Summary
Detta protokoll beskriver laserinfångnings mikrodissektion för isolering av brosk och ben från färska frysta delar av mus embryot. Brosk och ben kan snabbt visualiseras genom cresyl violett färgning och samlas just för att ge hög kvalitet RNA för transcriptomic analys.
Abstract
Laser Capture microdissection (LCM) är ett kraftfullt verktyg för att isolera specifika celltyper eller regioner av intresse från heterogena vävnader. Skelett elementens cellulära och molekylära komplexitet ökar med utvecklingen. Vävnad heterogenitet, såsom vid gränssnittet av brosk och bendefekter element med varandra eller med omgivande vävnader, är ett hinder för studiet av att utveckla brosk och ben. Vårt protokoll ger en snabb metod för vävnads bearbetning och isolering av brosk och ben som ger hög kvalitet RNA för gen uttrycks analys. Färska frysta vävnader av mus embryon är sektioneras och kort cresyl violett färgning används för att visualisera brosk och ben med färger skiljer sig från omgivande vävnader. Diabilder är sedan snabbt uttorkad, och brosk och ben isoleras därefter av LCM. Minimering av exponering för vattenlösningar under denna process upprätthåller RNA-integritet. Mus Meckels brosk och mandibular ben vid E 16.5 har framgångsrikt samlats in och gen uttrycks analys visade differential uttryck av markörgener för osteoblaster, osteocyter, osteoklaster och kondrocyter. Hög kvalitet RNA isolerades också från en rad vävnader och embryonala åldrar. Detta protokoll specificerar provpreparering för LCM inklusive kryoinbäddning, snittning, färgning och torkning av färska frysta vävnader, och exakt isolering av brosk och ben av LCM vilket resulterar i högkvalitativt RNA för transkriptomisk analys.
Introduction
Rörelseapparaten är ett multikomponentsystem som består av muskler, bindväv, senor, ligament, brosk, och ben, innerveras av nerver och vaskulariserad av blodkärl1. Skelett vävnaderna utvecklas med ökande cellulära heterogenitet och strukturell komplexitet. Brosk och ben utvecklas från samma osteochondroprogenitor härstamning och är mycket relaterade. Embryonala brosk och ben utvecklas i samband med muskler, nerver, blodkärl, och odifferentierad Mesenchyme. Brosk kan också vara omgiven av ben, såsom Meckels brosk och kondylar brosk inom mandibular benet. Dessa vävnader är anatomiskt associerade och interagera med varandra genom extracellulära signaler under utvecklingen. I studiet av genuttryck i utvecklingen av brosk och ben, ett hinder är heterogenitet skelett strukturer består av flera vävnadstyper. Exakt isolering av den specifika vävnaden av intresse är nyckeln för framgångsrik transkriptionell analys.
Laser Capture microdissection (LCM) är ett kraftfullt verktyg för att isolera celltyper eller regioner av intresse inom heterogena vävnader, och är reproducerbar och är känslig för Single cell Level2. Det kan exakt rikta och fånga celler av intresse för ett brett spektrum av nedströms analyser i transcriptomics, genomik, och proteomik3,4. Kvaliteten på det isolerade RNA, DNA, eller protein kan bedömas med en bioanalyzer eller motsvarande plattform. Till exempel indikeras RNA-kvalitet av RNA-integritetnumret (RIN)5.
Här ger vi ett protokoll för snabb färgning och isolering av brosk och ben av LCM från färska frysta vävnader. Vi använder mus embryot för att visa att detta protokoll ger högkvalitativt RNA för efterföljande transkriptomisk analys, såsom RNA-sekvensering (RNA-SEQ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vävnader från möss erhölls i enlighet med National Institutes of Health Guide för vård och användning av försöksdjur, och studieprotokoll godkändes av den institutionella djuromsorg och användning kommittén vid Icahn School of Medicine vid berget Sinai.
1. beredning av färskt fryst preparat
- Dissekera embryot eller vävnad av intresse. Bädda in provet i en disponibel inbäddning mögel med optimal skärtemperatur (OCT) förening. Justera preparens orientering med en spets eller nål.
- Snabbt frysa proverna i en torr is/metyl-2-butan bad. Fortsätt till nästa steg eller förvara vid-80 ° c.
Anmärkning: Protokollet kan pausas här.
2. kryosektionering för Laserinfångnings mikrodissektion
- Avfrostning av kryostaten och rengör invändiga ytor med 70% etanol. Behandla anti-rullplattan och ett par tång med RNase dekontaminering agent. Ställ in kryostaten på önskad skärtemperatur (-18 till-22 ° c). Förbered en lockded behållare med torris, placera ett ark aluminiumfolie på torris för tillfällig förvaring av de sektionerade provbilder under kryosektionering.
Försiktighet: Torris är extremt kallt. Hantera alltid torris med försiktighet och Använd isolerade handskar när du hanterar den. - Överför det färska frysta preparatet till en hink med torris. Placera ett lager av ULT förening på en kryostat preparathållare och omedelbart placera preparatet ovanpå ULT med milt tryck. När OCT är helt fryst, fäst hållaren med preparatet i kryostatskärarmen.
- Lämna provet i kryostaten i 15 min för att jämbrera till skär temperaturen.
- Avsnitt vävnaden och samla skivor på polyeten polyetennaftalat (penna) membran diabilder med en tjocklek av 12 μm. Justera på varandra följande avsnitt på membranet. När en bild är klar kan du låta avsnitten torka i några minuter och föra över bilden till folien i torr isbehållaren tills alla nödvändiga bilder har samlats in.
- Förvara bilderna vid-80 ° c i en bildruta.
Anmärkning: Snittjockleken väljs för att maximera mängden vävnad som samlas in samtidigt som den möjliggör effektiv skärning av vävnaden, och kan variera beroende på vävnad av intresse. Protokollet kan pausas här. Håll bilder fria från RNase förorening. Undvik temperaturväxlingar. Även om RINs av RNA från diabilder som lagrats i upp till 6 månader fortfarande kan tyda på hög kvalitet på RNA, rekommenderar vi att du använder bilder så snart som möjligt.
3. provberedning för laser Capture Microdissection
- Förbered lösningar för färgning och uttorkning.
- Placera 45 mL 80% etanol i varje 3 50 mL centrifugrör på isen. Märk dem som #1, #2 och #3. Späd etanol med RNase/DNase fritt vatten.
- Placera 45 mL 95% etanol i ett 50 mL centrifugerör på isen.
- Placera 45 mL 100% etanol i ett 50 mL centrifugerör på isen.
- Placera 45 mL xylen i ett 50 mL centrifugerör i rumstemperatur.
Försiktighet: Xylen ska användas i ett draghuv.
- Tina en penna membran glida kort genom att placera den mot en handskar hand, sedan tvätta två gånger för 30 s vardera i 45 mL av 80% etanol (#1 och #2) med agitation i 50 mL Centrifugera rör för att avlägsna ULT.
Anmärkning: Det är viktigt att ta bort ULT före färgning, för att förhindra OCT lossas under färgning från skymmer sektionerna. Forceps kan användas för att underlätta avlägsnande av ULT som inte tvättas bort av agitation. - Lägg glida på ett ark aluminiumfolie. Pipettera 0,8 mL av 0,1% cresyl violett i 50% etanol på bilden och färga i 30 s. Tvätta bilden i 45 mL av 80% etanol (#3) i 30 s, och sedan torka genom passage för 30 s vardera genom 45 mL av 95% etanol, 100% etanol och xylen i 50 mL centrifugrör.
- Ställ diabilder på en delikat uppgift torkar i 5 min att dränera xylen och torra sektioner.
Anmärkning: Glasen måste torkas helt före LCM.
4. mikrodissektion för laserinfångning
Anmärkning: Bär puderfria nitrilhandskar när du utför LCM.
- Slå på LCM-mikroskopet, lasern och datorn. Logga in på datorn och starta programvaran. Vrid nyckeln till "on"-läget för att starta lasern. När den gröna lampan (laser) är på, tryck på den röda knappen för att aktivera lasern, och sedan ljuset (laser) blir röd indikerar laser är klar att använda.
Anmärkning: Lasern behöver ca 10 min för att värma upp. - Ställ in samlingsrören.
- För in locket på en 0,5 mL polymeras kedjereaktion (PCR) röret i insamlaren.
Anmärkning: Välj den matchande insamlaren för de önskade PCR-rören (0,2 eller 0,5 mL). - Pipettera över 50 μL extraktionsbuffert (tillhandahålls av RNA-isoleringssats som listas i material tabellen) i locket på 0,5 ml-uppsamlings röret.
- Sätt in samlings enheten i mikroskopet.
- I fönstret ändra Insamlarenhet klickar du på knappen Flytta till referenspunkt för att flytta insamlaren till referenspunkten (RP). Justera fokus för att tydligt visa RP. Klicka på pilarna för att flytta RP till mitten av vyn.
- För in locket på en 0,5 mL polymeras kedjereaktion (PCR) röret i insamlaren.
- Fyll på preparatglas.
- Sänk bildhållaren genom att klicka på den vänstra utmatnings knappen i verktygsfältet.
- Placera bilden i hållaren med vävnads sektionen vänd nedåt.
Anmärkning: Denna orientering säkerställer att de fångade vävnads sektionerna faller in i locket på Samlingsröret med tyngdkraften. - Sätt tillbaka hållaren i scenen.
- Ställ in laser parametrarna.
- Välj kontroll alternativet för laser menyn eller klicka på laser ikonen.
- Justera dessa parametrar som önskas: makt, kraften i lasern; Bländare, bredden på lasern; hastighet , skärhastigheten i rit-och skär läget.
Anmärkning: Testa lasern i ett område av intresse. Högre effekt eller större bländare gör det lättare att skära men orsakar mer skada på celler. Justera kombinationen av effekt, bländare och hastighet för att få effektiv skärning och minimal skada av vävnaden. Till exempel, Power = 40, bländare = 5, och hastighet = 7 för broskvävnad på en 12 μm sektion.
- Välj och klipp ut intresseområden.
- Börja med 5x mål och hitta de områden av intresse, och sedan växla till målet (5x, 10X, eller 40x) som bäst visar området av intresse.
Anmärkning: Efter cresyl violett färgning, brosk är färgade magenta och mineraliserad vävnader verkar bruna eller svarta, distinguishable från andra vävnader. Bilder kan sparas med Spara bild som från Arkiv -menyn. - Välj röret för uppsamling (A, B, C, D) genom att klicka på märket vid insamlaren.
- Välj flytta och klipp ut eller Rita och klipp. I läget flytta och klipp skärs preparatet manuellt med hjälp av musen eller pekskärmspennan för att rita former på fri hand. I rit-och skär läge kan former ritas på fri hand med musen eller pekskärmspennan för efterföljande skärning. Klicka på Start cut -knappen för att initiera laserskärning.
- När snittet är klar, målvävnaden med penna membran faller i locket på Samlingsröret med tyngdkraften. Upprepa 4,5 om du vill adresspool flera intresseområden om det behövs.
Anmärkning: Upprepade nedskärningar eller ökad effekt eller bländare kan vara nödvändiga om vävnaden inte släpper in locket på samlingsröret på grund av ofullständig skärning. Mineraliserat ben (brunt eller svart) kan inte klippas direkt av laser.
- Börja med 5x mål och hitta de områden av intresse, och sedan växla till målet (5x, 10X, eller 40x) som bäst visar området av intresse.
- Lossa insamlaren och stäng försiktigt PCR-röret. Placera mikrodissekerade vävnader i torris. Fortsätt till nästa steg eller förvara vid-80 ° c.
Anmärkning: Protokollet kan pausas här. Upprepa 4,2 till 4,6 för nästa prov.
5. lys av Mikrodissekerade vävnader och RNA-isolering
- Tina de mikrodissekerade vävnaderna vid rumstemperatur. Centrifugera kort och inkubera proverna i 30 minuter vid 42 ° c.
- Efter inkubering, snurra lysbufferten ner i 0,5 mL PCR-röret. Utför DNase-behandling och RNA-extraktion med ett RNA-isoleringspaket (se material tabellen) enligt tillverkarens anvisningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Koronala avsnitt av färska frysta mus vävnader vid e 16.5 användes för att demonstrera isolering och insamling av Meckels brosk (MC), kondylärt brosk, och mandibular ben av LCM. Mus embryon vid E 16.5 dissekeras och bäddas in i kryogena formar med ULT förening. Proverna i formar var snabbt frysta i en torris och metyl-2-butan bad och förvaras vid-80 ° c.
Att demonstrera cresyl violett färgning av brosk och ben, kryosektionering i det koronala planet utfördes och prover samlades på Mikroskop diabilder. Avsnitten tvättades, färgas och dehydratiserades enligt protokollet ovan (steg 3.2 – 3.4). Bilderna var lufttorkade och monterade med permanent monteringsmedel. Alla brosk som undersökts var färgade Magenta (MC, kondylärt brosk, nässkiljeväggen brosk, kust brosk, brosk primordium av presphenoid ben, brosk primordia av radie och ulna) och alla mineraliserade vävnader var färgade bruna eller svarta (figur 1A-E). Både brosk och ben var lätt skiljas från andra vävnader på flera anatomiska platser.
För LCM, var huvuden av embryon vid E 16.5 sektioneras i det koronala planet på penna membran diabilder med en tjocklek av 12 μm, och 6-8 på varandra följande avsnitt samlades per bild och lagras vid-80 ° c. OCT togs bort och sektioner färgas med cresyl violett och dehydratiserade enligt det protokoll som beskrivs ovan (steg 3.2-3.4). MC, kondylärt brosk, och mandibular ben regioner valdes och isolerades av LCM (figur 2). De utvalda regionerna sjönk in i lyseringsbufferten i locket på Samlingsröret. För att erhålla tillräckligt RNA för sekvensering, poolade vi 10 regioner i MC, 10 regioner i kondylärt brosk eller 4 regioner av mandibular ben i varje uppsamlings rör som ett prov, respektive.
RNA extraherades med hjälp av ett RNA-isoleringspaket enligt tillverkarens anvisningar. Totalt RNA analyserades med hjälp av en bioanalyzer (figur 3a – B). För att testa effekten av cresyl violett färgning på kvaliteten på RNA, jämförde vi RNA från mandibular benprover färgade med cresyl violett och prover utan färgning (mineraliserad vävnad är synlig utan färgning, men cresyl violett färgning förbättrar synligheten för att skilja ben från omgivande vävnader). Ingen signifikant skillnad i RNA-integritet observerades mellan färgade prover (n = 4) och prover utan färgning (n = 4), vilket indikerar den snabba cresyl violett färgning i detta protokoll har obetydlig effekt på RNA-kvalitet (P = 0,858, tvåsidiga Welch t-test, figur 3C). Vi använde vårt protokoll för LCM av olika vävnader vid olika utvecklingsstadier och RINs mättes, vilket indikerar hög RNA-kvalitet (figur 3D). Genomsnittlig avkastning på RNA från MC, kondylärt brosk och mandibular ben var 7,50 ± 1,45 ng, 12,55 ± 2,75 ng, och 33,02 ± 7,63 ng (figur 3E) och avkastningen/området var 19,73 ± 3,82 ng/mm2, 26,70 ± 5,84 ng/mm2, och 17,23 ± 3,98 ng/mm2, respektive (figur 3F), utan signifikant skillnad mellan vävnader (MC kontra kondylär brosk, p = 0,383; kondylärt brosk kontra mandibular ben, p = 0,260; MC kontra mandibular ben, P = 0,674).
Biblioteken var förberedda och sekvenserade som tidigare beskrivits6,7. En representativ cDNA-storlek var ungefär 500 BP (figur 4a). RNA-SEQ-data analyserades med MultiQC8. Vi analyserade RNA-SEQ data från 18 LCM-prover (MC1-6, Meckels brosk; C1-6, kondylärt brosk; M1-6, mandibular ben). De genomsnittliga kvalitetsvärden över varje bas position i läsningar genererades av FastQC, vilket indikerar mycket god kvalitet samtal (figur 4B). Läs justeringen analyserades med Picard (figur 4C). Läsningar visade hög justerade procentsatser och den genomsnittliga procentandelen av justerade läsningar var 75%. Gen täckningen analyserades med Picard (figur 4D), vilket indikerade en bra representation längs avskriften från 5 ' till 3 '-änden.
Analys av differential genuttryck utfördes6,7. Det fanns 4 006 gener signifikant Differentiellt uttryckt (P < 0,05) mellan mandibular ben och MC (figur 5A). Gener som är specifika för osteoblaster eller osteocyter (Col1a19, Col1a210, Dkk111, Dmp112, DSTN13, Runx214, Sp715och sparc16) har högre uttrycks i mandibular ben jämfört med MC, medan kondrocytspecifika gener (ACAN17, Col2a118, Col9a119, Col9a220, Col9a321, comp22, Lect123och Sox524) uttrycktes högre i MC jämfört med mandibular Bone (figur 5B och tabell 1). Dessutom identifierades osteoklast markörer såsom Acp525, Csf1r26, ctsk27, Itgb328och Oscar29 också som mer högt uttryckta i mandibular ben jämfört med MC (figur 5B och tabell 1), vilket indikerar en lyckad isolering av riktade vävnader.
Figur 1: representativ cresyl violett färgning av brosk och ben i koronala delar av mus embryot på e 16.5. A) Meckels brosk och hemimandibel. (B) Meckels brosk, kondylär brosk och hemimandible. Cnässkiljeväggen och maxillae. Dbrosk primordium av presphenoid ben och palatinben. (E) brosk primordium av radie, brosk primordium av ulna, och kust brosk. C = kondylärt brosk; CC = kust brosk; CP = brosk primordium av presphenoid ben; M = hemimandibel; MC = Meckels brosk; MX = maxilla; NS = nässkiljeväggen; PL = Palatinen ben; R = brosk primordium av radie; U = brosk primordium av ulna. Scale bar = 200 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: representativa regioner som isolerats av LCM och som samlats in för RNA-SEQ. (a – C) Representativ målat MC (a), kondylärt brosk (B), och hemimandible med MC redan isolerade (C) i kryosektion före LCM. (D – F) Regionerna i A, B och C efter riktade vävnader isolerades av LCM. Scale bar = 200 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: RNA-kvalitet och antal LCM-prover. (a – B) Representativa elektrofoniogram (a) och den tillhörande gel bilden (B) från en bioanalysator för ett mandibulär ben prov. (C) RINs av totalt RNA från mandibular benprover färgade med cresyl violett (n = 4) eller utan färgning (n = 4). DRINS totala RNA från olika vävnader som isolerats av LCM. Meckels brosk vid E 16.5 (n = 6); Condylar brosk vid E 16.5 (n = 6); Mandibular ben vid E 16.5 (n = 6); Nässkiljeväggen brosk vid E 14.5 (n = 6); Hjärnan vid E 14.5 (n = 6); Hjärnan vid E 16.5 (n = 7); Hjärnan vid E 18,5 (n = 4). E) avkastning på totalt RNA från tre vävnader. Varje MC eller kondylärt brosk prov var en pool av 10 microdissekerade områden av brosk och varje prov av mandibular ben var en pool av 4 microdissekerade regioner i hemimandible. F) avkastningen per areaenhet (ng/mm2) i varje vävnad. Data är medelvärdet ± s.e.m. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: kvaliteten på biblioteken och RNA-SEQ-data som genereras från LCM-prover. A) representativacDNA-storlekar av ett bibliotek från ett mandibulär ben prov som bestäms av en bioanalyzer. (B – D) Kvalitetskontroll analys av RNA-SEQ från 18 LCM prover (MC1-6, Meckels brosk; C1-6, kondylärt brosk; M1-6, mandibular Bone) av MultiQC. (B) medelvärdet av kvalitetsvärden för varje bas position i läsningar genererades av fastqc. Bakgrunden i grafen delar y-axeln i mycket bra kvalitet samtal (grön), samtal av rimlig kvalitet (orange), och samtal av dålig kvalitet (röd). (C) anpassningen av läsningar analyserades av Picard. Sammanfattningen visas som procentsatser för justerade läsningar. Dnormaliserad gen täckning som analyseras med Picard. Handlingen visar den relativa genomsnittliga täckningen längs avskriften från 5 ' (vänster) till 3 ' End (höger). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: differential uttrycks analys av RNA-SEQ data från mandibular ben och MC isolerade av LCM. (A) hierarkisk klustring av 4 006 gener signifikant Differentiellt uttryckt (P < 0,05) mellan mandibular ben och MC. Tre biologiska replikat användes för varje vävnad. M1-3, mandibular ben; MC1-3, MC. (B) vulkan tomt som visar veck förändringar och P-värden av differentially uttryckta gener mellan mandibular ben och MC. exempel på mycket Differentiellt uttryckta cellspecifika gener visas: osteoblast-och osteocytermarkörer i blått, osteoklast markörer i grönt och kondrocytmarkörer i rött. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Gen | Cell typ | log2FoldChange | Genomsnittligt uttryck | Justerat P-värde |
| Col1a1 | Osteoblast/Osteocyt | 2,64 | 12,94 | 2.22 e-05 |
| Col1a2 | Osteoblast/Osteocyt | 3,41 | 12,87 | 8.27 e-07 |
| Dkk1 | Osteoblast/Osteocyt | 7,59 | 2,01 | 5.21 e-03 |
| Dmp1 | Osteoblast/Osteocyt | 9,73 | 3,42 | 3.19 e-04 |
| DSTN | Osteoblast/Osteocyt | 2,51 | 6,87 | 5.73 e-07 |
| Runx2 | Osteoblast/Osteocyt | 1,24 | 8,62 | 4.08 e-02 |
| Sp7 | Osteoblast/Osteocyt | 2,24 | 6,95 | 5.81 e-03 |
| Sparc | Osteoblast/Osteocyt | 3,40 | 12,26 | 5,56 e-09 |
| Acp5 | Osteoclast | 3,38 | 5,74 | 6.46 e-06 |
| Csf1r | Osteoclast | 2,01 | 5,80 | 1.17 e-04 |
| Ctsk | Osteoclast | 3,19 | 7,56 | 5.73 e-07 |
| Itgb3 | Osteoclast | 2,88 | 5,37 | 2.43 e-04 |
| Oscar | Osteoclast | 3,41 | 2,67 | 1.63 e-04 |
| ACAN | Chondrocyte | -5,23 | 5,01 | 2,76 e-04 |
| Col2a1 | Chondrocyte | -3,61 | 9,47 | 3.29 e-03 |
| Col9a1 | Chondrocyte | -7,01 | 3,58 | 5.51 e-03 |
| Col9a2 | Chondrocyte | -5,40 | 3,76 | 2,60 e-03 |
| Col9a3 | Chondrocyte | -6,63 | 3,80 | 2.90 e-02 |
| Comp | Chondrocyte | -5,86 | 1,54 | 7.51 e-03 |
| Lect1 | Chondrocyte | -7,37 | 1,34 | 2.35 e-02 |
| Sox5 | Chondrocyte | -2,88 | 4,43 | 6.06 e-04 |
Tabell 1: differential uttryck av kända gener i olika celltyper av ben och brosk (mandibular ben kontra MC).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
LCM möjliggör isolering av berikade eller homogena cellpopulationer från heterogena vävnader. Dess fördelar är snabb och exakt avskiljning av celler i deras in vivo -sammanhang, medan potentiella nackdelar är att det är tidskrävande, dyrt och begränsat av behovet av att användaren känner igen distinkta subpopulationer inom ett angivet prov30. Detta protokoll ger information om LCM av mus embryonala brosk och ben, belyser användningen av cresyl violett färgning i ett snabbt förfarande för att visualisera brosk och ben för exakt vävnad insamling samtidigt som hög RNA-integritet för efterföljande analys av RNA-SEQ. En begränsning av detta protokoll är att LCM-systemet som används här inte kan direkt skära över mineraliserade vävnader (t. ex. Den mandibular vävnaden i svart i figur 2C); som ett resultat, hela ben området måste dissekeras. Särskilt de mikrodissekerade förbenade regionerna som isolerats av LCM är inte homogena och omfattar åtminstone subpopulationerna av osteoblaster, osteocyter och osteoklaster (tabell 1). Emellertid, berikningen av LCM är värdefull som vår tidigare studie har visat att transkriptionella förändringar i specifika subpopulationer såsom osteoklaster i microdissekerade benvävnad kan fortfarande detekteras av RNA-SEQ6.
För gen uttrycks analys har vi optimerat prov preparationen och LCM-proceduren för hög RNA-kvalitet och avkastning. Vårt protokoll börjar med färska frysta vävnader. Färska frysta vävnads sektioner möjliggör utmärkt mängd och kvalitet av extraherat RNA3, eftersom mRNA är känsligt för standardmetoder för fixering31. RNA bryts snabbt ned av RNase kontamination, och underhåll av en RNase-fri miljö under hela provet beredning, LCM, och RNA isolering är avgörande för framgångsrik tillämpning. Exponering för vatten under sektions bearbetningen skadar RNA-kvalitet31,32. Vårt protokoll begränsar sådan exponering, med den högsta nivån av vatten exponering är 50% under cresyl violett färgning. Vi har testat att en snabb färgning (30 s) med 0,1% cresyl violett i 50% etanol ger en urskiljbar färg till brosk och inte sänker RNA-integriteten för nedströms analys såsom låg input RNA-SEQ (figur 3C och figur 4). Yielden/arean (ng/mm2) är ungefär 20 ng/mm2 (figur 3F), liknande eller högre än tidigare optimerade metoder33. Enligt cell tätheter i MC och mandibular ben6, vi uppskattar att med detta protokoll den genomsnittliga avkastningen från en cell är cirka 5 PG RNA per cell, och 1 – 5 ng av totalt RNA kan extraheras från 200 – 1000 celler, som kan användas för låg input RNA-SEQ6,7,33. Denna avkastning effektivitet är mycket högre än etablerade LCM metoder34, och även överlägsen eller liknande de senaste optimerade protokollen33,35.
Förmågan att särskilja olika celltyper i histologiska sektioner är avgörande för exakt insamling av specifika vävnader av intresse. Cresyl Violet är en hydrofila, basisk fläck som binder till negativt laddade nukleinsyror36. Denna egenskap gör det användbart för motfärgning med cell-typ selektivitet37, och det är en standard histologisk fläck för nervceller38. Cresyl violett har använts i LCM för en mängd olika vävnader, ger god vävnadmorfologi och hög RNA-kvalitet33,36,39,40. Jämfört med andra infärgnings metoder ger cresyl violett färgning cytoplasmiska och nukleära detaljer, och en låg RNA nedbrytningshastighet32. Vi visar här att cresyl violett färgning är en enkel och snabb metod för att visualisera brosk och ben och att vävnad färgade med denna metod bevarar hög RNA-integritet. Xylenbehandling används ofta för uttorkning av vävnaderna före LCM35,36,41,42. Vi använder xylen för att förbättra visualiseringen av vävnadmorfologi35 vilket är viktigt för att skilja riktade vävnader, särskilt på penna membran diabilder som inte är så optiskt klar som vanligt glas diabilder. Vi hittade ingen signifikant förekomst av sektions förlust från penna diabilder under färgning och tvättsteg, även med agitation för att avlägsna OCT.
Mikrodroppar eller mikrofluidik-baserade enkelcellig RNA-SEQ (scRNA-SEQ) är en metod med högt dataflöde för att analysera transkriptomer av vävnader med heterogena celltyper och har börjat användas i skelett bio Logi43. I motsats till LCM, scRNA-SEQ innebär enzymatisk och/eller mekanisk uppdelning av vävnad i enskilda celler. De flesta protokoll för framställning av en cell kräver att vävnader inkuberas vid rumstemperatur eller 37 ° c under längre perioder, vilket förändrar transkripomet44,45. Dessutom kan isolering av enstaka celler i brosk och ben vara fysiskt begränsad av skelett del komplexitet trabecularization och mineralisering. Det är fortfarande en teknisk utmaning att isolera ett tillräckligt antal livskraftiga celler från skelett vävnader som är korrekt representativa för den cellulära mångfalden av vävnader in vivo, och ofullständig dissociation av cellerna kan orsaka bias i upptäckten av celltyper43. ScRNA-SEQ tillåter identifiering av olika celltyper, sekvenserings djupet är lågt och typiska sekvenserings metoder fångar 3 ' avskrifter och tillåter inte alternativa splitsnings analyser. Bulk RNA-SEQ av LCM-härledda vävnad homogenizes cell skillnader, men tillåter omfattande avskrift upptäckt och alternativa skarvning analys. LCM är därför särskilt användbart för skelett vävnader som inte är lätt att separera från omgivande vävnader och internt komplexa, och färskt fryst beredning av vävnaden kan bevara både transkriptionella profiler och RNA integritet för transkriptionell analys. En annan svaghet i scRNA-SEQ är att efter en enda cell beredning förloras rumslig information om cellerna. En kombination av LCM och scRNA-SEQ har utvecklats för att möjliggöra studiet av transkriptome av ett litet urval från definierade geografiska platser (geo-SEQ)46, vilket är en annan metod att använda LCM för att studera regionaliserade genuttryck.
Sammanfattnings, detta protokoll ger information om optimerad LCM av brosk och ben, belysa användningen av cresyl violett färgning i ett snabbt förfarande för att visualisera brosk och ben för exakt vävnad insamling samtidigt som hög RNA-integritet för efterföljande analys av RNA-SEQ. Detta protokoll har använts framgångsrikt för LCM av brosk och ben vid olika utvecklingsstadier för gen uttrycks analys6,7, och kan också användas för andra vävnader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institute of Dental and Craniofacial Research (R01DE022988) och Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health och Human Development (P01HD078233). Författarna tackar Biorepository och patologi kärna för tillgång till Leica LMD 6500 plattform vid Icahn School of Medicine vid berget Sinai.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Methylbutane | ThermoFisher Scientific | O3551-4 | |
| Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | |
| Centrifuge tube | ThermoFisher Scientific | 339653 | Conical sterile polypropylene centrifuge tubes, 50 mL |
| Cresyl violet acetate | Sigma-Aldrich | C5042 | |
| Cryostat | Leica Biosystems | CM3050 S | |
| Delicate task wiper | ThermoFisher Scientific | 06-666 | |
| Disposable embedding mold | ThermoFisher Scientific | 1220 | |
| Distilled water | Invitrogen | 10977-015 | DNase/RNase-Free |
| Ethanol, absolute (200 proof) | ThermoFisher Scientific | BP2818 | Molecular biology grade |
| Glass PEN membrane slide | Leica Microsystems | 11505158 | |
| LCM system | Leica Microsystems | Leica LMD6500 | |
| Microscope cover glass | ThermoFisher Scientific | 12-545FP | |
| Microscope slides | ThermoFisher Scientific | 12-550-15 | |
| OCT compound | Electron Microscopy Sciences | 102094-106 | |
| PCR tube with flat cap, 0.5 mL | Axygen | PCR-05-C | LCM collection tubes |
| Permanent mounting medium | Vector Laboratories | H-5000 | |
| RNA isolation kit | ThermoFisher Scientific | KIT0204 | |
| RNase decontamination agent | Sigma-Aldrich | R2020 | RNase decontamination agent for cleaning surfaces |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 |
References
- Kardon, G. Development of the musculoskeletal system: Meeting the neighbors. Development. 138 (14), 2855-2859 (2011).
- Nichterwitz, S., Chen, G., et al. Laser capture microscopy coupled with Smart-seq2 for precise spatial transcriptomic profiling. Nature Communications. 7, 12139 (2016).
- Liu, A. Laser capture microdissection in the tissue biorepository. Journal of Biomolecular Techniques. 21 (3), 120-125 (2010).
- Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
- Schroeder, A., Mueller, O., et al. The RIN: An RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7 (3), (2006).
- Motch Perrine, S. M., Wu, M., et al. Mandibular dysmorphology due to abnormal embryonic osteogenesis in FGFR2-related craniosynostosis mice. Disease Models & Mechanisms. 12 (5), (2019).
- Holmes, G., O'Rourke, C., et al. Midface and upper airway dysgenesis in FGFR2-craniosynostosis involves multiple tissue-specific and cell cycle effects. Development. 145 (19), (2018).
- Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., Käller, M. MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).
- Tromp, G., Kuivaniemi, H., et al. Structure of a full-length cDNA clone for the preproα1(I) chain of human type I procollagen. Biochemical Journal. 253 (3), 919-922 (1988).
- De Wet, W., Bernard, M., et al. Organization of the human pro-alpha 2(I) collagen gene. Journal of Biological Chemistry. 262 (33), 16032-16036 (1987).
- Bonewald, L. F. The amazing osteocyte. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).
- Toyosawa, S., Shintani, S., et al. Dentin matrix protein 1 is predominantly expressed in chicken and rat osteocytes but not in osteoblasts. Journal of Bone and Mineral Research. 16 (11), 2017-2026 (2001).
- Guo, D., et al. Identification of osteocyte-selective proteins. Proteomics. 10 (20), 3688-3698 (2010).
- Ducy, P., Zhang, R., Geoffroy, V., Ridall, A. L., Karsenty, G. Osf2/Cbfa1: A transcriptional activator of osteoblast differentiation. Cell. 89 (5), 747-754 (1997).
- Nakashima, K., Zhou, X., et al. The novel zinc finger-containing transcription factor osterix is required for osteoblast differentiation and bone formation. Cell. 108 (1), 17-29 (2002).
- Termine, J. D., et al. Osteonectin, a bone-specific protein linking mineral to collagen. Cell. 26 (1), 99-105 (1981).
- Baldwin, C. T., Reginato, A. M., Prockop, D. J. A new epidermal growth factor-like domain in the human core protein for the large cartilage-specific proteoglycan. Evidence for alternative splicing of the domain. Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 15747-15750 (1989).
- Strom, C. M., Upholt, W. B. Isolation and characterization of genomic clones corresponding to the human type II procollagengene. Nucleic Acids Research. 12 (2), 1025-1038 (1984).
- Ninomiya, Y., Olsen, B. R. Synthesis and characterization of cDNA encoding a cartilage-specific short collagen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 81 (10), 3014-3018 (1984).
- Muragaki, Y., Mariman, E. C. M., et al. A mutation in the gene encoding the alpha 2 chain of the fibril-associated collagen IX, COL9A2, causes multiple epiphyseal dysplasia (EDM2). Nature Genetics. 12 (1), 103-105 (1996).
- Brewton, R. G., Wood, B. M., et al. Molecular cloning of the alpha 3 chain of human type IX collagen: linkage of the gene COL9A3 to chromosome 20q13.3. Genomics. 30 (2), 329-336 (1995).
- Newton, G., Weremowicz, S., et al. Characterization of human and mouse cartilage oligomeric matrix protein. Genomics. 24 (3), 435-439 (1994).
- Hiraki, Y., Mitsui, K., et al. Molecular cloning of human chondromodulin-I, a cartilage-derived growth modulating factor, and its expression in Chinese hamster ovary cells. European Journal of Biochemistry. 260 (3), 869-878 (1999).
- Smits, P., Li, P., et al. The transcription factors L-Sox5 and Sox6 are essential for cartilage formation. Developmental Cell. 1 (2), 277-290 (2001).
- Hayman, A. R., Jones, S. J., et al. Mice lacking tartrate-resistant acid phosphatase (Acp 5) have disrupted endochondral ossification and mild osteopetrosis. Development. 122 (10), 3151-3162 (1996).
- Dai, X. -M., Ryan, G. R., et al. Targeted disruption of the mouse colony-stimulating factor 1 receptor gene results in osteopetrosis, mononuclear phagocyte deficiency, increased primitive progenitor cell frequencies, and reproductive defects. Blood. 99 (1), 111-120 (2002).
- Gowen, M., Lazner, F., et al. Cathepsin K knockout mice develop osteopetrosis due to a deficit in matrix degradation but not demineralization. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (10), 1654-1663 (1999).
- Faccio, R., Takeshita, S., Zallone, A., Ross, F. P., Teitelbaum, S. L. c-Fms and the αvβ3 integrin collaborate during osteoclast differentiation. Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 749-758 (2003).
- Kim, N., Takami, M., Rho, J., Josien, R., Choi, Y. A novel member of the leukocyte receptor complex regulates osteoclast differentiation. The Journal of Experimental Medicine. 195 (2), 201-209 (2002).
- Mahalingam, M. Laser Capture Microdissection: Insights into Methods and Applications. Methods in Molecular Biology. 11723, 1-17 (2018).
- Goldsworthy, S. M., Stockton, P. S., Trempus, C. S., Foley, J. F., Maronpot, R. R. Effects of fixation on RNA extraction and amplification from laser capture microdissected tissue. Molecular Carcinogenesis. 25 (2), 86-91 (1999).
- Clément-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
- Farris, S., Wang, Y., Ward, J. M., Dudek, S. M. Optimized method for robust transcriptome profiling of minute tissues using laser capture microdissection and low-input RNA-seq. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 185 (2017).
- Espina, V., Heiby, M., Pierobon, M., Liotta, L. A. Laser capture microdissection technology. Expert Review of Molecular Diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).
- Martuscello, R. T., Louis, E. D., Faust, P. L. A stainless protocol for high quality RNA isolation from laser capture microdissected Purkinje cells in the human post-mortem cerebellum. Journal of Visualized Experiments. (143), (2019).
- Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection. BMC Cell Biology. 11 (95), (2010).
- Takahashi, N., Tarumi, W., Hamada, N., Ishizuka, B., Itoh, M. T. Cresyl violet stains mast cells selectively: Its application to counterstaining in immunohistochemistry. Zoological Science. 34 (2), 147-150 (2017).
- Sheldon, A. R., Almli, L., Ferriero, D. M. Copper/zinc superoxide dismutase transgenic brain in neonatal hypoxia-ischemia. Methods in Enzymology. 353, 389-397 (2002).
- Kolijn, K., Van Leenders, G. J. L. H. Comparison of RNA extraction kits and histological stains for laser capture microdissected prostate tissue. BMC Research Notes. 9, 17 (2016).
- Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
- Filliers, M., et al. Laser capture microdissection for gene expression analysis of inner cell mass and trophectoderm from blastocysts. Analytical Biochemistry. 408 (1), 169-171 (2011).
- Vandewoestyne, M., et al. Laser capture microdissection: Should an ultraviolet or infrared laser be used? Analytical Biochemistry. 439 (2), 88-98 (2013).
- Ayturk, U. RNA-seq in skeletal biology. Current Osteoporosis Reports. 17 (4), 178-185 (2019).
- Van Den Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
- Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: A molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
- Chen, J., et al. Spatial transcriptomic analysis of cryosectioned tissue samples with Geo-seq. Nature Protocols. 12 (3), 566-580 (2017).
