(D) プレフェノイド骨およびパラチネ骨の軟骨原始。(E)半径の軟骨原始、ウルナの軟骨プリモルジウム、および肋軟骨。C = コンジラー軟骨;CC = 肋骨軟骨;CP = プレフェノイド骨の軟骨プリモルジウム;M = ヘミマンディブル;MC = メッケルの軟骨;MX = マキシラ;NS = 鼻中隔;PL = 口蓋骨;R = 半径の軟骨プリモルジウム;U = ウルナの軟骨原始。スケール バー = 200 μm.ここをクリックすると、この図の大きなバージョンが表示されます。
図2:LCMによって単離され、RNA-seqのために採取された代表的領域。(A から C)代表的な染色MC(A)、コンジラー軟骨(B)、およびMcとのヘミマンダブルは、LCMの前に凍結切除で既に単離された(C)。(D-F)標的組織後のA、B、Cの領域をLCMにより単離した。スケール バー = 200 μm.ここをクリックすると、この図の大きなバージョンが表示されます。
図3:LCMサンプルのRNA品質と量(A-B)代表的なエレクトロフェログラム(A)および関連するゲル画像(B)を下顎骨試料に対するバイオアナライザから。(C)クレシルバイオレット(n=4)または染色なし(n=4)で染色された下顎骨サンプルからの全RNAのRN。(D)LCMによって単離された異なる組織からの全RNAのRIN。E16.5でのメッケルの軟骨(n = 6);E16.5 (n = 6) でのコンジラー軟骨;E16.5の下顎骨(n = 6);E14.5 (n = 6) での鼻中隔軟骨;E14.5の脳 (n = 6);E16.5の脳 (n = 7);E18.5の脳(n = 4)。(E)3つの組織からの全RNAの収率。各MCまたはコンジラー軟骨サンプルは、軟骨の10個のマイクロ分離領域のプールであり、下顎骨の各サンプルは、ヘミマンダブルの4マイクロセクド領域のプールであった。(F) 各組織における単位面積当たりの収率(ng/mm2)。データは平均± s.e.m.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4: LCM サンプルから生成されたライブラリーおよび RNA-seq データの品質(A)バイオアナライザによって決定された下顎骨試料からのライブラリーの代表的なcDNAサイズ。(B-D)18 LCMサンプルからのRNA-セクの品質管理分析(MC1-6、メッケル軟骨;C1-6, コンジラー軟骨;M1-6,下顎骨)によりマルチQC。(B) 読み取りの各基本位置の平均品質値は FastQC によって生成されました。グラフの背景は、y 軸を非常に良い品質の呼び出し (緑)、合理的な品質 (オレンジ) の呼び出し、および低品質 (赤) の呼び出しに分割します。(C) 読み取りのアライメントをピカールで分析した。要約は、整列された読み取りのパーセンテージとして表示されます。(D)ピカールで分析した正規化された遺伝子カバレッジ。プロットは、5'端(左)から3'終端(右)までのトランスクリプトに沿った相対平均カバレッジを示します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:LCMにより分離された下顎骨およびMCからのRNA-セクデータの微分発現解析(A)下顎骨とMCとの間に有意に微分発現された4,006個の遺伝子の階層クラスタリング(P< 0.05)。各組織に3つの生物学的複製が用いられた。M1-3, 下顎骨;MC1-3, MC. (B)下顎骨とMCとの間で微分発現遺伝子の折り変えとP値を示す火山プロットが示されている:青の骨芽細胞および骨細胞マーカー、緑色の骨細胞マーカー、および赤色の軟骨細胞マーカー。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 遺伝子 | セルの種類 | ログ2フォールドチェンジ | 平均式 | 調整済み P 値 |
| Col1a1 | 骨芽細胞/骨細胞 | 2.64 | 12.94 | 2.22E-05 |
| Col1a2 | 骨芽細胞/骨細胞 | 3.41 | 12.87 | 8.27E-07 |
| Dkk1 | 骨芽細胞/骨細胞 | 7.59 | 2.01 | 5.21E-03 |
| Dmp1 | 骨芽細胞/骨細胞 | 9.73 | 3.42 | 3.19E-04 |
| Dstn | 骨芽細胞/骨細胞 | 2.51 | 6.87 | 5.73E-07 |
| Runx2 | 骨芽細胞/骨細胞 | 1.24 | 8.62 | 4.08E-02 |
| Sp7 | 骨芽細胞/骨細胞 | 2.24 | 6.95 | 5.81E-03 |
| Sparc | 骨芽細胞/骨細胞 | 3.40 | 12.26 | 5.56E-09 |
| Acp5 | 破 骨 細胞 | 3.38 | 5.74 | 6.46E-06 |
| Csf1r | 破 骨 細胞 | 2.01 | 5.80 | 1.17E-04 |
| Ctsk | 破 骨 細胞 | 3.19 | 7.56 | 5.73E-07 |
| イットグ3 | 破 骨 細胞 | 2.88 | 5.37 | 2.43E-04 |
| オスカー | 破 骨 細胞 | 3.41 | 2.67 | 1.63E-04 |
| アカン | 軟骨 細胞 | -5.23 | 5.01 | 2.76E-04 |
| Col2a1 | 軟骨 細胞 | -3.61 | 9.47 | 3.29E-03 |
| コル9a1 | 軟骨 細胞 | -7.01 | 3.58 | 5.51E-03 |
| コル9a2 | 軟骨 細胞 | -5.40 | 3.76 | 2.60E-03 |
| コル9a3 | 軟骨 細胞 | -6.63 | 3.80 | 2.90E-02 |
| 作曲 | 軟骨 細胞 | -5.86 | 1.54 | 7.51E-03 |
| レクト1 | 軟骨 細胞 | -7.37 | 1.34 | 2.35E-02 |
| Sox5 | 軟骨 細胞 | -2.88 | 4.43 | 6.06E-04 |
表1:様々な細胞型の骨および軟骨における既知の遺伝子の微分発現(下顎骨対MC)。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
LCMは、異種組織からの濃縮または均質な細胞集団の単離を可能にする。その利点は、その生体内文脈における細胞の迅速かつ正確な捕捉を含むが、潜在的な欠点は、時間がかかり、費用がかかり、かつ、ユーザが指定されたサンプル30内の個別の部分集団を認識する必要性によって制限されることを含む。このプロトコルは、マウス胚軟骨および骨のLCMの詳細を提供し、RNA-seqによるその後の分析のために高いRNA完全性を維持しながら、正確な組織採取のために軟骨および骨を可視化する迅速な手順でクレシルスミレ染色の使用を強調する。このプロトコルの1つの制限は、ここで使用されるLCMシステムがミネラル化された組織(例えば、図2Cの黒色の下顎組織)を直接切断することができないことです。その結果、骨領域全体を解剖する必要があります。特に、LCMによって単離された微分化されたオセジ化領域は均質ではなく、骨芽細胞、骨細胞、および破骨細胞の少なくとも亜集団を含む(表1)。それにもかかわらず、LCMによる濃縮は、我々の以前の研究が、微小分離骨組織中の破骨細胞のような特定の部分集団の転写変化がRNA-seq6によってまだ検出できることを示しているので、貴重である。
遺伝子発現解析では、高いRNA品質と歩留まりを得るためのサンプル調製とLCM手順を最適化しました。私たちのプロトコルは、新鮮な凍結組織から始まります。新鮮な凍結組織切片は、抽出されたRNA3の優れた量および品質を可能にし、mRNAは固定31の標準的な方法に敏感である。RNAはRNase汚染によって迅速に劣化し、サンプル調製、LCM、およびRNA分離を通じてRNaseフリー環境のメンテナンスがアプリケーションを成功させるために不可欠です。断面処理中の水への暴露は、RNA品質31、32に有害である。当社のプロトコルは、クレシルバイオレット染色中に最高レベルの水性暴露で、このような暴露を制限します。50%エタノール中の0.1%クレシルバイオレットによる迅速な染色(30s)は軟骨に区別可能な色を与え、低入力RNA-seqなどの下流分析のためのRNA完全性を低下させないことをテストしました(図3Cおよび図4)。収率/面積(ng/mm2)は約20ng/mm2(図3F)であり、以前の最適化された方法33と同様または高い。MCおよび下顎骨6の細胞密度によれば、このプロトコルでは、1つの細胞からの平均収量は細胞当たり約5pg RNAであり、総RNAの1〜5ngは200〜1,000細胞から抽出することができ、低入力RNA-seq6、7、33に使用できると推定される。この歩留まり効率は、確立されたLCM法34よりもはるかに高く、また、最近最適化されたプロトコル33、35に優れているか、または類似している。
組織学的セクションの異なる細胞型を区別する能力は、目的の特定の組織の正確な収集に不可欠です。クレシルバイオレットは、親水性、負に帯電した核酸36に結合する塩基性染色である。この性質は、細胞型選択性37での染色に対して有用であり、ニューロン38のための標準的な組織学的染色である。クレシルバイオレットは、様々な組織のためにLCMで使用されており、良好な組織形態および高RNA品質33、36、39、40を提供する。他の染色方法と比較して、クレシルバイオレット染色は、細胞質および核の詳細、および低RNA分解率32を提供する。ここでは、クレシルスミレ染色は軟骨と骨を可視化する簡単かつ迅速な方法であり、この方法で染色された組織は高いRNA完全性を保存することを実証する。キシレン処理は、LCM35、36、41、42の前に組織の脱水に一般的に使用される。特にプレーンガラススライドほど光学的に明らかでないPEN膜スライドでは、標的組織を区別するために不可欠な組織形態35の可視化を強化するためにキシレンを使用しています。OCTを除去する攪拌であっても、染色および洗浄工程中にPENスライドからのセクション損失の有意な発生は見つかりませんでした。
マイクロ液滴またはマイクロ流体ベースの単一細胞RNA-seq(scRNA-seq)は、異種細胞型を有する組織の転写物を分析するハイスループット法であり、骨格生物学43で使用され始めている。LCMとは対照的に、scRNA-seqは、単一細胞への組織の酵素および/または機械的崩壊を伴う。単一細胞調製のためのほとんどのプロトコルは、トランストランスクリプト44、45を変化させる室温または37°Cで組織をインキュベートする必要があります。さらに、軟骨および骨における単一細胞の単離は、細胞化および鉱化の骨格元素の複雑さによって物理的に制限され得る。生体内の組織の細胞多様性を正確に代表する骨格組織から十分な数の生存細胞を分離することは依然として技術的な課題であり、細胞の不完全な解離は、細胞タイプ43の検出に偏りを引き起こす可能性がある。scRNA-seqは異なる細胞タイプの同定を可能にしますが、シーケンシング深さは低く、典型的なシーケンスアプローチは3'のトランスクリプトエンドをキャプチャし、代替スプライシング分析を許可しません。LCM由来組織のバルクRNA-セクは、細胞の違いを均質化しますが、包括的な転写検出と代替スプライシング分析を可能にします。したがって、LCMは、周囲の組織や内部的に複雑な組織から容易に分離できない骨格組織に特に有用であり、組織の新鮮な凍結製剤は、転写プロファイルと転写分析のためのRNA完全性の両方を保存することができる。scRNA-seqのもう一つの弱点は、単一細胞調製後に細胞の空間情報が失われることです。LCMとscRNA-seqの組み合わせは、LCMを利用して地域化された遺伝子発現を研究する別のアプローチである、定義された地理的位置(Geo-seq)46からの小さなサンプルの転写物の研究を可能にするために開発されました。
要約すると、このプロトコルは、軟骨および骨の最適化されたLCMの詳細を提供し、RNA-seqによるその後の分析のために高いRNA完全性を維持しながら、正確な組織採取のために軟骨および骨を可視化する迅速な手順でクレシルスミレ染色の使用を強調する。このプロトコルは、遺伝子発現解析6、7のための異なる発達段階で軟骨および骨のLCMに正常に使用され、また他の組織にも使用することができる。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者たちは何も開示する必要はない。
Acknowledgments
この研究は、国立歯科・頭蓋顔面研究所(R01DE022988)とユーニス・ケネディ・シュリバー国立小児保健・人間開発研究所(P01HD078233)によって支援されました。著者らは、シナイ山のイカーン医学部のライカLMD 6500プラットフォームへのアクセスに対するバイオリポジトリと病理学コアに感謝する。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Methylbutane | ThermoFisher Scientific | O3551-4 | |
| Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | |
| Centrifuge tube | ThermoFisher Scientific | 339653 | Conical sterile polypropylene centrifuge tubes, 50 mL |
| Cresyl violet acetate | Sigma-Aldrich | C5042 | |
| Cryostat | Leica Biosystems | CM3050 S | |
| Delicate task wiper | ThermoFisher Scientific | 06-666 | |
| Disposable embedding mold | ThermoFisher Scientific | 1220 | |
| Distilled water | Invitrogen | 10977-015 | DNase/RNase-Free |
| Ethanol, absolute (200 proof) | ThermoFisher Scientific | BP2818 | Molecular biology grade |
| Glass PEN membrane slide | Leica Microsystems | 11505158 | |
| LCM system | Leica Microsystems | Leica LMD6500 | |
| Microscope cover glass | ThermoFisher Scientific | 12-545FP | |
| Microscope slides | ThermoFisher Scientific | 12-550-15 | |
| OCT compound | Electron Microscopy Sciences | 102094-106 | |
| PCR tube with flat cap, 0.5 mL | Axygen | PCR-05-C | LCM collection tubes |
| Permanent mounting medium | Vector Laboratories | H-5000 | |
| RNA isolation kit | ThermoFisher Scientific | KIT0204 | |
| RNase decontamination agent | Sigma-Aldrich | R2020 | RNase decontamination agent for cleaning surfaces |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 |
References
- Kardon, G. Development of the musculoskeletal system: Meeting the neighbors. Development. 138 (14), 2855-2859 (2011).
- Nichterwitz, S., Chen, G., et al. Laser capture microscopy coupled with Smart-seq2 for precise spatial transcriptomic profiling. Nature Communications. 7, 12139 (2016).
- Liu, A. Laser capture microdissection in the tissue biorepository. Journal of Biomolecular Techniques. 21 (3), 120-125 (2010).
- Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
- Schroeder, A., Mueller, O., et al. The RIN: An RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7 (3), (2006).
- Motch Perrine, S. M., Wu, M., et al. Mandibular dysmorphology due to abnormal embryonic osteogenesis in FGFR2-related craniosynostosis mice. Disease Models & Mechanisms. 12 (5), (2019).
- Holmes, G., O'Rourke, C., et al. Midface and upper airway dysgenesis in FGFR2-craniosynostosis involves multiple tissue-specific and cell cycle effects. Development. 145 (19), (2018).
- Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., Käller, M. MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).
- Tromp, G., Kuivaniemi, H., et al. Structure of a full-length cDNA clone for the preproα1(I) chain of human type I procollagen. Biochemical Journal. 253 (3), 919-922 (1988).
- De Wet, W., Bernard, M., et al. Organization of the human pro-alpha 2(I) collagen gene. Journal of Biological Chemistry. 262 (33), 16032-16036 (1987).
- Bonewald, L. F. The amazing osteocyte. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).
- Toyosawa, S., Shintani, S., et al. Dentin matrix protein 1 is predominantly expressed in chicken and rat osteocytes but not in osteoblasts. Journal of Bone and Mineral Research. 16 (11), 2017-2026 (2001).
- Guo, D., et al. Identification of osteocyte-selective proteins. Proteomics. 10 (20), 3688-3698 (2010).
- Ducy, P., Zhang, R., Geoffroy, V., Ridall, A. L., Karsenty, G. Osf2/Cbfa1: A transcriptional activator of osteoblast differentiation. Cell. 89 (5), 747-754 (1997).
- Nakashima, K., Zhou, X., et al. The novel zinc finger-containing transcription factor osterix is required for osteoblast differentiation and bone formation. Cell. 108 (1), 17-29 (2002).
- Termine, J. D., et al. Osteonectin, a bone-specific protein linking mineral to collagen. Cell. 26 (1), 99-105 (1981).
- Baldwin, C. T., Reginato, A. M., Prockop, D. J. A new epidermal growth factor-like domain in the human core protein for the large cartilage-specific proteoglycan. Evidence for alternative splicing of the domain. Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 15747-15750 (1989).
- Strom, C. M., Upholt, W. B. Isolation and characterization of genomic clones corresponding to the human type II procollagengene. Nucleic Acids Research. 12 (2), 1025-1038 (1984).
- Ninomiya, Y., Olsen, B. R. Synthesis and characterization of cDNA encoding a cartilage-specific short collagen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 81 (10), 3014-3018 (1984).
- Muragaki, Y., Mariman, E. C. M., et al. A mutation in the gene encoding the alpha 2 chain of the fibril-associated collagen IX, COL9A2, causes multiple epiphyseal dysplasia (EDM2). Nature Genetics. 12 (1), 103-105 (1996).
- Brewton, R. G., Wood, B. M., et al. Molecular cloning of the alpha 3 chain of human type IX collagen: linkage of the gene COL9A3 to chromosome 20q13.3. Genomics. 30 (2), 329-336 (1995).
- Newton, G., Weremowicz, S., et al. Characterization of human and mouse cartilage oligomeric matrix protein. Genomics. 24 (3), 435-439 (1994).
- Hiraki, Y., Mitsui, K., et al. Molecular cloning of human chondromodulin-I, a cartilage-derived growth modulating factor, and its expression in Chinese hamster ovary cells. European Journal of Biochemistry. 260 (3), 869-878 (1999).
- Smits, P., Li, P., et al. The transcription factors L-Sox5 and Sox6 are essential for cartilage formation. Developmental Cell. 1 (2), 277-290 (2001).
- Hayman, A. R., Jones, S. J., et al. Mice lacking tartrate-resistant acid phosphatase (Acp 5) have disrupted endochondral ossification and mild osteopetrosis. Development. 122 (10), 3151-3162 (1996).
- Dai, X. -M., Ryan, G. R., et al. Targeted disruption of the mouse colony-stimulating factor 1 receptor gene results in osteopetrosis, mononuclear phagocyte deficiency, increased primitive progenitor cell frequencies, and reproductive defects. Blood. 99 (1), 111-120 (2002).
- Gowen, M., Lazner, F., et al. Cathepsin K knockout mice develop osteopetrosis due to a deficit in matrix degradation but not demineralization. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (10), 1654-1663 (1999).
- Faccio, R., Takeshita, S., Zallone, A., Ross, F. P., Teitelbaum, S. L. c-Fms and the αvβ3 integrin collaborate during osteoclast differentiation. Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 749-758 (2003).
- Kim, N., Takami, M., Rho, J., Josien, R., Choi, Y. A novel member of the leukocyte receptor complex regulates osteoclast differentiation. The Journal of Experimental Medicine. 195 (2), 201-209 (2002).
- Mahalingam, M. Laser Capture Microdissection: Insights into Methods and Applications. Methods in Molecular Biology. 11723, 1-17 (2018).
- Goldsworthy, S. M., Stockton, P. S., Trempus, C. S., Foley, J. F., Maronpot, R. R. Effects of fixation on RNA extraction and amplification from laser capture microdissected tissue. Molecular Carcinogenesis. 25 (2), 86-91 (1999).
- Clément-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
- Farris, S., Wang, Y., Ward, J. M., Dudek, S. M. Optimized method for robust transcriptome profiling of minute tissues using laser capture microdissection and low-input RNA-seq. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 185 (2017).
- Espina, V., Heiby, M., Pierobon, M., Liotta, L. A. Laser capture microdissection technology. Expert Review of Molecular Diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).
- Martuscello, R. T., Louis, E. D., Faust, P. L. A stainless protocol for high quality RNA isolation from laser capture microdissected Purkinje cells in the human post-mortem cerebellum. Journal of Visualized Experiments. (143), (2019).
- Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection. BMC Cell Biology. 11 (95), (2010).
- Takahashi, N., Tarumi, W., Hamada, N., Ishizuka, B., Itoh, M. T. Cresyl violet stains mast cells selectively: Its application to counterstaining in immunohistochemistry. Zoological Science. 34 (2), 147-150 (2017).
- Sheldon, A. R., Almli, L., Ferriero, D. M. Copper/zinc superoxide dismutase transgenic brain in neonatal hypoxia-ischemia. Methods in Enzymology. 353, 389-397 (2002).
- Kolijn, K., Van Leenders, G. J. L. H. Comparison of RNA extraction kits and histological stains for laser capture microdissected prostate tissue. BMC Research Notes. 9, 17 (2016).
- Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
- Filliers, M., et al. Laser capture microdissection for gene expression analysis of inner cell mass and trophectoderm from blastocysts. Analytical Biochemistry. 408 (1), 169-171 (2011).
- Vandewoestyne, M., et al. Laser capture microdissection: Should an ultraviolet or infrared laser be used? Analytical Biochemistry. 439 (2), 88-98 (2013).
- Ayturk, U. RNA-seq in skeletal biology. Current Osteoporosis Reports. 17 (4), 178-185 (2019).
- Van Den Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
- Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: A molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
- Chen, J., et al. Spatial transcriptomic analysis of cryosectioned tissue samples with Geo-seq. Nature Protocols. 12 (3), 566-580 (2017).
