Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन माउस भ्रूणीय उपास्थि और जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए हड्डी

Published: December 18, 2019 doi: 10.3791/60503
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1, 1
1Department of Genetics and Genomic Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Icahn Institute for Data Science and Genomic Technology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Summary

यह प्रोटोकॉल माउस भ्रूण के ताजा जमे हुए वर्गों से उपास्थि और हड्डी के अलगाव के लिए लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन का वर्णन करता है। उपास्थि और हड्डी को तेजी से क्रेसिल वायलेट धुंधला द्वारा कल्पना की जा सकती है और ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण के लिए उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए को प्राप्त करने के लिए ठीक से एकत्र किया जा सकता है।

Abstract

लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन (एलसीएम) विशिष्ट कोशिका प्रकार या विषम ऊतकों से ब्याज के क्षेत्रों को अलग करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। कंकाल तत्वों की सेलुलर और आणविक जटिलता विकास के साथ बढ़ जाती है। ऊतक विषमता, जैसे एक दूसरे के साथ या आसपास के ऊतकों के साथ कार्टिलाजिनस और ओसियस तत्वों के इंटरफेस पर, उपास्थि और हड्डी के विकास के अध्ययन में एक बाधा है। हमारा प्रोटोकॉल ऊतक प्रसंस्करण और उपास्थि और हड्डी के अलगाव की एक तेजी से विधि प्रदान करता है जो जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए की पैदावार करता है। माउस भ्रूण के ताजा जमे हुए ऊतकों को खंडित किया जाता है और संक्षिप्त क्रेसिल बैंगनी धुंधला का उपयोग आसपास के ऊतकों से अलग रंगों के साथ उपास्थि और हड्डी की कल्पना करने के लिए किया जाता है। स्लाइड तो तेजी से निर्जलित हैं, और उपास्थि और हड्डी बाद में LCM द्वारा अलग कर रहे हैं । इस प्रक्रिया के दौरान जलीय समाधानों के संपर्क में आने का कमीकरण आरएनए अखंडता को बनाए रखता है। माउस मेकेल के उपास्थि और ई16.5 में मंडीबुलर हड्डी को सफलतापूर्वक एकत्र किया गया और जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण ने ऑस्टियोब्लास्ट, ऑस्टियोसाइट्स, ऑस्टियोप्लास्ट और कॉन्ड्रोसाइट्स के लिए मार्कर जीन की अंतर अभिव्यक्ति दिखाई। उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए को ऊतकों और भ्रूणीय उम्र की एक श्रृंखला से भी अलग किया गया था। यह प्रोटोकॉल विवरण क्रायोएम्बेडिंग, सेक्शनिंग, धुंधला और ताजा जमे हुए ऊतकों को निर्जलित करने सहित एलसीएम के लिए नमूना तैयारी, और एलसीएम द्वारा उपास्थि और हड्डी के सटीक अलगाव के परिणामस्वरूप ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण के लिए उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए।

Introduction

मस्कुलोस्केलेटल सिस्टम मांसपेशियों, संयोजी ऊतक, टेंडन, स्नायु, उपास्थि और हड्डी से बना एक बहुघटक प्रणाली है, जो नसों द्वारा अंतरवत और रक्त वाहिकाओं द्वारा संवहनीहै 1। कंकाल ऊतक सेलुलर विषमता और संरचनात्मक जटिलता में वृद्धि के साथ विकसित होते हैं। उपास्थि और हड्डी एक ही ऑस्टियोकोनड्रोजेनेटर वंश से विकसित होती है और अत्यधिक संबंधित होती है। भ्रूण उपास्थि और हड्डी मांसपेशियों, नसों, रक्त वाहिकाओं, और अविभेदित मेसेंचिम के सहयोग से विकसित होती है। उपास्थि भी हड्डी से घिरा हो सकता है, जैसे मेकेल का उपास्थि और मंडीबुलर हड्डी के भीतर मसाला उपास्थि। ये ऊतक शारीरिक रूप से जुड़े होते हैं और विकास के दौरान बाह्य संकेतों के माध्यम से एक दूसरे के साथ बातचीत करते हैं। उपास्थि और हड्डी के विकास में जीन अभिव्यक्ति के अध्ययन में, एक बाधा कई ऊतक प्रकारों से बना कंकाल संरचनाओं की विषमता है। ब्याज के विशिष्ट ऊतक का सटीक अलगाव सफल प्रतिलेखन विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण है।

लेजर कैप्चर माइक्रोडिससेक्शन (एलसीएम) विषम ऊतकों के भीतर कोशिका प्रकार या ब्याज के क्षेत्रों को अलग करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है, और प्रजनन योग्य है और एकल सेल स्तर2के प्रति संवेदनशील है। यह ठीक से लक्षित और प्रतिलेखन, जीनोमिक्स, और प्रोटेओमिक्स3,4में डाउनस्ट्रीम परख ों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए ब्याज की कोशिकाओं पर कब्जा कर सकते हैं । अलग आरएनए, डीएनए या प्रोटीन की गुणवत्ता का आकलन बायोएनालाइजर या समकक्ष मंच के साथ किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, आरएनए गुणवत्ता आरएनए अखंडता संख्या (आरआईआर)5द्वारा इंगित की जाती है।

यहां, हम ताजा जमे हुए ऊतकों से एलसीएम द्वारा उपास्थि और हड्डी के तेजी से धुंधला और अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। हम माउस भ्रूण का उपयोग करने के लिए प्रदर्शित करता है कि इस प्रोटोकॉल के बाद ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण के लिए उच्च गुणवत्ता आरएनए पैदावार, जैसे आरएनए अनुक्रमण (आरएनए-सीक्यू) ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

चूहों से ऊतकों की देखभाल और प्रयोगशाला जानवरों के उपयोग के लिए स्वास्थ्य गाइड के राष्ट्रीय संस्थानों के अनुसार प्राप्त किए गए थे, और अध्ययन प्रोटोकॉल माउंट सिनाई में Icahn स्कूल ऑफ मेडिसिन में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया ।

1. ताजा जमे हुए नमूने की तैयारी

  1. भ्रूण या ब्याज के ऊतकों को विच्छेदन करें। नमूना को इष्टतम काटने के तापमान (OCT) यौगिक के साथ डिस्पोजेबल एम्बेडिंग मोल्ड में एम्बेड करें। एक टिप या सुई के साथ नमूने के अभिविन्यास समायोजित।
  2. एक सूखी बर्फ/मिथाइल-2-ब्यूटान स्नान में नमूनों को तेजी से फ्रीज करें। अगले चरण या स्टोर करने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर जारी रखें।
    नोट: यहां प्रोटोकॉल रुका जा सकता है।

2. लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन के लिए क्रायोसेक्शनिंग

  1. क्रायोस्टेट को डिफ्रॉस्ट करें और 70% इथेनॉल के साथ आंतरिक सतहों को साफ करें। एंटी-रोल प्लेट और RNase विसंदूषण एजेंट के साथ संदंश की एक जोड़ी का इलाज करें। क्रायोस्टैट को वांछित काटने के तापमान (-18 से -22 डिग्री सेल्सियस) पर सेट करें। सूखी बर्फ के साथ एक lidded कंटेनर तैयार करें, क्रायोसेक्शनिंग के दौरान खंडित नमूना स्लाइड के अस्थायी भंडारण के लिए सूखी बर्फ पर एल्यूमीनियम पन्नी की एक चादर रखते हुए।
    सावधानी: सूखी बर्फ बेहद ठंडी होती है। हमेशा देखभाल के साथ सूखी बर्फ संभालऔर अछूता दस्ताने पहनते है जब भी इसे संभाल ।
  2. ताजा जमे हुए नमूने को सूखी बर्फ की बाल्टी में स्थानांतरित करें। एक क्रायोस्टेट नमूना धारक पर OCT यौगिक की एक परत रखें और तुरंत कोमल दबाव के साथ अक्टूबर के शीर्ष पर नमूना जगह है । जब अक्टूबर पूरी तरह से जम गया है, क्रायोस्टेट काटने बांह में नमूने के साथ धारक जकड़ना ।
  3. कटिंग तापमान को समतुल्य करने के लिए 15 न्यूनतम के लिए क्रायोस्टेट में नमूना छोड़ दें।
  4. ऊतक को अनुभाग करें और 12 माइक्रोन की मोटाई पर पॉलीथीन नेफ्थालेट (पेन) झिल्ली स्लाइड पर स्लाइस एकत्र करें। झिल्ली पर लगातार वर्गों को संरेखित करें। एक बार एक स्लाइड पूरी हो जाने के बाद, वर्गों को कुछ मिनटों के लिए सूखने की अनुमति दें और सभी आवश्यक स्लाइड एकत्र होने तक शुष्क बर्फ कंटेनर में पन्नी पर स्लाइड स्थानांतरित करें।
  5. स्लाइड्स में रखें -80 डिग्री सेल्सियस स्लाइड बॉक्स में।
    नोट: ऊतक की कुशल काटने की अनुमति देते हुए एकत्र किए गए ऊतकों की मात्रा को अधिकतम करने के लिए अनुभाग मोटाई को चुना जाता है, और ब्याज के ऊतकों के आधार पर भिन्न हो सकता है। यहां प्रोटोकॉल रुका जा सकता है। स्लाइड्स को रनासे संदूषण से मुक्त रखें। तापमान में बदलाव से बचें। हालांकि 6 महीने तक संग्रहीत स्लाइड से आरएनए के आरआईएन अभी भी आरएनए की उच्च गुणवत्ता का संकेत दे सकते हैं, हम जितनी जल्दी हो सके स्लाइड का उपयोग करने की सलाह देते हैं।

3. लेजर कैप्चर माइक्रोडिससेक्शन के लिए नमूना तैयारी

  1. धुंधला और निर्जलीकरण के लिए समाधान तैयार करें।
    1. बर्फ पर तीन 50 मीटर सेंट्रलाइज ट्यूबों में से प्रत्येक में 80% इथेनॉल के 45 mL रखें। उन्हें #1, #2 और #3 के रूप में लेबल करें। RNase/DNase मुक्त पानी के साथ पतला इथेनॉल ।
    2. बर्फ पर 50 मीटर सेंट्रलाइज ट्यूब में 95% इथेनॉल के 45 mL रखें।
    3. बर्फ पर 50 मीटर सेंट्रलाइज ट्यूब में 100% इथेनॉल के 45 एमएएल रखें।
    4. कमरे के तापमान पर 50 मीटर सेंट्रलाइज ट्यूब में जाइलीन के 45 mL रखें।
      सावधानी: जाइलीन का उपयोग धूम हुड में किया जाना चाहिए।
  2. एक कलम झिल्ली स्लाइड संक्षेप में यह एक दस्ताने हाथ के खिलाफ रखकर, तो 80% इथेनॉल (#1 और #2) के 45 mL में 30 एस प्रत्येक के लिए दो बार धोने के लिए 50 mL अपकेंद्रित्र ट्यूबों में आंदोलन के साथ अक्टूबर को हटाने के लिए.
    नोट: यह धुंधला से पहले OCT को दूर करने के लिए महत्वपूर्ण है, के लिए वर्गों अस्पष्ट से धुंधला के दौरान ढीला OCT को रोकने के लिए । संदंश का उपयोग आंदोलन से धोए गए OCT को हटाने की सुविधा के लिए किया जा सकता है।
  3. एल्यूमीनियम पन्नी की एक चादर पर स्लाइड रखना। स्लाइड पर 50% इथेनॉल में 0.1% क्रेसिल वायलेट का पिपेट 0.8 मीटर और 30 एस के लिए दाग। 80% इथेनॉल (#3) के 45 मीटर में स्लाइड को 30 एस के लिए 30 एस के लिए 95% इथेनॉल, 100% इथेनॉल, 100% इथेनॉल, और 50 mLrifufuge ट्यूबमें जाइलीन के लिए पारित करके निर्जलित करें।
  4. जाइलीन और सूखे वर्गों को निकालने के लिए 5 मिन के लिए एक नाजुक कार्य वाइपर पर स्लाइड खड़े हो जाओ।
    नोट: स्लाइड ्स को एलसीएम से पहले पूरी तरह से सुखा दिया जाना चाहिए।

4. लेजर कैप्चर माइक्रोडिससेक्शन

नोट: एलसीएम प्रदर्शन करते समय पाउडर फ्री नाइट्रिल दस्ताने पहनें।

  1. एलसीएम माइक्रोस्कोप, लेजर और कंप्यूटर चालू करें। कंप्यूटर पर लॉग इन करें और सॉफ्टवेयर शुरू करें। लेजर शुरू करने के लिए "ऑन" स्थिति की कुंजी को चालू करें। जब हरी बत्ती (लेजर) चालू होती है, तो लेजर को सक्रिय करने के लिए लाल बटन दबाएं, और फिर प्रकाश (लेजर) लाल हो जाता है जो लेजर का उपयोग करने के लिए तैयार है।
    नोट: लेजर को गर्म करने के लिए लगभग 10 मिन की जरूरत है।
  2. संग्रह ट्यूब ों की स्थापना की।
    1. कलेक्टोरेट में 0.5 मिलीग्राम पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (पीसीआर) ट्यूब की कैप डालें।
      नोट: वांछित पीसीआर ट्यूब (0.2 या 0.5 मिली) के लिए मिलान कलेक्टर चुनें।
    2. 0.5 मीटर संग्रह ट्यूब की टोपी में निष्कर्षण बफर (सामग्री की तालिकामें सूचीबद्ध आरएनए आइसोलेशन किट द्वारा प्रदान किया गया) का पिपेट 50 माइक्रोन।
    3. संग्रह डिवाइस को माइक्रोस्कोप में डालें।
    4. चेंज कलेक्टर डिवाइस विंडो में कलेक्टर को रेफरेंस प्वाइंट (आरपी) में ले जाने के लिए मूव टू रेफरेंस प्वाइंट बटन पर क्लिक करें। आरपी को स्पष्ट रूप से देखने के लिए ध्यान समायोजित करें। आरपी को देखने के केंद्र में जाने के लिए तीर पर क्लिक करें।
  3. लोड नमूना स्लाइड।
    1. स्लाइड होल्डर को कम करने के लिए टूलबार में लेफ्ट अनलोड बटन पर क्लिक करें।
    2. स्लाइड को धारक में रखें, ऊतक अनुभाग नीचे की ओर सामना कर रहा है।
      नोट: यह अभिविन्यास यह सुनिश्चित करता है कि कैप्चर किए गए ऊतक वर्ग गुरुत्वाकर्षण द्वारा संग्रह ट्यूब की टोपी में आते हैं।
    3. धारक को वापस चरण में डालें।
  4. लेजर मापदंडों की स्थापना की।
    1. लेजर मेनू के नियंत्रण विकल्प का चयन करें या लेजर आइकन पर क्लिक करें।
    2. इन मापदंडों को वांछित के रूप में समायोजित करें: शक्ति,लेजर की शक्ति; अपर्चर,लेजर की चौड़ाई; और गति, ड्रा और कट मोड में काटने की गति।
      नोट: ब्याज से बाहर एक क्षेत्र में लेजर का परीक्षण करें। उच्च शक्ति या बड़ा एपर्चर इसे काटना आसान बनाता है लेकिन कोशिकाओं को अधिक नुकसान पहुंचाता है। ऊतक के कुशल काटने और न्यूनतम क्षति प्राप्त करने के लिए शक्ति, एपर्चर और गति के संयोजन को समायोजित करें। उदाहरण के लिए, पावर = 40, अपर्चर = 5, और स्पीड = 7 12 माइक्रोन सेक्शन पर उपास्थि ऊतक के लिए।
  5. ब्याज के क्षेत्रों का चयन करें और कटौती करें।
    1. 5x उद्देश्य के साथ शुरू करें और ब्याज के क्षेत्रों को ढूंढें, और फिर उद्देश्य (5x, 10x, या 40x) पर स्विच करें जो ब्याज के क्षेत्र को सबसे अच्छा दिखाता है।
      नोट: क्रेसिल वायलेट धुंधला होने के बाद, उपास्थि को दाग दिया जाता है और खनिज ऊतक भूरे या काले दिखाई देते हैं, जो अन्य ऊतकों से अलग होते हैं। फ़ाइल मेनू से सेव इमेज का उपयोग करके छवियों को सहेजा जा सकता है।
    2. कलेक्टोरेट में निशान पर क्लिक करके कलेक्शन (ए, बी, सी, डी) के लिए ट्यूब चुनें।
    3. मूव और कट या ड्रा और कटचुनें। मूव और कट मोड में, माउस या टच-स्क्रीन पेन का उपयोग करके आकार फ्रीहैंड आकर्षित करने के लिए नमूना मैन्युअल रूप से काटा जाता है। ड्रा और कट मोड में, आकार बाद में काटने के लिए माउस या टच-स्क्रीन पेन के साथ फ्रीहैंड तैयार किया जा सकता है। लेजर कटिंग शुरू करने के लिए स्टार्ट कट बटन पर क्लिक करें।
    4. एक बार कट पूरा हो जाने के बाद, पेन झिल्ली के साथ लक्ष्य ऊतक गुरुत्वाकर्षण द्वारा संग्रह ट्यूब की टोपी में गिर जाता है। जरूरत पड़ने पर ब्याज के कई क्षेत्रों को पूल करने के लिए 4.5 दोहराएं।
      नोट: यदि ऊतक अधूरे काटने के कारण संग्रह ट्यूब की टोपी में नहीं गिरता है तो कटौती या बढ़ती शक्ति या अपर्चर को दोहराना आवश्यक हो सकता है। खनिज ीकृत हड्डी (भूरे या काले) को सीधे लेजर द्वारा नहीं काटा जा सकता है।
  6. कलेक्टर को उतारें और पीसीआर ट्यूब को सावधानी से बंद करें। सूक्ष्म के ऊतकों को सूखी बर्फ में रखें। अगले चरण या स्टोर करने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर जारी रखें।
    नोट: यहां प्रोटोकॉल रुका जा सकता है। अगले नमूने के लिए 4.2 से 4.6 दोहराएं।

5. माइक्रोडिसेक्ड ऊतकों और आरएनए अलगाव का लिस

  1. कमरे के तापमान पर माइक्रोडिसेक किए गए ऊतकों को पिघलाएं। सेंट्रलाइज संक्षेप में और 30 मिन के लिए नमूनों को 42 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  2. ऊष्मायन के बाद, लिसिस बफर को 0.5 मिलीपीसीआर ट्यूब में स्पिन करें। निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए आरएनए आइसोलेशन किट (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके DNase उपचार और आरएनए निष्कर्षण करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

E16.5 पर ताजा जमे हुए माउस ऊतकों के कोरोनल वर्गों का उपयोग एलसीएम द्वारा मेकेल के उपास्थि (एमसी), कोंडिलार उपास्थि और मंडीबुलर हड्डी के अलगाव और संग्रह को प्रदर्शित करने के लिए किया गया था। E16.5 पर माउस भ्रूण विच्छेदित और OCT यौगिक के साथ क्रायोजेनिक मोल्डों में एंबेडेड थे । मोल्डों में नमूने तेजी से एक सूखी बर्फ और मिथाइल-2-ब्यूटान स्नान में जमे हुए थे और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया था।

उपास्थि और हड्डी के क्रेसिल वायलेट धुंधला प्रदर्शन करने के लिए, कोरोनल विमान में क्रायोसेक्शनिंग का प्रदर्शन किया गया था और माइक्रोस्कोप स्लाइड पर नमूने एकत्र किए गए थे। ऊपर प्रोटोकॉल (चरण 3.2-3.4) का पालन करते हुए अनुभागों को धोया, दाग दिया गया और निर्जलित किया गया। स्लाइड हवा सूख रहे थे और स्थाई बढ़ते माध्यम के साथ घुड़सवार । जांच किए गए सभी उपास्थि दाग वाले मजेंटा (एमसी, कोंडिलर उपास्थि, नाक सेप्टम उपास्थि, कॉस्टल कार्टिलेज, प्रीस्फेनोइड हड्डी के उपास्थि प्राइमोर्डियम, त्रिज्या और उलना के उपास्थि प्राइमोर्डिया) थे और सभी खनिज ऊतकों को भूरे या काले(चित्र 1ए-ई)पर दाग दिया गया था। उपास्थि और हड्डी दोनों आसानी से कई शारीरिक साइटों पर अन्य ऊतकों से प्रतिष्ठित थे।

एलसीएम के लिए, E16.5 पर भ्रूण के सिर 12 μm की मोटाई पर कलम झिल्ली स्लाइड पर कोरोनल विमान में अनुभागित किया गया था, और 6-8 लगातार वर्गों प्रति स्लाइड एकत्र और-८० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया । अक्टूबर को हटा दिया गया था और ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल (चरण 3.2-3.4) के बाद क्रेसिल वायलेट और निर्जलित के साथ वर्गों को दाग दिया गया था। एमसी, कोंडिलर उपास्थि, और मंडीबुलर हड्डी क्षेत्रों का चयन और एलसीएम(चित्रा 2)द्वारा अलग किया गया । चयनित क्षेत्र ों संग्रह ट्यूब की टोपी में lysis बफर में गिरा दिया । अनुक्रमण के लिए पर्याप्त आरएनए प्राप्त करने के लिए, हमने एमसी के 10 क्षेत्रों, कोंडिलर उपास्थि के 10 क्षेत्रों या प्रत्येक संग्रह ट्यूब में मंडीबुलर हड्डी के 4 क्षेत्रों को क्रमशः एक नमूने के रूप में एकत्र किया।

आरएनए निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए आरएनए आइसोलेशन किट का उपयोग करके निकाला गया था। कुल आरएनए का विश्लेषण बायोएनालाइजर(चित्रा 3ए-बी)का उपयोग करके किया गया था। आरएनए की गुणवत्ता पर क्रेसिल वायलेट धुंधला के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए, हमने क्रेसिल वायलेट और नमूनों के साथ दागदार मंडीबुलर हड्डी के नमूनों से आरएनए की तुलना धुंधला किए बिना की (खनिज ऊतक धुंधला किए बिना दिखाई देता है, लेकिन क्रेसिल बैंगनी धुंधला आसपास के ऊतकों से हड्डी को अलग करने के लिए दृश्यता को बढ़ाता है)। आरएनए अखंडता में कोई महत्वपूर्ण अंतर दाग नमूनों (एन = 4) और धुंधला (एन = 4) के बिना नमूनों के बीच देखा गया था, इस प्रोटोकॉल में त्वरित क्रेसिल वायलेट धुंधला का संकेत आरएनए गुणवत्ता पर तुच्छ प्रभाव पड़ता है (पी = ०.८५८, दो पूंछ वेल्च के टी-टेस्ट, चित्रा 3सी)। हमने विभिन्न विकासात्मक चरणों में विभिन्न ऊतकों के एलसीएम के लिए अपने प्रोटोकॉल का उपयोग किया और आरआईएनएस को मापा गया, जो उच्च आरएनए गुणवत्ता(चित्रा 3डी)का संकेत देता है। एमसी, कोंडिलर उपास्थि, और मंडीबुलर हड्डी से आरएनए की औसत पैदावार 7.50 ± 1.45 एनजी थे, 12.55 ± 2.75 एनजी, और 33.02 ± 7.63 एनजी(चित्रा 3ई)और उपज/क्षेत्र 19.73 ± 3.82 एनजी/मिमी2,26.70 ± 5.84 एनजी/एमएम2,और 17.23 ± 3.98 एनजी/एमएम2,क्रमशः(चित्रा 3एफ), ऊतकों के बीच महत्वपूर्ण अंतर के बिना (एमसी 3एफ)पी = 0.383; कोंडिलउपाँ बनाम मंडीबुलर हड्डी, पी = 0.260; एमसी बनाम मंडीबुलर हड्डी, पी = 0.674)।

पुस्तकालयों को तैयार किया गया था और अनुक्रम के रूप में पहलेवर्णित 6,7. एक प्रतिनिधि सीडीएनए आकार लगभग 500 बीपी(चित्रा 4ए)था। आरएनए-सीक्यू डेटा का विश्लेषण मल्टीक्यूसी8के साथ किया गया था । हमने 18 एलसीएम नमूनों (एमसी 1-6, मेकेल के उपास्थि) से आरएनए-सीक्यू डेटा का विश्लेषण किया; C1-6, condylar उपास्थि; M1-6, मंडीबुलर हड्डी) । पढ़ता है में प्रत्येक आधार की स्थिति में मतलब गुणवत्ता मूल्यों FastQC द्वारा उत्पन्न किए गए थे, बहुत अच्छी गुणवत्ता कॉल(चित्रा 4बी)का संकेत है । पढ़ें संरेखण Picard के साथ विश्लेषण किया गया था(चित्रा 4सी)। पढ़ता है उच्च गठबंधन प्रतिशत दिखाया और गठबंधन पढ़ता है की औसत प्रतिशत ७५% था । जीन कवरेज Picard(चित्रा 4डी),जो 5 ' से 3 ' अंत तक प्रतिलिपि के साथ एक अच्छा प्रतिनिधित्व का संकेत के साथ विश्लेषण किया गया था ।

अंतर जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण6,7किया गया था । मंडीबुलर बोन और एमसी(चित्रा 5ए)के बीच 4,006 जीन काफी विभेदित रूप से व्यक्त किए गए थे (पी एंड एलटी;0.05) । ऑस्टियोब्लास्ट या ऑस्टियोसाइट्स के लिए विशिष्ट जीन(Col1a19, Col1a210, Dkk111, Dmp112, Dstn13, Runx214, Sp715,और Sparc16)एमसी की तुलना में मंडीबुलर हड्डी में अधिक अत्यधिक व्यक्त किए गए थे, जबकि chondrocyte विशिष्ट जीन(Acan17, Col2a118,Col99a, Col99a कोल9a220, Col9a321, Comp22, Lect123,और Sox524)मंडीबुलर हड्डी की तुलना में एमसी में अधिक व्यक्त किया गया(चित्रा 5बी और तालिका 1)। इसके अलावा, एसीपी525, सीएसएफ1आर26, सीटीएसके27, Itgb328और ऑस्कर29 जैसे ऑस्टियोप्लास्ट मार्कर को भी एमसी(चित्रा 5बी और तालिका 1)की तुलना में मंडीबुलर हड्डी में अधिक व्यक्त के रूप में पहचाना गया था, जो लक्षित ऊतकों के सफल अलगाव का संकेत है।

Figure 1
चित्रा 1: प्रतिनिधि Cresyl वायलेट उपास्थि और माउस भ्रूण के कोरोनल वर्गों में हड्डी के धुंधला E16.5 पर । (A)मेकेल का उपास्थि और हेमिकंदकर। (ख)मेकेल का उपास्थि, कोंडिलर उपास्थि, और हेमिकंदनीय। (C)नाक पट और मैक्सिले। (D)प्रीस्फेनोइड हड्डी और पैलेटिन हड्डी का उपास्थि प्राइमोर्डियम। (ई)त्रिज्या का उपास्थि प्राइमोर्डियम, उल्ना का उपास्थि प्राइमोर्डियम और महंगा उपास्थि। C = condylar उपास्थि; सीसी = महंगा उपास्थि; सीपी = प्रीस्फेनोइड हड्डी का उपास्थि प्राइमोर्डियम; एम = हेमिकंदबल; एमसी = मेकेल का उपास्थि; एमएक्स = मैक्सिला; एनएस = नाक पट; PL = पैलेटिन हड्डी; आर = त्रिज्या के उपास्थि प्राइमोर्डियम; यू = उलना का उपास्थि प्राइमोर्डियम। स्केल बार = 200 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: एलसीएम द्वारा अलग-थलग किए गए प्रतिनिधि क्षेत्र और आरएनए-सीक्यू के लिए एकत्र किए गए। (ए-सी) प्रतिनिधि दाग एमसी(ए),condylar उपास्थि(बी),और एमसी के साथ हेममिआंबल पहले से ही अलग(सी)LCM से पहले क्रायोसेक्शन में । (डी-एफ) लक्षित ऊतकों के बाद ए, बी और सी में क्षेत्रों को एलसीएम द्वारा अलग-थलग कर दिया गया था । स्केल बार = 200 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: आरएनए गुणवत्ता और एलसीएम नमूनों की मात्रा। (ए-बी) एक मंडीबुलर हड्डी के नमूने के लिए एक बायोएनालाइजर से प्रतिनिधि इलेक्ट्रोप्रोग्राम(ए)और संबद्ध जेल छवि(बी)। (C)मंडीबुलर हड्डी के नमूनों से कुल आरएनए के आरआईएनएस क्रेसिल वायलेट (एन = 4) या बिना धुंधला (एन = 4) के साथ दागदिया गया। (D)एलसीएम द्वारा अलग-अलग विभिन्न ऊतकों से कुल आरएनए के आरआईएनएस। E16.5 (n = 6) पर मेकेल का उपास्थि; E16.5 (n = 6) पर Condylar उपास्थि; E16.5 (n = 6) पर मंडीबुलर हड्डी; E14.5 (n = 6) पर नाक सेप्टम उपास्थि; E14.5 पर मस्तिष्क (n = 6); E16.5 पर मस्तिष्क (n = 7); E18.5 (n = 4) पर मस्तिष्क। (ई)तीन ऊतकों से कुल आरएनए की उपज। प्रत्येक एमसी या कोंडिलार उपास्थि नमूना उपास्थि के 10 सूक्ष्म क्षेत्रों का एक पूल था और मंडीबुलर हड्डी का प्रत्येक नमूना हेमिमिन्डिबल के 4 सूक्ष्म क्षेत्रों का एक पूल था। (एफ)प्रत्येक ऊतक में प्रति यूनिट क्षेत्र (एनजी/एमएम2)उपज। डेटा का मतलब है ± s.e.m. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: पुस्तकालयों और आरएनए-सीक्यू डेटा की गुणवत्ता एलसीएम नमूनों से उत्पन्न। (क)बायोएनालाइजर द्वारा निर्धारित मंडीबुलर हड्डी के नमूने से पुस्तकालय के प्रतिनिधि सीडीएनए आकार। (बी-डी) 18 एलसीएम नमूनों (MC1-6, मेकेल का उपास्थि) से आरएनए-सीक्यू का गुणवत्ता नियंत्रण विश्लेषण; C1-6, condylar उपास्थि; मल्टीक्यूसी द्वारा M1-6, मंडीबुलर हड्डी) । (ख)रीड्स में प्रत्येक आधार स्थिति में मतलब गुणवत्ता मूल्यों FastQC द्वारा उत्पन्न किए गए थे । ग्राफ की पृष्ठभूमि वाई एक्सिस को बहुत अच्छी गुणवत्ता वाले कॉल (हरे), उचित गुणवत्ता (नारंगी) के कॉल और खराब गुणवत्ता (लाल) के कॉल में विभाजित करती है। (ग)पिकार्ड द्वारा पुस्तकों के संरेखण का विश्लेषण किया गया था। सारांश गठबंधन पढ़ता है के प्रतिशत के रूप में दिखाया गया है । (डी)सामान्यीकृत जीन कवरेज पिकार्ड के साथ विश्लेषण किया । साजिश 5 ' अंत (बाएं) से 3 ' अंत (दाएं) के लिए प्रतिलिपि के साथ सापेक्ष औसत कवरेज इंगित करता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: मंडीबुलर हड्डी और एलसीएम द्वारा अलग एमसी से आरएनए-सीक्यू डेटा का अंतर अभिव्यक्ति विश्लेषण। (क)4,006 जीनों का पदानुक्रमित क्लस्टरिंग मंडीबुलर हड्डी और एमसी के बीच काफी अंतर (पी एंड एलटी; 0.05) व्यक्त किया गया है। प्रत्येक ऊतक के लिए तीन जैविक प्रतिकृतियों का उपयोग किया गया था। M1-3, मंडीबुलर हड्डी; MC1-3, MC.(B)ज्वालामुखी प्लॉट में गुना परिवर्तन और पी-मूल्यों को मंडीबुलर हड्डी और एमसी के बीच अलग-अलग व्यक्त किए गए जीन दिखाए गए हैं। अत्यधिक विभेदित रूप से व्यक्त सेल-विशिष्ट जीन के उदाहरण दिखाए गए हैं: ओस्टियोब्लास्ट और ऑस्टियोसाइट मार्कर नीले रंग में, हरे रंग में ऑस्टियोब्लास्ट मार्कर, और लाल रंग में कोरोसाइट मार्कर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

जीन सेल प्रकार लॉग2फोल्डचेंज औसत अभिव्यक्ति समायोजित पी वैल्यू
Col1a1 ऑस्टियोब्लास्ट/ऑस्टियोसाइट 2.64 12.94 2.22E-05
Col1a2 ऑस्टियोब्लास्ट/ऑस्टियोसाइट 3.41 12.87 8.27E-07
डीकेके1 ऑस्टियोब्लास्ट/ऑस्टियोसाइट 7.59 2.01 5.21E-03
Dmp1 ऑस्टियोब्लास्ट/ऑस्टियोसाइट 9.73 3.42 3.19E-04
डीएसटीएन ऑस्टियोब्लास्ट/ऑस्टियोसाइट 2.51 6.87 5.73E-07
रनक्स2 ऑस्टियोब्लास्ट/ऑस्टियोसाइट 1.24 8.62 4.08E-02
Sp7 ऑस्टियोब्लास्ट/ऑस्टियोसाइट 2.24 6.95 5.81E-03
Sparc ऑस्टियोब्लास्ट/ऑस्टियोसाइट 3.40 12.26 5.56E-09
एसीपी5 ऑस्टियोप्लास्ट 3.38 5.74 6.46E-06
सीएसएफ1आर ऑस्टियोप्लास्ट 2.01 5.80 1.17E-04
सीटीएसके ऑस्टियोप्लास्ट 3.19 7.56 5.73E-07
आईटीजीबी3 ऑस्टियोप्लास्ट 2.88 5.37 2.43E-04
ऑस्कर ऑस्टियोप्लास्ट 3.41 2.67 1.63E-04
एकेन कॉन्ड्रोसाइट -5.23 5.01 2.76E-04
Col2a1 कॉन्ड्रोसाइट -3.61 9.47 3.29E-03
Col9a1 कॉन्ड्रोसाइट -7.01 3.58 5.51E-03
Col9a2 कॉन्ड्रोसाइट -5.40 3.76 2.60E-03
Col9a3 कॉन्ड्रोसाइट -6.63 3.80 2.90E-02
Comp कॉन्ड्रोसाइट -5.86 1.54 7.51E-03
लेक्1 कॉन्ड्रोसाइट -7.37 1.34 2.35E-02
सॉक्स5 कॉन्ड्रोसाइट -2.88 4.43 6.06E-04

तालिका 1: हड्डी और उपास्थि (मंडीबुलर हड्डी बनाम एमसी) के विभिन्न कोशिका प्रकारों में ज्ञात जीन की अंतर अभिव्यक्ति।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

एलसीएम विषम ऊतकों से समृद्ध या समरूप कोशिका आबादी के अलगाव को सक्षम बनाता है। इसके फायदों में वीवो संदर्भ में कोशिकाओं का तेजी से और सटीक कब्जा शामिल है, जबकि संभावित नुकसान में यह समय लेने वाला, महंगा और सीमित है कि उपयोगकर्ता को एक निर्दिष्ट नमूना30के भीतर अलग उपआबादी को पहचानने की आवश्यकता है। यह प्रोटोकॉल माउस भ्रूण ीय उपास्थि और हड्डी के एलसीएम का विवरण प्रदान करता है, जो आरएनए-सीक्यू द्वारा बाद के विश्लेषण के लिए उच्च आरएनए अखंडता को बनाए रखते हुए सटीक ऊतक संग्रह के लिए उपास्थि और हड्डी की कल्पना करने के लिए एक त्वरित प्रक्रिया में क्रेसिल वायलेट धुंधला के उपयोग को रेखांकित करता है। इस प्रोटोकॉल की एक सीमा यह है कि यहां उपयोग की जाने वाली एलसीएम प्रणाली सीधे खनिज ऊतकों (जैसे, चित्रा 2सीमें काले रंग में मंडीबुलर ऊतक) में कटौती करने में सक्षम नहीं है; नतीजतन, पूरे हड्डी क्षेत्र को विच्छेदित करने की आवश्यकता है। विशेष रूप से, एलसीएम द्वारा अलग किए गए माइक्रोडिसेटेड ओस्सेफाइड क्षेत्र सजातीय नहीं हैं, और कम से कम ऑस्टियोब्लास्ट, ऑस्टियोसाइट्स और ऑस्टियोप्लास्ट(टेबल 1)की उपआबादी शामिल हैं। फिर भी, एलसीएम द्वारा संवर्धन मूल्यवान है क्योंकि हमारे पिछले अध्ययन से पता चला है कि विशिष्ट उपआबादी में ट्रांसक्रिप्शनल परिवर्तन जैसे कि माइक्रोडिसेक्ड हड्डी ऊतक में ऑस्टियोप्लास्ट अभी भी आरएनए-सीक्यू6द्वारा पता लगाया जा सकता है।

जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए, हमने उच्च आरएनए गुणवत्ता और उपज के लिए नमूना तैयारी और एलसीएम प्रक्रिया को अनुकूलित किया है। हमारा प्रोटोकॉल ताजा जमे हुए ऊतकों के साथ शुरू होता है। ताजा जमे हुए ऊतक खंड उत्कृष्ट मात्रा और निकाले गए आरएनए3की गुणवत्ता के लिए अनुमति देते हैं , क्योंकि एमआरएनए निर्धारण31के मानक तरीकों के प्रति संवेदनशील है । आरएनए जल्दी से RNase संदूषण द्वारा अपमानित किया जाता है, और नमूना तैयारी, एलसीएम और आरएनए अलगाव भर में एक RNase मुक्त वातावरण के रखरखाव सफल आवेदन के लिए महत्वपूर्ण है । सेक्शन प्रोसेसिंग के दौरान पानी का संपर्क आरएनए क्वालिटी31,32के लिए नुकसानदायक होता है . हमारा प्रोटोकॉल इस तरह के एक्सपोजर को सीमित करता है, जिसमें क्रेसिल वायलेट धुंधला के दौरान जलीय एक्सपोजर का उच्चतम स्तर 50% है। हमने परीक्षण किया है कि 50% इथेनॉल में 0.1% क्रेसिल वायलेट के साथ एक त्वरित धुंधला (30 एस) उपास्थि के लिए एक अलग रंग देता है और डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए आरएनए अखंडता को कम नहीं करता है जैसे कि कम इनपुट आरएनए-सीक्यू(चित्रा 3सी और चित्रा 4)। यील्ड/एरिया (एनजी /एमएम2)लगभग 20 एनजी/एमएम2 (फिगर 3एफ)है, जो पिछले अनुकूलित तरीकोंकीतुलना में या उससे अधिक है । एमसी और मंडीबुलर बोन6में सेल घनत्व के अनुसार, हमारा अनुमान है कि इस प्रोटोकॉल के साथ एक सेल से औसत उपज प्रति सेल लगभग 5 स्नातकोत्तर आरएनए है, और कुल आरएनए के 1-5 एनजी को 200-1,000 कोशिकाओं से निकाला जा सकता है, जिसका उपयोग कम इनपुट आरएनए-सीक्यू6,7,33के लिए किया जा सकता है। यह उपज दक्षता स्थापित एलसीएम विधियों34से कहीं अधिक है और हाल के अनुकूलित प्रोटोकॉल33,35के समान भी बेहतर या समान है .

हित के विशिष्ट ऊतकों के सटीक संग्रह के लिए हिस्टोलॉजिकल वर्गों में विभिन्न सेल प्रकारों को अलग करने की क्षमता आवश्यक है। क्रेसिल वायलेट एक हाइड्रोफिलिक, बुनियादी दाग है जो नकारात्मक आवेशित न्यूक्लिक एसिड36से बांधता है। यह गुण सेल-प्रकार की चयनात्मकता37के साथ प्रतिदागन के लिए उपयोगी बनाता है और यह न्यूरॉन्स38के लिए एक मानक हिस्टोलॉजिकल दाग है। क्रेसिल वायलेट का उपयोग एलसीएम में विभिन्न ऊतकों के लिए किया गया है, जो अच्छे ऊतक आकृति विज्ञान और उच्च आरएनए गुणवत्ता33,36,39,40प्रदान करता है। अन्य धुंधला तरीकों के साथ तुलना में, क्रेसिल बैंगनी धुंधला साइटोप्लाज्मिक और परमाणु विवरण प्रदान करता है, और एक कम आरएनए गिरावट दर32. हम यहां प्रदर्शित करते हैं कि क्रेसिल वायलेट धुंधला उपास्थि और हड्डी की कल्पना करने के लिए एक आसान और त्वरित विधि है और इस विधि से दाग ऊतक उच्च आरएनए अखंडता का संरक्षण करता है। जाइलीन उपचार का उपयोग आमतौर पर एलसीएम35,36, 41,42से पहले ऊतकों के निर्जलीकरण के लिए किया जाता है . हम ऊतक आकृति विज्ञान35 के दृश्य को बढ़ाने के लिए जाइलीन का उपयोग करते हैं जो लक्षित ऊतकों को अलग करने के लिए आवश्यक है, विशेष रूप से पेन झिल्ली स्लाइड पर जो सादे ग्लास स्लाइड के रूप में ऑप्टिकल रूप से स्पष्ट नहीं हैं। हम धुंधला और धोने के कदम के दौरान कलम स्लाइड से अनुभाग हानि की कोई महत्वपूर्ण घटना नहीं मिली, यहां तक कि आंदोलन के साथ अक्टूबर को हटाने के लिए ।

माइक्रोड्रॉपलेट या माइक्रोफ्लूइडिक्स-आधारित एकल-सेल आरएनए-सीक्यू (स्क्आरएनए-सीक्यू) विषम कोशिका प्रकारों के साथ ऊतकों के ट्रांसपोम का विश्लेषण करने के लिए एक उच्च-थ्रूपुट विधि है और कंकाल जीव विज्ञान43में उपयोग किया जाना शुरू कर दिया है। एलसीएम के विपरीत, स्क्आरएनए-सीक्यू में एक कोशिकाओं में ऊतक ों का एंजाइमैटिक और/या यांत्रिक विसग्रीकरण शामिल है । एकल सेल तैयारकरने के लिए अधिकांश प्रोटोकॉल के लिए ऊतकों को विस्तारित अवधि के लिए कमरे के तापमान या 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किए जाने की आवश्यकता होती है, जो ट्रांसक्रिप्टोम44,45को बदल देता है। इसके अलावा, उपास्थि और हड्डी में एकल कोशिकाओं का अलगाव शारीरिक रूप से ट्रैबेकुलाइजेशन और खनिजीकरण की कंकाल तत्व जटिलता द्वारा सीमित हो सकता है। कंकाल ऊतकों से पर्याप्त संख्या में व्यवहार्य कोशिकाओं को अलग करना अभी भी एक तकनीकी चुनौती है जो वीवो मेंऊतकों की सेलुलर विविधता का सही प्रतिनिधि है और कोशिकाओं के अधूरे विसोजन से कोशिका प्रकार ों का पता लगाने में पूर्वाग्रह पैदा हो सकता है43. जबकि स्क्आरएनए-सीक्यू अलग-अलग सेल प्रकारों की पहचान की अनुमति देता है, अनुक्रमण गहराई कम होती है, और विशिष्ट अनुक्रमण दृष्टिकोण 3 'ट्रांसक्रिप्ट समाप्त होता है और वैकल्पिक स्प्लिसिंग विश्लेषण की अनुमति नहीं देते हैं। एलसीएम-व्युत्पन्न ऊतक का बल्क आरएनए-सीक्यू सेल मतभेदों को समरूप करता है, लेकिन व्यापक ट्रांसक्रिप्ट डिटेक्शन और वैकल्पिक स्प्लिसिंग विश्लेषण की अनुमति देता है। एलसीएम इसलिए कंकाल ऊतकों के लिए विशेष रूप से उपयोगी है जो आसपास के ऊतकों और आंतरिक रूप से जटिल से आसानी से विभाज्य नहीं हैं, और ऊतक की ताजा जमे हुए तैयारी प्रतिलेखन विश्लेषण के लिए ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफाइल और आरएनए अखंडता दोनों को संरक्षित कर सकती है। स्क्आरएनए-सीक्यू की एक और कमजोरी यह है कि सिंगल सेल तैयार करने के बाद कोशिकाओं की स्थानिक जानकारी खत्म हो जाती है। परिभाषित भौगोलिक स्थानों (जियो-सीक्यू)46से एक छोटे नमूने के ट्रांसपेटोम के अध्ययन की अनुमति देने के लिए एलसीएम और स्आरएनए-सीक्यू का संयोजन विकसित किया गया है, जो क्षेत्रीयकृत जीन अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए एलसीएम का उपयोग करने का एक और दृष्टिकोण है।

संक्षेप में, यह प्रोटोकॉल उपास्थि और हड्डी के अनुकूलित एलसीएम का विवरण प्रदान करता है, जो आरएनए-सीक्यू द्वारा बाद के विश्लेषण के लिए उच्च आरएनए अखंडता को बनाए रखते हुए सटीक ऊतक संग्रह के लिए उपास्थि और हड्डी की कल्पना करने के लिए एक त्वरित प्रक्रिया में क्रेसिल वायलेट धुंधला के उपयोग को रेखांकित करता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण6,7के लिए विभिन्न विकासात्मक चरणों में उपास्थि और हड्डी के एलसीएम के लिए सफलतापूर्वक किया गया है, और अन्य ऊतकों के लिए भी उपयोग किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ डेंटल एंड क्रैनियोफेशियल रिसर्च (R01DE022988) और यूनिस कैनेडी श्रिवर नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ चाइल्ड हेल्थ एंड ह्यूमन डेवलपमेंट (P01HD078233) द्वारा समर्थित किया गया था। लेखक माउंट सिनाई में इकाहान स्कूल ऑफ मेडिसिन में लीका एलएमडी 6500 प्लेटफॉर्म तक पहुंच के लिए बायोरेपोसिटररी और पैथोलॉजी कोर का शुक्रिया अदा करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Methylbutane ThermoFisher Scientific O3551-4
Bioanalyzer Agilent G2939BA
Centrifuge tube ThermoFisher Scientific 339653 Conical sterile polypropylene centrifuge tubes, 50 mL
Cresyl violet acetate Sigma-Aldrich C5042
Cryostat Leica Biosystems CM3050 S
Delicate task wiper ThermoFisher Scientific 06-666
Disposable embedding mold ThermoFisher Scientific 1220
Distilled water Invitrogen 10977-015 DNase/RNase-Free
Ethanol, absolute (200 proof) ThermoFisher Scientific BP2818 Molecular biology grade
Glass PEN membrane slide Leica Microsystems 11505158
LCM system Leica Microsystems Leica LMD6500
Microscope cover glass ThermoFisher Scientific 12-545FP
Microscope slides ThermoFisher Scientific 12-550-15
OCT compound Electron Microscopy Sciences 102094-106
PCR tube with flat cap, 0.5 mL Axygen PCR-05-C LCM collection tubes
Permanent mounting medium Vector Laboratories H-5000
RNA isolation kit ThermoFisher Scientific KIT0204
RNase decontamination agent Sigma-Aldrich R2020 RNase decontamination agent for cleaning surfaces
Xylene Sigma-Aldrich 214736

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kardon, G. Development of the musculoskeletal system: Meeting the neighbors. Development. 138 (14), 2855-2859 (2011).
  2. Nichterwitz, S., Chen, G., et al. Laser capture microscopy coupled with Smart-seq2 for precise spatial transcriptomic profiling. Nature Communications. 7, 12139 (2016).
  3. Liu, A. Laser capture microdissection in the tissue biorepository. Journal of Biomolecular Techniques. 21 (3), 120-125 (2010).
  4. Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
  5. Schroeder, A., Mueller, O., et al. The RIN: An RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7 (3), (2006).
  6. Motch Perrine, S. M., Wu, M., et al. Mandibular dysmorphology due to abnormal embryonic osteogenesis in FGFR2-related craniosynostosis mice. Disease Models & Mechanisms. 12 (5), (2019).
  7. Holmes, G., O'Rourke, C., et al. Midface and upper airway dysgenesis in FGFR2-craniosynostosis involves multiple tissue-specific and cell cycle effects. Development. 145 (19), (2018).
  8. Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., Käller, M. MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).
  9. Tromp, G., Kuivaniemi, H., et al. Structure of a full-length cDNA clone for the preproα1(I) chain of human type I procollagen. Biochemical Journal. 253 (3), 919-922 (1988).
  10. De Wet, W., Bernard, M., et al. Organization of the human pro-alpha 2(I) collagen gene. Journal of Biological Chemistry. 262 (33), 16032-16036 (1987).
  11. Bonewald, L. F. The amazing osteocyte. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).
  12. Toyosawa, S., Shintani, S., et al. Dentin matrix protein 1 is predominantly expressed in chicken and rat osteocytes but not in osteoblasts. Journal of Bone and Mineral Research. 16 (11), 2017-2026 (2001).
  13. Guo, D., et al. Identification of osteocyte-selective proteins. Proteomics. 10 (20), 3688-3698 (2010).
  14. Ducy, P., Zhang, R., Geoffroy, V., Ridall, A. L., Karsenty, G. Osf2/Cbfa1: A transcriptional activator of osteoblast differentiation. Cell. 89 (5), 747-754 (1997).
  15. Nakashima, K., Zhou, X., et al. The novel zinc finger-containing transcription factor osterix is required for osteoblast differentiation and bone formation. Cell. 108 (1), 17-29 (2002).
  16. Termine, J. D., et al. Osteonectin, a bone-specific protein linking mineral to collagen. Cell. 26 (1), 99-105 (1981).
  17. Baldwin, C. T., Reginato, A. M., Prockop, D. J. A new epidermal growth factor-like domain in the human core protein for the large cartilage-specific proteoglycan. Evidence for alternative splicing of the domain. Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 15747-15750 (1989).
  18. Strom, C. M., Upholt, W. B. Isolation and characterization of genomic clones corresponding to the human type II procollagengene. Nucleic Acids Research. 12 (2), 1025-1038 (1984).
  19. Ninomiya, Y., Olsen, B. R. Synthesis and characterization of cDNA encoding a cartilage-specific short collagen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 81 (10), 3014-3018 (1984).
  20. Muragaki, Y., Mariman, E. C. M., et al. A mutation in the gene encoding the alpha 2 chain of the fibril-associated collagen IX, COL9A2, causes multiple epiphyseal dysplasia (EDM2). Nature Genetics. 12 (1), 103-105 (1996).
  21. Brewton, R. G., Wood, B. M., et al. Molecular cloning of the alpha 3 chain of human type IX collagen: linkage of the gene COL9A3 to chromosome 20q13.3. Genomics. 30 (2), 329-336 (1995).
  22. Newton, G., Weremowicz, S., et al. Characterization of human and mouse cartilage oligomeric matrix protein. Genomics. 24 (3), 435-439 (1994).
  23. Hiraki, Y., Mitsui, K., et al. Molecular cloning of human chondromodulin-I, a cartilage-derived growth modulating factor, and its expression in Chinese hamster ovary cells. European Journal of Biochemistry. 260 (3), 869-878 (1999).
  24. Smits, P., Li, P., et al. The transcription factors L-Sox5 and Sox6 are essential for cartilage formation. Developmental Cell. 1 (2), 277-290 (2001).
  25. Hayman, A. R., Jones, S. J., et al. Mice lacking tartrate-resistant acid phosphatase (Acp 5) have disrupted endochondral ossification and mild osteopetrosis. Development. 122 (10), 3151-3162 (1996).
  26. Dai, X. -M., Ryan, G. R., et al. Targeted disruption of the mouse colony-stimulating factor 1 receptor gene results in osteopetrosis, mononuclear phagocyte deficiency, increased primitive progenitor cell frequencies, and reproductive defects. Blood. 99 (1), 111-120 (2002).
  27. Gowen, M., Lazner, F., et al. Cathepsin K knockout mice develop osteopetrosis due to a deficit in matrix degradation but not demineralization. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (10), 1654-1663 (1999).
  28. Faccio, R., Takeshita, S., Zallone, A., Ross, F. P., Teitelbaum, S. L. c-Fms and the αvβ3 integrin collaborate during osteoclast differentiation. Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 749-758 (2003).
  29. Kim, N., Takami, M., Rho, J., Josien, R., Choi, Y. A novel member of the leukocyte receptor complex regulates osteoclast differentiation. The Journal of Experimental Medicine. 195 (2), 201-209 (2002).
  30. Mahalingam, M. Laser Capture Microdissection: Insights into Methods and Applications. Methods in Molecular Biology. 11723, 1-17 (2018).
  31. Goldsworthy, S. M., Stockton, P. S., Trempus, C. S., Foley, J. F., Maronpot, R. R. Effects of fixation on RNA extraction and amplification from laser capture microdissected tissue. Molecular Carcinogenesis. 25 (2), 86-91 (1999).
  32. Clément-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
  33. Farris, S., Wang, Y., Ward, J. M., Dudek, S. M. Optimized method for robust transcriptome profiling of minute tissues using laser capture microdissection and low-input RNA-seq. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 185 (2017).
  34. Espina, V., Heiby, M., Pierobon, M., Liotta, L. A. Laser capture microdissection technology. Expert Review of Molecular Diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).
  35. Martuscello, R. T., Louis, E. D., Faust, P. L. A stainless protocol for high quality RNA isolation from laser capture microdissected Purkinje cells in the human post-mortem cerebellum. Journal of Visualized Experiments. (143), (2019).
  36. Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection. BMC Cell Biology. 11 (95), (2010).
  37. Takahashi, N., Tarumi, W., Hamada, N., Ishizuka, B., Itoh, M. T. Cresyl violet stains mast cells selectively: Its application to counterstaining in immunohistochemistry. Zoological Science. 34 (2), 147-150 (2017).
  38. Sheldon, A. R., Almli, L., Ferriero, D. M. Copper/zinc superoxide dismutase transgenic brain in neonatal hypoxia-ischemia. Methods in Enzymology. 353, 389-397 (2002).
  39. Kolijn, K., Van Leenders, G. J. L. H. Comparison of RNA extraction kits and histological stains for laser capture microdissected prostate tissue. BMC Research Notes. 9, 17 (2016).
  40. Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
  41. Filliers, M., et al. Laser capture microdissection for gene expression analysis of inner cell mass and trophectoderm from blastocysts. Analytical Biochemistry. 408 (1), 169-171 (2011).
  42. Vandewoestyne, M., et al. Laser capture microdissection: Should an ultraviolet or infrared laser be used? Analytical Biochemistry. 439 (2), 88-98 (2013).
  43. Ayturk, U. RNA-seq in skeletal biology. Current Osteoporosis Reports. 17 (4), 178-185 (2019).
  44. Van Den Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
  45. Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: A molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
  46. Chen, J., et al. Spatial transcriptomic analysis of cryosectioned tissue samples with Geo-seq. Nature Protocols. 12 (3), 566-580 (2017).

Tags

विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 154 लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन मेकेल का उपास्थि मंडीबुलर हड्डी क्रेसिल वायलेट आरएनए अलगाव आरएनए अनुक्रमण
लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन माउस भ्रूणीय उपास्थि और जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए हड्डी
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wu, M., Kriti, D., van Bakel, H.,… More

Wu, M., Kriti, D., van Bakel, H., Jabs, E. W., Holmes, G. Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis. J. Vis. Exp. (154), e60503, doi:10.3791/60503 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter