Summary
Этот протокол описывает микрорассечение лазерного захвата для изоляции хряща и кости от свежезамороженных секций эмбриона мыши. Хрящ и кости могут быть быстро визуализированы кресилфиолетовым окрашиванием и собраны именно для получения высококачественной РНК для транскриптомического анализа.
Abstract
Лазерный захват микродиссекции (LCM) является мощным инструментом для изоляции конкретных типов клеток или областей, представляющих интерес от неоднородных тканей. Клеточная и молекулярная сложность скелетных элементов возрастает с развитием. Неоднородность тканей, например, на стыке хрящевых и косых элементов друг с другом или с окружающими тканями, является одним из препятствий для изучения развития хряща и костей. Наш протокол обеспечивает быстрый метод обработки тканей и изоляции хряща и кости, что дает высокое качество РНК для анализа экспрессии генов. Свежие замороженные ткани эмбрионов мыши разделены и краткое кресиловое фиолетовое окрашивание используется для визуализации хряща и кости с цветами, отличными от окружающих тканей. Слайды затем быстро обезвоживаются, и хрящи и кости изолированы впоследствии LCM. Минимизация воздействия вавных растворов в ходе этого процесса поддерживает целостность РНК. Хрящ мыши Мекеля и мандибулярная кость на E16.5 были успешно собраны, а анализ экспрессии генов показал дифференциальное выражение генов маркеров остеобластов, остеоцитов, остеокластов и хондроцитов. Высокое качество РНК также было выделено из целого ряда тканей и эмбрионального возраста. Этот протокол детали образца подготовки для LCM в том числе криоэмбеддинг, секции, окрашивания и обезвоживания свежих замороженных тканей, а также точной изоляции хряща и кости LCM в результате чего высокое качество РНК для транскриптомического анализа.
Introduction
Опорно-крестеская система представляет собой многокомпонентную систему, состоящую из мышц, соединительной ткани, сухожилия, связок, хряща и кости, иннерватизованной нервами и васкуляризованной кровеносными сосудами1. Скелетные ткани развиваются с возрастающей клеточной неоднородностью и структурной сложностью. Хрящ и кости развиваются из той же линии остеохондропрогенитора и тесно связаны между собой. Эмбриональный хрящ и кости развиваются в сочетании с мышцами, нервами, кровеносными сосудами и недифференцированным мезенхимом. Хрящ также может быть окружен кости, такие как хрящ Мекель и кондилярный хрящ в челюстно-прилежной кости. Эти ткани анатомически связаны и взаимодействуют друг с другом через внеклеточные сигналы во время развития. При изучении экспрессии генов при развитии хряща и костей одним из препятствий является неоднородность скелетных структур, состоящих из нескольких типов тканей. Точная изоляция конкретной ткани интереса является ключом к успешному транскрипционного анализа.
Лазерный захват микродиссекции (LCM) является мощным инструментом для изоляции типов клеток или регионов, представляющих интерес в неоднородных тканях, и воспроизводимый и чувствителен к одноклеточному уровню2. Он может точно цели и захвата клеток, представляющих интерес для широкого спектра вниз по течению анализы в транскриптомике, геномике и протеомике3,4. Качество изолированной РНК, ДНК или белка можно оценить с помощью биоанализа или эквивалентной платформы. Например, качество РНК указывается номером целостности РНК (RIN)5.
Здесь мы предоставляем протокол для быстрого окрашивания и изоляции хряща и кости LCM от свежих замороженных тканей. Мы используем эмбрион мыши, чтобы продемонстрировать, что этот протокол дает высококачественную РНК для последующего транскриптомического анализа, такого как секвенирование РНК (РНК-сек).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ткани мышей были получены в соответствии с Национальным иринститутам Здравоохранения Руководство по уходу и использованию лабораторных животных, и протоколы исследования были одобрены институционального ухода за животными и использования комитета в Icahn школы медицины на горе Синай.
1. Подготовка свежих замороженных specimen
- Вскрыть эмбрион или ткани, представляющие интерес. Встраивайте образец в одноразовую форму для встраивания с оптимальной температурой резки (OCT). Отрегулируйте ориентацию образца наконечником или иглой.
- Быстро замораживать образцы в сухом льду / метил-2-бутана ванны. Продолжайте следующий шаг или храните при -80 градусов по Цельсию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь.
2. Криосекция для лазерного захвата микродиссекции
- Разморозьте криостат и очистите внутренние поверхности 70% этанола. Лечить анти-ролл пластины и пару щипков с RNase обеззараживания агента. Установите криостат до желаемой температуры резки (от 18 до -22 градусов по Цельсию). Приготовьте крышкой контейнер с сухим льдом, поместив лист алюминиевой фольги на сухой лед для временного хранения секционных проб слайдов во время криосекции.
ПРЕДЕКТО: Сухой лед очень холодный. Всегда обрабатывать сухой лед с осторожностью и носить изолированные перчатки при обработке его. - Перенесите свежий замороженный образец в ведро сухого льда. Поместите слой соединения OCT на держатель образца криостата и немедленно поместите образец на верхнюю часть OCT с мягким давлением. Когда OCT полностью заморожен, закрепите держатель образцом в криостат разрезание руки.
- Оставьте образец в криостате на 15 мин, чтобы уравновесить температуру резки.
- Раздел ткани и собирать ломтики на полиэтилен овый нафталат (PEN) мембраны слайды толщиной 12 мкм. Выравнивание последовательных секций на мембране. После того, как один слайд завершен, позволяют разделы высохнуть в течение нескольких минут и передать слайд на фольгу в сухом контейнере льда, пока все необходимые слайды собраны.
- Храните слайды при -80 градусов по Цельсию в слайд-поле.
ПРИМЕЧАНИЕ: Толщина раздела выбрана для того чтобы увеличить количество ткани собранной пока позволяющ эффективную вырезыть ткани, и может поменять в зависимости от ткани интерес. Протокол можно приложить здесь. Держите слайды свободными от загрязнения RNase. Избегайте перепадов температуры. Хотя RINs РНК из слайдов, хранящихся до 6 месяцев, все еще могут указывать на высокое качество РНК, мы рекомендуем использовать слайды как можно скорее.
3. Подготовка образца для микродиссекции лазерного захвата
- Подготовьте решения для окрашивания и обезвоживания.
- Поместите 45 мл 80% этанола в каждой из трех 50 мл центрифуговых труб на льду. Этикетка их как #1, #2 и #3. Разбавить этанол свободной водой RNase/DNase.
- Поместите 45 мл 95% этанола в 50 мл центрифуги трубки на льду.
- Поместите 45 мл 100% этанола в 50 мл центрифуги трубки на льду.
- Поместите 45 мл ксилена в центрифугую трубку мощностью 50 мл при комнатной температуре.
ПРЕДЕКТО: Ксилен следует использовать в дымящийся капюшон.
- Оттепель ПЕН мембраны слайд кратко, поместив его против руки в перчатках, а затем мыть дважды по 30 с каждый в 45 мл 80% этанола (#1 и #2) с возбуждением в 50 мл центрифуги труб для удаления OCT.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы удалить OCT перед окрашиванием, чтобы предотвратить OCT ослаблены во время окрашивания от затемнения разделов. Силы могут быть использованы для облегчения удаления OCT, который не смывается агитации. - Положите слайд на листе алюминиевой фольги. Пипетка 0,8 мл 0,1% кресилфийного фиолетового в 50% этанола на слайдике и пятно на 30 с. Вымойте слайд в 45 мл 80% этанола (#3) на 30 с, а затем обезвоживают проходом по 30 с каждый через 45 мл 95% этанола, 100% этанола, и ксилл.
- Стенд слайды на деликатной задачей стеклоочиститель в течение 5 минут, чтобы слить ксилена и сухих секций.
ПРИМЕЧАНИЕ: Слайды должны быть высушены полностью перед LCM.
4. Лазерная микродиссекция захвата
ПРИМЕЧАНИЕ: Носите порошок без нитрила перчатки при выполнении LCM.
- Включите LCM микроскоп, лазер и компьютер. Войти на компьютер и запустить программное обеспечение. Поверните ключ к положению "На", чтобы запустить лазер. Когда зеленый свет (Лазер) нажмете красную кнопку, чтобы активировать лазер, а затем свет (Лазер) становится красным, указывая лазер готов к использованию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Лазеру нужно около 10 минут, чтобы согреться. - Настройка коллекторских трубок.
- Вставьте крышку трубки полимеразы 0,5 мл полимеразы (ПЦР) в коллектор.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите подходящий коллектор для нужных трубок ПЦР (0,2 или 0,5 мл). - Пипетка 50 л извлечения буфера (предоставленного комплектом изоляции РНК, перечисленным в таблице материалов)в крышку трубки сбора 0,5 мл.
- Вставьте устройство сбора в микроскоп.
- В окне устройства коллектора изменений нажмите на кнопку Move to Reference Point, чтобы переместить коллектор в точку отсчета (RP). Отрегулируйте фокус, чтобы четко просмотреть RP. Нажмите на стрелки, чтобы переместить RP в центр представления.
- Вставьте крышку трубки полимеразы 0,5 мл полимеразы (ПЦР) в коллектор.
- Нагрузка образца слайдов.
- Нажмите левую кнопку Разгрузки в панели инструментов, чтобы понизить держатель слайда.
- Поместите слайд в держатель, с разделом ткани, обращенным вниз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта ориентация гарантирует, что захваченные участки ткани попадают в крышку коллекторской трубки под действием силы тяжести. - Вставьте держатель обратно на сцену.
- Настройка параметров лазера.
- Выберите опцию управления лазерным меню или нажмите на значок Laser.
- Отрегулируйте эти параметры по желанию: мощность,мощность лазера; Диафрагма,ширина лазера; и скорость, скорость резки в Draw и Cut режиме.
ПРИМЕЧАНИЕ: Испытать лазер в области из интереса. Более высокая мощность или большая диафрагма облегчает разрезание, но наносит больший ущерб клеткам. Отрегулируйте комбинацию мощности, диафрагмы и скорости, чтобы получить эффективную резку и минимальный ущерб ткани. Например, мощность No 40, диафрагма No 5, а скорость No 7 для хрящевой ткани на участке 12 мкм.
- Выберите и вырежьте области, представляющие интерес.
- Начните с 5x цели и найти области, представляющие интерес, а затем переключиться на цель (5x, 10x, или 40x), что лучше всего показывает область интереса.
ПРИМЕЧАНИЕ: После кресилфийно-фиолетового окрашивания хрящи окрашены пурпурными, а минерализованные ткани кажутся коричневыми или черными, отличающимися от других тканей. Изображения могут быть сохранены с помощью Сохраненные изображения Как из меню файла. - Выберите трубку для сбора (A, B, C, D), нажав на отметку на коллекторе.
- Выберите Переместить и вырезать или рисовать и вырезать. В режиме Move and Cut образец вырезается вручную, используя мышь или сенсорную ручку, чтобы рисовать фигуры от руки. В режиме Draw и Cut фигуры могут быть нарисованы от руки с помощью мыши или сенсорного экрана пера для последующей резки. Нажмите кнопку Start Cut, чтобы инициировать лазерную резку.
- Как только разрез завершен, целевая ткань с мембраной ПЕН-клуба попадает в крышку коллекторской трубки под действием силы тяжести. Повторите 4.5, чтобы объединить несколько областей, представляющих интерес, если это необходимо.
ПРИМЕЧАНИЕ: Повторение порезов или увеличение мощности или диафрагмы может быть необходимо, если ткань не падает в крышку трубки сбора из-за неполной резки. Минерализованная кость (коричневая или черная) не может быть разрезана непосредственно лазером.
- Начните с 5x цели и найти области, представляющие интерес, а затем переключиться на цель (5x, 10x, или 40x), что лучше всего показывает область интереса.
- Разгрузите коллектор и тщательно закройте трубку ПЦР. Поместите микрорасчленированные ткани в сухой лед. Продолжайте следующий шаг или храните при -80 градусов по Цельсию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь. Повторите 4,2 до 4,6 для следующей выборки.
5. Лизиз микрорасчлененных тканей и изоляции РНК
- Оттепель микрорасчлененных тканей при комнатной температуре. Центрифуга кратко и инкубировать образцы в течение 30 минут при 42 градусах Цельсия.
- После инкубации, спина лисис буфера вниз в 0,5 мл ПЦР трубки. Выполните обработку DNase и экстракцию РНК с помощью комплекта изоляции РНК (см. Таблицу Материалов)в соответствии с инструкциями производителя.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Корональные секции свежих замороженных тканей мыши на E16.5 были использованы для демонстрации изоляции и сбора хряща Мекеля (MC), кондилярного хряща и мандибулярной кости LCM. Эмбрионы мыши на E16.5 были расчленены и встроены в криогенные формы с соединением OCT. Образцы в плесенях быстро замораживались в сухом льду и метил-2-бутановой ванне и хранились при -80 градусов по Цельсию.
Для демонстрации кресилофийного фиолетового окрашивания хряща и костей было проведено криосекция в корональной плоскости и собраны пробы на слайдах микроскопа. Разделы были промыты, окрашены и обезвожены после вышеуказанного протокола (шаг 3.2-3.4). Слайды были высушены и установлены с постоянным монтажом среды. Все исследуемые хрящи были окрашены пурпурным (MC, кондилярный хрящ, носовой перегородки хряща, коварный хрящ, приморский хрящ пресфеноидной кости, хрящ примордии радиуса и ulna) и все минерализованные ткани были окрашенными иличерными (рисунок 1A-E). И хрящ, и кости легко отличались от других тканей на нескольких анатомических участках.
Для LCM, головки зароножей на E16.5 были разделены в корональной плоскости на слайдах мембраны PEN на толщине 12 мкм, и 6-8 последовательных разделов были собраны в горку и сохранены на -80 C. ОКТ был удален, а секции были окрашены кресиловым фиолетовым и обезвожены после описанного выше протокола (шаг 3.2-3.4). MC, кондилярный хрящ, и области мандибулярной кости были выбраны и изолированы LCM(Рисунок 2). Выбранные области упали в буфер лисиса в крышке трубки для сбора. Чтобы получить достаточную РНК для секвенирования, мы объединили 10 регионов MC, 10 областей кондилярного хряща или 4 области мандибулирующей кости в каждую трубку сбора в качестве одного образца, соответственно.
РНК была извлечена с помощью комплекта изоляции РНК в соответствии с инструкциями производителя. Общая РНК была проанализирована с помощью биоанализа(рисунок 3A-B). Чтобы проверить влияние кресилофильного окрашивания на качество РНК, мы сравнили РНК из образцов мандибулярной кости, окрашенных кресиловым фиолетовым и образцами без окрашивания (минерализованная ткань видна без окрашивания, но кресиловое фиолетовое окрашивание усиливает видимость, чтобы отличить кость от окружающих тканей). Никакой существенной разницы в целостности РНК не наблюдалось между окрашенными образцами (n No 4) и образцами без окрашивания (n No 4), что указывает на быстрое кресиловое фиолетовое окрашивание в этом протоколе, оказывает незначительное влияние на качество РНК (P 0.858, двуххвостый Welch's t-test, Рисунок 3C). Мы использовали наш протокол для LCM различных тканей на разных стадиях развития и RINs были измерены, что свидетельствует о высоком качестве РНК(рисунок 3D). Средняя урожайность РНК из MC, кондилярного хряща и мандибулярной кости составила 7,50 и 1,45 нг, 12,55 и 2,75 нг, и 33,02 и 7,63 нг(рисунок 3E) и выход / площадь была 19,73 и 3,82 нг/мм2, 26,70 и 5,84 нг /мм2, и 17,23 и 3,98 нг /мм2, соответственно (Рисунок 3F), без значительной разницы между tlarissues (MC, P 0.383; кондилярный хрящ против мандибулярной кости, P 0.260; MC против мандибулярной кости, P 0,674).
Библиотеки были подготовлены и секвенированы, как ранее описано6,7. Репрезентативный размер кДН составил около 500 б.п.(рисунок 4А). Данные RNA-seq были проанализированы с помощью Multi'C8. Мы проанализировали данные РНК-сек из 18 образцов LCM (MC1-6, хрящ Мекеля; C1-6, кондилярный хрящ; М1-6, мандибулярная кость). Средние значения качества по каждой базовой позиции в считывателях были сгенерированы Fast'C, что указывает на очень хорошее качество вызовов(рисунок 4B). Чтение выравнивание было проанализировано с Пикард(Рисунок 4C). Чтения показали высокие выровненные проценты и средний процент выровненных читает составил 75%. Генное покрытие было проанализировано с Пикардом(Рисунок 4D), который указал хорошее представление вдоль стенограммы от 5'до конца 3'.
Дифференциальный анализ экспрессии генов был выполнен6,7. Существовали 4,006 генов значительно дифференцированы (P qlt; 0.05) между мандибулярной кости и MC(Рисунок 5A). Гены, характерные для остеобластов или остеоцитов(Col1a19, Col1a210, Dkk111, Dmp112, Dstn13, Runx214, Sp715, и Sparc16) были более высоко выражены в мандибулярной кости по сравнению с MC, в то время как хондроцитов конкретных генов(Acan17, Col2a 199 , Col2a 19 Col9a220, Col9a321, Comp22, Lect123, и Sox524) были более высоко выражены в MC по сравнению с нижней кости(Рисунок 5B и таблица 1). Кроме того, остеокласт маркеры, такие как Acp525, Csf1r26, Ctsk27, Itgb328, и Оскар29 были также определены как более высоко выражены в челюстной кости по сравнению с MC (Рисунок 5B и Таблица 1), что свидетельствует об успешной изоляции целевых тканей.
Рисунок 1: Представитель кресилфийнофийное окрашивание хряща и кости в корональных секциях эмбриона мыши на E16.5. (A) Хрящ Мекеля и hemimandible. (B) Хрящ Мекеля, кондилярный хрящ, и hemimandible. (C) Носовая перегородка и челюсть. (D) Хрящ примордиум пресфеноидной кости и небной кости. (E) Хрящ примордия радиуса, хрящ примордия ультяной, и костлявый хрящ. C - кондилярный хрящ; CC - косовсего хряща; CP - хрящ примордия пресфеноидной кости; М и гемнемимелетие; Mc и хрящ Мекеля; MX и челюсть; NS - носовая перегородка; ПЛ - небная кость; Р - хрящ примордия радиуса; U й хрящ приморский ульна. Шкала бар 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Представительные регионы, изолированные LCM и собранные для РНК-сек. (A-C) Представитель окрашенных MC (A), кондилярный хрящ (B), и hemimandible с MC уже изолированы (C) в криосечении перед LCM. (D-F) Области в A, B и C после целевых тканей были выделены LCM. Шкала бар 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: качество РНК и количество образцов LCM. (A-B) Представитель электроферограмма (A) и связанных с ним геля изображения (B) от биоанализа для образца мандибулярной кости. (C) RINs общей РНК из образцов мандибулярной кости окрашенных кресилфиолетовый (n No 4) или без окрашивания (n No 4). (D) RINs общей РНК из различных тканей, изолированных LCM. Хрящ Мекеля на Уровне E16.5 (n No 6); Кондилярный хрящ при E16.5 (n No 6); Мандибулярная кость при E16.5 (n No 6); Носовой перегородки хряща при E14.5 (n No 6); Мозг на E14.5 (n No 6); Мозг на E16.5 (n No 7); Мозг на E18.5 (n No 4). (E) Выход общей РНК из трех тканей. Каждый MC или кондилярный образец хряща представлял собой бассейн из 10 микрорассеченных областей хряща, и каждый образец мандибулярной кости представлял собой бассейн из 4 микрорасчленированных областей хемиминдибль. (F) Выход на единицу области (нг / мм2) в каждой ткани. Данные являются средними s.e.m. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Качество библиотек и данных RNA-seq, полученных из образцов LCM. (A) Представитель cDNA размеров библиотеки из образца мандибулярной кости определяется биоанализатором. (B-D) Анализ качества РНК-сека из 18 образцов LCM (MC1-6, хрящ Мекеля; C1-6, кондилярный хрящ; M1-6, мандибулярная кость) от Multi'C. (B) Значения среднего качества в каждой базовой позиции в считывателях были сгенерированы Fast'C. Фон графика делит оси y на очень хорошее качество вызовов (зеленый), звонки разумного качества (оранжевый), и звонки низкого качества (красный). (C) Выравнивание читает был проанализирован Пикард. Резюме отображается как проценты выровненных считываемых. (D) Нормализованное покрытие генов проанализировано с Пикардом. На графике указывается относительное среднее покрытие вдоль стенограммы от 5' конца (слева) до 3' конца (справа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Анализ дифференциальной экспрессии данных РНК-сек из мандибулярной кости и MC, изолированных LCM. (A) Иерархическая кластеризация 4,006 генов значительно дифференцирована (P qlt; 0.05) между челюстной костью и MC. Для каждой ткани использовались три биологических репликаты. М1-3, мандибулярная кость; MC1-3, MC. (B) Вулкан график показаны изменения складки и P-значения дифференциально выраженных генов между мандибулярной кости и MC. Примеры весьма дифференциально выраженных клеточных конкретных генов показаны: остеобласт и остеоцит маркеры в синем, остеокласт маркеры в зеленом, и хондроцитмаркеры в красном. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Ген | Тип ячейки | log2FoldChange | Среднее выражение | Скорректированное значение P |
| Col1a1 | Остеобласт/Остеоцит | 2.64 | 12.94 | 2.22E-05 |
| Col1a2 | Остеобласт/Остеоцит | 3.41 | 12.87 | 8.27E-07 |
| Dkk1 | Остеобласт/Остеоцит | 7.59 | 2.01 | 5.21E-03 |
| Dmp1 | Остеобласт/Остеоцит | 9.73 | 3.42 | 3.19E-04 |
| Дстн | Остеобласт/Остеоцит | 2.51 | 6.87 | 5.73E-07 |
| Runx2 | Остеобласт/Остеоцит | 1.24 | 8.62 | 4.08E-02 |
| Sp7 | Остеобласт/Остеоцит | 2.24 | 6.95 | 5.81E-03 |
| Sparc | Остеобласт/Остеоцит | 3.40 | 12.26 | 5.56E-09 |
| Acp5 | Остеокласт | 3.38 | 5.74 | 6.46E-06 |
| Csf1r | Остеокласт | 2.01 | 5.80 | 1.17E-04 |
| Ctsk | Остеокласт | 3.19 | 7.56 | 5.73E-07 |
| Itgb3 | Остеокласт | 2.88 | 5.37 | 2.43E-04 |
| Оскар | Остеокласт | 3.41 | 2.67 | 1.63E-04 |
| Акан | Хондроцит | -5.23 | 5.01 | 2.76E-04 |
| Col2a1 | Хондроцит | -3.61 | 9.47 | 3.29E-03 |
| Col9a1 | Хондроцит | -7.01 | 3.58 | 5.51E-03 |
| Col9a2 | Хондроцит | -5.40 | 3.76 | 2.60E-03 |
| Col9a3 | Хондроцит | -6.63 | 3.80 | 2.90E-02 |
| Комп | Хондроцит | -5.86 | 1.54 | 7.51E-03 |
| Lect1 | Хондроцит | -7.37 | 1.34 | 2.35E-02 |
| Sox5 | Хондроцит | -2.88 | 4.43 | 6.06E-04 |
Таблица 1: Дифференциальное выражение известных генов в различных типах клеток костей и хрящей (мандибулярная кость против MC).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
LCM позволяет обезолюрить обогащенные или однородные популяции клеток от неоднородных тканей. Его преимущества включают быстрый и точный захват клеток в контексте in vivo, в то время как потенциальные недостатки включают в себя его время, дорого, и ограничивается необходимостью для пользователя распознать различные субпопуляции в указанной выборке30. Этот протокол содержит подробную информацию о LCM эмбрионального хряща мыши и кости, подчеркивая использование кресилфийного фиолетового окрашивания в быстрой процедуре для визуализации хряща и кости для точного сбора ткани при сохранении высокой целостности РНК для последующего анализа РНК-сек. Одним из ограничений этого протокола является то, что система LCM, используемая здесь, не в состоянии напрямую пересекать минерализованные ткани (например, нижнечелюстную ткань в черном цвете на рисунке 2C); в результате, вся область кости должна быть расчленена. Примечательно, что микрорасчлененные окостененные регионы, изолированные LCM, не однородны и включают по крайней мере субпопуляции остеобластов, остеоцитов и остеокластов (таблица 1). Тем не менее, обогащение LCM является ценным, как наше предыдущее исследование показало, что транскрипционные изменения в конкретных субпопуляций, таких как остеокласты в микрорассеченной костной ткани все еще могут быть обнаружены РНК-сек6.
Для анализа экспрессии генов мы оптимизировали подготовку образцов и процедуру LCM для высокого качества РНК и урожайности. Наш протокол начинается со свежих замороженных тканей. Свежие замороженные секции ткани позволяют отличное количество и качество извлеченной РНК3,так как мРНК чувствительна к стандартным методам фиксации31. РНК быстро деградирует в результате загрязнения RNase, и поддержание среды, свободной от RNase, на протяжении всей подготовки образцов, LCM и изоляции РНК имеет решающее значение для успешного применения. Воздействие воды при обработке секций вредно для качества РНК31,32. Наш протокол ограничивает такое воздействие, при этом самый высокий уровень ваквого воздействия является 50% во время кресилфийного фиолетового окрашивания. Мы проверили, что быстрое окрашивание (30 с) с 0,1% кресил фиолетовый в 50% этанола дает различимый цвет хряща и не снижает целостность РНК для анализа вниз по течению, таких как низкий вход РНК-сек(Рисунок 3C и Рисунок 4). Урожайность/область (нг/мм2) составляет примерно 20 нг/мм2 (рисунок 3F),что аналогично или выше, чем предыдущие оптимизированные методы33. В соответствии с плотностью клеток в MC и мандибулярной кости6, мы оцениваем, что с этим протоколом средняя урожайность из одной клетки составляет примерно 5 пг РНК на клетку, и 1-5 нг от общей РНК могут быть извлечены из 200-1000 клеток, которые могут быть использованы для низководного РНК-сек6,7,33. Эта эффективность доходности намного выше, чем установленные методы LCM34, а также выше или аналогичны последним оптимизированным протоколам33,35.
Способность различать различные типы клеток в гистологических секциях имеет важное значение для точного сбора конкретных тканей, представляющих интерес. Кресил фиолетовый является гидрофильной, основные пятна, что связывает с отрицательно заряженных нуклеиновой кислоты36. Это свойство делает его полезным для противодействия с селективностью клеточного типа37, и это стандартное гистологическое пятно для нейронов38. Кресил фиолетовый был использован в LCM для различных тканей, обеспечивая хорошую морфологию тканей и высокое качество РНК33,36,39,40. По сравнению с другими методами окрашивания, кресиловое фиолетовое окрашивание обеспечивает цитоплазматические и ядерные детали, а также низкий уровень деградации РНК32. Мы демонстрируем здесь, что кресиловое фиолетовое окрашивание является простым и быстрым методом визуализации хряща и кости, и что ткани, окрашенные этим методом, сохраняет высокую целостность РНК. Ксиленов лечение обычно используется для обезвоживания тканей до LCM35,36,41,42. Мы используем ксилен для повышения визуализации морфологии тканей35, которая имеет важное значение для различения целевых тканей, особенно на пен-мембранных слайдах, которые не так оптически ясны, как простые стеклянные слайды. Мы не нашли существенного возникновения потери секции от PEN слайдов во время окрашивания и стирки шаги, даже с волнением, чтобы удалить OCT.
Микродроплат или микрофлюиды на основе одноклеточных РНК-сек (scRNA-seq) является высокой пропускной способ для анализа транскриптомов тканей с неоднородными типами клеток и начал использоваться в скелетной биологии43. В отличие от LCM, scRNA-seq включает в себя ферментативную и/или механическую дезагрегацию тканей в одиночные клетки. Большинство протоколов для одноклеточного препарата требуют инкубации тканей при комнатной температуре или 37 градусов по Цельсию в течение длительных периодов, что изменяет транскриптом44,45. Кроме того, изоляция одиночных клеток в хрящевой ткани и кости может быть физически ограничена сложностью скелетного элемента трабекуляризации и минерализации. Это все еще техническая задача, чтобы изолировать достаточное количество жизнеспособных клеток из скелетных тканей, которые точно представитель клеточного разнообразия тканей in vivo, и неполная диссоциация клеток может вызвать предвзятость в обнаружении типов клеток43. В то время как scRNA-seq позволяет идентифицировать различные типы клеток, глубина секвенирования низкая, а типичные подходы секвенирования захватывают 3' транскриптов ы и не позволяют альтернативного анализа сращивания. Массовый РНК-сэк LCM-производной ткани гомогенизируют различия в клетках, но позволяет всестороннее обнаружение стенограммы и альтернативный анализ сращивания. LCM поэтому особенно полезно для скелетных тканей, которые не легко отделяются от окружающих тканей и внутренне сложной, и свежие замороженные подготовки ткани может сохранить как транскрипционные профили и РНК целостности для транскрипционного анализа. Еще одна слабость скрна-сека заключается в том, что после одноклеточного препарата пространственная информация о клетках теряется. Сочетание LCM и scRNA-seq было разработано, чтобы позволить изучение транскриптома небольшой выборки из определенных географических местоположений (Geo-seq)46, что является еще одним подходом использования LCM для изучения региональной экспрессии генов.
Таким образом, этот протокол содержит подробную информацию об оптимизированной LCM хряща и кости, подчеркивая использование кресилфийного фиолетового окрашивания в быстрой процедуре визуализации хряща и кости для точного сбора ткани при сохранении высокой целостности РНК для последующего анализа РНК-сек. Этот протокол был успешно использован для LCM хряща и кости на различных стадиях развития для анализа экспрессии генов6,7,а также может быть использован для других тканей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальным институтом стоматологических и краниофациальных исследований (R01DE022988) и Национальным институтом здоровья детей и развития человека (P01HD078233) и Национальным институтом здоровья детей и развития человека (P01HD07823). Авторы благодарят Biorepository и патологии Core для доступа к Leica LMD 6500 платформы в Icahn школы медицины на горе Синай.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Methylbutane | ThermoFisher Scientific | O3551-4 | |
| Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | |
| Centrifuge tube | ThermoFisher Scientific | 339653 | Conical sterile polypropylene centrifuge tubes, 50 mL |
| Cresyl violet acetate | Sigma-Aldrich | C5042 | |
| Cryostat | Leica Biosystems | CM3050 S | |
| Delicate task wiper | ThermoFisher Scientific | 06-666 | |
| Disposable embedding mold | ThermoFisher Scientific | 1220 | |
| Distilled water | Invitrogen | 10977-015 | DNase/RNase-Free |
| Ethanol, absolute (200 proof) | ThermoFisher Scientific | BP2818 | Molecular biology grade |
| Glass PEN membrane slide | Leica Microsystems | 11505158 | |
| LCM system | Leica Microsystems | Leica LMD6500 | |
| Microscope cover glass | ThermoFisher Scientific | 12-545FP | |
| Microscope slides | ThermoFisher Scientific | 12-550-15 | |
| OCT compound | Electron Microscopy Sciences | 102094-106 | |
| PCR tube with flat cap, 0.5 mL | Axygen | PCR-05-C | LCM collection tubes |
| Permanent mounting medium | Vector Laboratories | H-5000 | |
| RNA isolation kit | ThermoFisher Scientific | KIT0204 | |
| RNase decontamination agent | Sigma-Aldrich | R2020 | RNase decontamination agent for cleaning surfaces |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 |
References
- Kardon, G. Development of the musculoskeletal system: Meeting the neighbors. Development. 138 (14), 2855-2859 (2011).
- Nichterwitz, S., Chen, G., et al. Laser capture microscopy coupled with Smart-seq2 for precise spatial transcriptomic profiling. Nature Communications. 7, 12139 (2016).
- Liu, A. Laser capture microdissection in the tissue biorepository. Journal of Biomolecular Techniques. 21 (3), 120-125 (2010).
- Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
- Schroeder, A., Mueller, O., et al. The RIN: An RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7 (3), (2006).
- Motch Perrine, S. M., Wu, M., et al. Mandibular dysmorphology due to abnormal embryonic osteogenesis in FGFR2-related craniosynostosis mice. Disease Models & Mechanisms. 12 (5), (2019).
- Holmes, G., O'Rourke, C., et al. Midface and upper airway dysgenesis in FGFR2-craniosynostosis involves multiple tissue-specific and cell cycle effects. Development. 145 (19), (2018).
- Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., Käller, M. MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).
- Tromp, G., Kuivaniemi, H., et al. Structure of a full-length cDNA clone for the preproα1(I) chain of human type I procollagen. Biochemical Journal. 253 (3), 919-922 (1988).
- De Wet, W., Bernard, M., et al. Organization of the human pro-alpha 2(I) collagen gene. Journal of Biological Chemistry. 262 (33), 16032-16036 (1987).
- Bonewald, L. F. The amazing osteocyte. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).
- Toyosawa, S., Shintani, S., et al. Dentin matrix protein 1 is predominantly expressed in chicken and rat osteocytes but not in osteoblasts. Journal of Bone and Mineral Research. 16 (11), 2017-2026 (2001).
- Guo, D., et al. Identification of osteocyte-selective proteins. Proteomics. 10 (20), 3688-3698 (2010).
- Ducy, P., Zhang, R., Geoffroy, V., Ridall, A. L., Karsenty, G. Osf2/Cbfa1: A transcriptional activator of osteoblast differentiation. Cell. 89 (5), 747-754 (1997).
- Nakashima, K., Zhou, X., et al. The novel zinc finger-containing transcription factor osterix is required for osteoblast differentiation and bone formation. Cell. 108 (1), 17-29 (2002).
- Termine, J. D., et al. Osteonectin, a bone-specific protein linking mineral to collagen. Cell. 26 (1), 99-105 (1981).
- Baldwin, C. T., Reginato, A. M., Prockop, D. J. A new epidermal growth factor-like domain in the human core protein for the large cartilage-specific proteoglycan. Evidence for alternative splicing of the domain. Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 15747-15750 (1989).
- Strom, C. M., Upholt, W. B. Isolation and characterization of genomic clones corresponding to the human type II procollagengene. Nucleic Acids Research. 12 (2), 1025-1038 (1984).
- Ninomiya, Y., Olsen, B. R. Synthesis and characterization of cDNA encoding a cartilage-specific short collagen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 81 (10), 3014-3018 (1984).
- Muragaki, Y., Mariman, E. C. M., et al. A mutation in the gene encoding the alpha 2 chain of the fibril-associated collagen IX, COL9A2, causes multiple epiphyseal dysplasia (EDM2). Nature Genetics. 12 (1), 103-105 (1996).
- Brewton, R. G., Wood, B. M., et al. Molecular cloning of the alpha 3 chain of human type IX collagen: linkage of the gene COL9A3 to chromosome 20q13.3. Genomics. 30 (2), 329-336 (1995).
- Newton, G., Weremowicz, S., et al. Characterization of human and mouse cartilage oligomeric matrix protein. Genomics. 24 (3), 435-439 (1994).
- Hiraki, Y., Mitsui, K., et al. Molecular cloning of human chondromodulin-I, a cartilage-derived growth modulating factor, and its expression in Chinese hamster ovary cells. European Journal of Biochemistry. 260 (3), 869-878 (1999).
- Smits, P., Li, P., et al. The transcription factors L-Sox5 and Sox6 are essential for cartilage formation. Developmental Cell. 1 (2), 277-290 (2001).
- Hayman, A. R., Jones, S. J., et al. Mice lacking tartrate-resistant acid phosphatase (Acp 5) have disrupted endochondral ossification and mild osteopetrosis. Development. 122 (10), 3151-3162 (1996).
- Dai, X. -M., Ryan, G. R., et al. Targeted disruption of the mouse colony-stimulating factor 1 receptor gene results in osteopetrosis, mononuclear phagocyte deficiency, increased primitive progenitor cell frequencies, and reproductive defects. Blood. 99 (1), 111-120 (2002).
- Gowen, M., Lazner, F., et al. Cathepsin K knockout mice develop osteopetrosis due to a deficit in matrix degradation but not demineralization. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (10), 1654-1663 (1999).
- Faccio, R., Takeshita, S., Zallone, A., Ross, F. P., Teitelbaum, S. L. c-Fms and the αvβ3 integrin collaborate during osteoclast differentiation. Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 749-758 (2003).
- Kim, N., Takami, M., Rho, J., Josien, R., Choi, Y. A novel member of the leukocyte receptor complex regulates osteoclast differentiation. The Journal of Experimental Medicine. 195 (2), 201-209 (2002).
- Mahalingam, M. Laser Capture Microdissection: Insights into Methods and Applications. Methods in Molecular Biology. 11723, 1-17 (2018).
- Goldsworthy, S. M., Stockton, P. S., Trempus, C. S., Foley, J. F., Maronpot, R. R. Effects of fixation on RNA extraction and amplification from laser capture microdissected tissue. Molecular Carcinogenesis. 25 (2), 86-91 (1999).
- Clément-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
- Farris, S., Wang, Y., Ward, J. M., Dudek, S. M. Optimized method for robust transcriptome profiling of minute tissues using laser capture microdissection and low-input RNA-seq. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 185 (2017).
- Espina, V., Heiby, M., Pierobon, M., Liotta, L. A. Laser capture microdissection technology. Expert Review of Molecular Diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).
- Martuscello, R. T., Louis, E. D., Faust, P. L. A stainless protocol for high quality RNA isolation from laser capture microdissected Purkinje cells in the human post-mortem cerebellum. Journal of Visualized Experiments. (143), (2019).
- Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection. BMC Cell Biology. 11 (95), (2010).
- Takahashi, N., Tarumi, W., Hamada, N., Ishizuka, B., Itoh, M. T. Cresyl violet stains mast cells selectively: Its application to counterstaining in immunohistochemistry. Zoological Science. 34 (2), 147-150 (2017).
- Sheldon, A. R., Almli, L., Ferriero, D. M. Copper/zinc superoxide dismutase transgenic brain in neonatal hypoxia-ischemia. Methods in Enzymology. 353, 389-397 (2002).
- Kolijn, K., Van Leenders, G. J. L. H. Comparison of RNA extraction kits and histological stains for laser capture microdissected prostate tissue. BMC Research Notes. 9, 17 (2016).
- Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
- Filliers, M., et al. Laser capture microdissection for gene expression analysis of inner cell mass and trophectoderm from blastocysts. Analytical Biochemistry. 408 (1), 169-171 (2011).
- Vandewoestyne, M., et al. Laser capture microdissection: Should an ultraviolet or infrared laser be used? Analytical Biochemistry. 439 (2), 88-98 (2013).
- Ayturk, U. RNA-seq in skeletal biology. Current Osteoporosis Reports. 17 (4), 178-185 (2019).
- Van Den Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
- Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: A molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
- Chen, J., et al. Spatial transcriptomic analysis of cryosectioned tissue samples with Geo-seq. Nature Protocols. 12 (3), 566-580 (2017).
