Summary
כאן, אנו מראים כיצד לבצע מיקרוסקופ לאחר הנימי של השריר הראשי של העכבר. בדרך כלל מיושם מודלים שונים של דלקת אלח דם, במיוחד אלה המושרה על ידי נוגדנים ו ציטוקינים, אנו להדגיש את הרלוונטיות שלה במחקר של מוסקולופאאס מעורבים חדירה מוגזמת שרירי לוקיציט.
Abstract
מיקרוסקופ אינטרטל (IVM) משמש רבות לניטור תהליכים פיזיולוגיים ופתופיזילוגיים בתוך הדירוג הvivo של הגיוס הלוקואני. הפרוטוקול הנוכחי מייצג שיטה מעשית ומנויית כדי להמחיש את האינטראקציה האנדוקובית לוקיציט המובילה לגיוס לוקיציט ברקמת שריר השלד בתוך האורגניזם השלם של העכבר. המודל ישים לכל תחומי המחקר המתמקדים בהפעלת גרנולוציט ותפקידם במחלות.
אנו מספקים צעד אחר צעד פרוטוקול להנחות דרך השיטה ולהדגיש מלכודות פוטנציאליות וקשיים טכניים. הפרוטוקול מכסה את ההיבטים הבאים: הגדרות ניסיוני וחומר נדרש, הרדמה של העכבר, חיתוך של שריר cremaster, כמו גם הקנה הנשימה והעורק הראשי, הקלטות IVM וניתוח לא מקוון. תבניות נתונים כמו לוקיציטים מדומה, שטף מתגלגל (RF) ושבר שטף מתגלגל (RFF) מוסברים בפירוט ויישומים מתאימים נדונים. תוצאות הנציג מעכברים mdx לקוי הדיסטרופין מסופקים בסעיף התוצאות.
IVM הוא כלי רב עוצמה כדי להעריך גיוס לוקיציט ב vivo הגדרה; עם זאת, התיחום למשל לפונקציה אנדותל ולוקיציט עשוי לדרוש שילוב עם הגדרות vivo ex כמו ניסויים בתאי הזרימה. יתרה מזאת, הרקע הגנטי של בעלי העניין עשוי להשפיע במידה ניכרת על גיוס בסיסי, המחייב כוונון משובח של הפרוטוקול המסופק. למרות המגבלות שלה, IVM עשוי לשמש פלטפורמה לתרגם בקלות ממצאים בעלי מבחנה מחוץ לאורגניזם חי בעלי חוליות.
Introduction
מיקרוסקופ אינטרטל (IVM) הוא כלי מיושם נפוץ בתחום הביולוגיה הלוקוציט. גיוס לוקיציט מלווה במפל של אירועים מוגדרים היטב, שיזמו לכידת הלוקוציט, גלגול והדבקה לקיר האנדותל, ולבסוף העברת הגירה והעברה של לוקיציטים לאתר בפועל של דלקת1. כל צעד מתווך ונשלט על ידי נוגדנים שונים (למשל, IL-8/CXCL8), קולטנים (g., lfa-1, Mac-1) ומולקולות הדבקה של תא אנדותל המקביל (g., icam-1, vcam-1 ו-e-selectin)2,3. האינטראקציה של אתרים רגולאטורים שונים, מקדמי שליטה ומגשרים של גיוס לוקיציט מדורגים כמו קולטן של מוצרים מתקדמים לסוף גליקטיון (זעם), מולקולה הדבקה משולבת 1 (icam -1), c-X-c מוטיב ליגנד (cxcl) 1/2 והקולטן שלהם CXCR2 נחשפו באמצעות ivm4,5,6,7,8,9
השיטה של IVM תוארה עבור איברים ורקמות שונים רבים כגון המעי10, עור11, בלוטות הלימפה12, שק החלמון העובריים13 ואחרים. עם זאת, שיטת המחקר הנרחב ביותר של IVM הוא מודל cremaster, המתואר לראשונה חולדות14. בעוד שימוש עדיין בחולדות15, השיטה מיושמת כיום בעיקר בעכברים בשל שפע גבוה של קווים טרנסגניים שונים. הקבוצה שלנו הדגישה לאחרונה את התפקיד הפוטנציאלי של מאסטר cremaster בתחום של מוסקולוטים דלקתיים כמו Duchenne ניוון שרירים (DMD) ללמוד הדיסטרופין לקויה עכברים16. בשל שזור דק ונגיש בקלות הרכב סיבים, שריר cremaster מייצג את השריר האידיאלי המועמד ללמוד כמו הר שלם באמצעות מיקרוסקופ אור או פלורסנט. גיוס לוקיציט ומיון מתמשך מתקיימים בעיקר בעזרת שכבות פוסט-קפיריות, שיכולות להיות מזוהות על שכבת שרירים רציפה בשריר הקרמאסטר.
היתרון של הדמיה vivo לעומת אחרים מחוץ לבית הספר הוא ההקשר הביולוגי שלה באורגניזם חי. במקביל, מציינת תרומות ספציפיות לתאים לגיוס לוקמיה משתנה עשויה לדרוש תוספת של מודלים להפריה חוץ-גופית כגון תאי זרימה או אנדותל אסמאל. השילוב בין שיטות מרובות יניב את הנתונים המששכנעים ביותר. מדענים צריכים להיות מודעים למגבלות של מודל cremaster כמו כל מניפולציה כירורגית יוביל להגדלת הסחר בסמים וגיוס. מכאן, הגיוס הבסיסי קשה להעריך עם שיטה זו. למרות היישום הרחב שלה, IVM של cremaster יכול להיות מאתגר וכיוונון הרומן עשוי לקחת זמן ומשאבים כדי להקים. כעת אנו מספקים פרוטוקול קל אשר יסייע להימנע כמה טעויות נפוצות ב-IVM. כמו כן, יידונו מגבלות ושיטות מסוימות יהיו מודגשות במידת הצורך.
האגודה מייצגת גישה אידיאלית ליישום בתחום של מחקרים דלקתיים וזיהומיות. באופן ספציפי יותר, מודל cremaster עשוי להיות עניין גבוה למדענים לימוד ביולוגיה שריר השלד בהקשר של מחלות דלקתיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
בעלי חיים היו תחת מבוקרת וספציפי התנאים ללא הפתוגן בבית IBF (ביופקולטציזיסיאיסמליסספיאדיבאיזשיונגאבריסגריסיוריסיימאנטאינטונג), חאידלברג. כל ההליכים המתוארים כאן אושרו על-ידי ה-IRB המקומי והרגראשיפראססרוסיה קרלסרוהה, באדן-Wuerttemberg, גרמניה.
1. מינהל הרדמה
- מורדם העכבר על ידי הזרקת הצפק (כיתה) הזרקה של 125 מ"ג/ק"ג ו 12.5 מ"ג/ק"ג xylazine.
- מקום ולתקן את העכבר בתנוחה שכיבה על גבי משטח חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של העכבר (36.5-38 ° c). השתמש בתפר סטרילי שאינו נספג (6/0) לרוח לולאה פשוטה סביב השיניים המצח והקלטת את החיבור של התפר למשטח החימום. קיבעון זה נועד לשמור על הפה פתוח כדי למנוע הפרעה בנשימה.
- בדוק את העכבר לעומק המתאים של ההרדמה על ידי קמצוץ הבוהן interdigital (נסיגה לא צריך להיראות).
- לאחר הרדמה מספקת הוא הגיע להמשיך להכנה כירורגית. לאשר שוב ושוב הרדמה לאורך הניסוי המתמשך כל 30 דקות. לנהל מחדש תרופות כפי שמתואר לעיל אם יש צורך.
- תמיסת מלח פיסיולוגית (PSS, הרכב: 132 מ מול/L הפקודה, 4.7 ממול/L KCl, 1.2 ממול/L MgS04, 2.0 Mmol/l ק1, 18 מ מול/l נחקו3) עם 5% CO2/95% N2 עבור 15 דקות. בועה רציפה PSS עם 5% CO2/95% N2 במהלך הניסוי ולשמור ב 37 ° c.
2. הכנת כירורגי לעורק הנשימה והעורק הראשי (אופציונלי)
- לנתח את העור מאזור הצוואר על ידי משיכת בעדינות את העור עם מלקחיים באמצע הדרך. השתמש במספריים כדי להחיל חתך מעגלי של 1-2 ס מ בקוטר כדי לתת מספיק מקום להכנה כירורגית.
- בזהירות לנתח את השריר שמסביב, רקמות שומן וחיבור באמצעות מספריים.
- לעשות חתך רוחבי (~ 1.3 מ"מ) לתוך קנה הנשימה באמצעות מספריים כירורגי קטן ולהציג צינור פוליאתילן (I. D x מנת משכל 0.034" x 0.050 ") בתוך הקצה caudal של קנה הנשימה כדי לאבטח את נתיבי הנשימה העליונים.
- תקן את הצינורית הממוקמת בקנה הנשימה על ידי תפר מעגלי בודד (6/0 USP).
- ולנתח את הרקמה המקיפה. מהקיר העורק הראשי לחילופין, הוריד הצוואר או גם הזנב יכול לשמש לגישה לעירוי. נסו להימנע מפציעה בעצב התועה, כפי שהוא נמצא מקרוב.
- העבירו שתי פרוסות תפר (6/0) מתחת לעורק הראשי. מניחים את תפר הגולגולת הראשון הקרוב ביותר, בקרבת הבייון של עורקים העורק ולקשור אותו לצמיתות. תפר השני יהיה ממוקם על 5-8 מ"מ מ מ הראשון ומאוחר יותר לשמש כדי לאבטח את הצינור בעורק הראש. . אל תקשור את זה עדיין
- להכין צינור פוליאתילן (I. D x מנת יתר 0.011 "x 0.024") עם אורך של 30 ס מ על ידי כיפוף חלק בסוף מחט מזרק 1 mL מלא תמיסת מלח (0.9% הנאל). שטיפה קפדנית חשוב כדי למנוע סתימת האוויר במהלך ההכנה.
- השתמש בקליפ של 7 מ"מ כדי להדק את עורק העורק הראשי של התפר השני.
- בצעו חתך רוחבי קטן (~ 0.5 מ"מ) בעורק הראש והציגו את צינור הפוליאתילן הסטרילי. אבטח את הצינור בעורק בעזרת התפר השני שהוכן לפני.
- הסר את הקליפ והחל בעדינות מעט מתח על המזרק המחובר לצינור הפוליאתילן. קטטר זה העורק יכול כעת לשמש לניהול תרופות או לקחת דגימות דם אם נדרש, אפילו ניטור של לחץ דם או שיעור הדופק אפשרי עם התקנים בהתאמה.
3. הכנת כירורגי של השריר cremaster
- העבר את העכבר על משטח החימום (יחד עם משטח החימום) למסגרת הפלסטיק המותאמת אישית המחזיקה את הבמה למיקרוסקופיה מאוחרת יותר. כוון את העכבר עם כיס האשכים שלו מול הבמה המיקרוסקופ.
- מהעריך מראש עומק של הרדמה לפני שתמשיך; מחדש רבע עד חצי מנה של הרדמה במידת הצורך.
- להתאים את כיס האשכים, להחזיק אותו בחלקו המרוחק ביותר באמצעות מלקחיים, למשוך אותו בעדינות ולחתוך קטע עגול של עור האשכים עם כ 5 מ"מ קוטר. הקפד לא לפגוע במבנים הבסיסיים כגון שריר cremaster. הקפידו לשמור את הרקמה הפתוחה היטב מהתייבשות עם תמיסת מלח.
- לנתח רקמת חיבור רופף באמצעות שתי מלקחיים ולוקליזציה שתי האשכים.
- החזק את האחד בדרך בעדינות ולהתחיל למשוך אותו החוצה, הסרת רקמת החיבור שמסביב צעד אחר צעד.
- , ברגע שהוא מתחת למים. ממסמר את הקצה המרוחק שלו לטבעת הגומי המקיפה את הבמה מימה את הרקמה עם תמיסת מלח במהלך כל התהליך.
- שלב קריטי: הסר בזהירות את רקמת החיבור מבלי לפגוע שריר cremaster הבסיסי. רקמת חיבור עודפת עלולה לשבש את הראייה במיקרוסקופיה מאוחרת יותר ועלולה לגרום לדימויים מטושטשים.
- להצמיד את החלק המרוחק של הראש למטה ולפתוח את השריר cremaster ידי חתך רוחבי קטן (על 1 מ"מ), ואחריו חתך האורך מן המרוחק מאוד לסוף הקרוב ביותר. כתוצאה מכך השריר הקרמסטר צריך להיפתח בצורה ספרוונית. אין לנתק את כלי הקיבול המקסקובי באופן מאקרואני, מאחר שפעולה זו עלולה להשפיע על הומודינמיקה.
- הפיצו בזהירות את השריר מעל לשלב הזכוכית והצמד אותו לטבעת הגומי. הקפידו לא לגעת או לפגוע באזור המרכזי, משום שמיקרוסקופיה תתבצע כאן.
זהירות: מתיחה עודפת עלולה לשבש את זרימת הדם. - הצמד את הראש הנותר הצידה כדי להעניק גישה לאזור העניין. ודא כי מויסטן עם PSS שוב ושוב כדי למנוע ייבוש. השריר שנטען מוכן כעת למיקרוסקופ.
4. מיקרוסקופ אינטרטל
- מניחים את שריר cremaster רכוב במיקרוסקופ זקוף לבצע מיקרוסקופ באמצעות מטרה 40x.
- רכישת נתונים וייצוא באמצעות ספקטרוגרפיה של הדמיה באמצעות תפוקה גבוהה.
- בצע הקלטות תחת היתוך מתמשך עם חימום מראש (35-37 ° c) PSS17. להחיל על ידי אבובים קטן כי כבר מודבק למטרה זקופה של המיקרוסקופ כדי לאפשר טפטוף רציף של PSS לצד המטרה למטה על רקמת השריר.
- לזהות וכלי לאחר הנימים (המפגש של שני כלי קטן יותר) ולמדוד את מחזור המיקרו על כונדו עם קוטר של 20-40 μm.
- הקלטת תמונות ברזולוציה גבוהה של מיקרו מחזור מן השריר cremaster בטווח זמן של 30 s. כפי שיכול להיות כיווץ והרפיה קלה של רקמת השריר במהלך ההקלטה, הקפד ברציפות להתאים את המוקד. באופן כללי, העכבר נוטה להפגין מחזור יציב במשך כ 2 שעות. ניתן לרכוש מספר הקלטות של אוניות שונות מאזורים שונים. לאחר מכן ניתן להשתמש באחת או בשתיהן.
הערה: מכיוון שזה מודל של דלקת, דרכים נפוצות של אינדוקציה הם: יישום מערכתי או הזרקת לועטל מקומי של מגשרים דלקתיים pro, כמו גם superfusion עם למשל N-formylמתיונין-לleucyl-פנילאלנין (fMLP). גירוי מקומי TNF-α משמש בדרך כלל כדי להפעיל גיוס לוקיציט; LPS-המושרה אנדוטוקסין הוא מודל של נכבדיידלקת מערכתית חמורה.
5. הדמיה לוקיציט
הערה: ניתן לראות בקלות מחסיד ומתגלגל לוקיציטים ללא הדמיה נוספת. כדי לקבוע את מהירות הקו המרכזי של הזזת הלוקוציטים בחופשיות, בצע כתמים דיפרנציאלים.
- אם נעשה שימוש בעכברים המסומנים ב-eGFP, יש לנתח אותם ישירות על-ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטית.
- עבור שאינם eGFP המסומנים זנים העכבר, השתמש כתמים rhodamine.
- מנהל הרדאמטין 6G ב 0.2 מ"ג/ק"ג משקל גוף. ניתן לדרוש מינונים חוזרים כדי להשיג עוצמות מספיקות. הקפד לשמור על אמצעי אחסון קטנים, כאמצעי אחסון גדולים יותר עשויים להשפיע על פרמטרים של הומודינמיקה.
- , לצביעת מיידי של לוקיציטים. מנהל את הכתם דרך עורק הראש אם ניתוח עורק הראש לא בוצע, כתמים מספיקים ניתן להשיג על ידי האפליקציה כאשר באמצעות אותה מנה18. כחלופה לצנתור העורק הראשי, ניתן לבצע כל צנתור ורידים אחר.
הערה: זכור כי כתמים rhodamine, בניגוד התיוג eGFP, מראה ריקבון הזמן של עוצמת הקרינה, כמו גם הכולל מכתים מקסימום של כ 80% של לוקיציטים בריכוזים גבוהים. - המחש את הלוקוציטים המוכתמים בחופשיות על ידי המיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
6. סוף הניסוי
הערה: הזמן הכולל המשוער לביצוע פרוטוקול זה אמור להיות 90 – 150 דקות.
- סיים את הניסוי עם המתת חסד. על ידי פריקת צוואר הרחם
- לניתוחים נוספים, כגון transmigration גירה, לתקן את השריר cremaster בתוך הלסת עדיין נמתח על הבמה ומוכתם עבור היסטולוגיה כנדרש.
7. ניתוח לא מקוון
- נתח את הפרמטרים הבאים כספירות פשוטות במהלך הפעלת וידאו.
- חישוב שטף מתגלגל [מספר/מזערי]: מספר התאים הרולינג העוברים קו דמיוני/דקה
- לחשב הדבקה [מספר/mm2]: מספר התאים דבק לקיר כלי בתוך שדה התצוגה ≥ 30 s/משטח כלי דם [מ"מ2].
- מדידת הפרמטרים הבאים של הומודינמיקה ומיקרוכלי דם נמדדים באמצעות ImageJ.
- חשב את קוטר הספינה [μm] כקוטר הקיר הפנימי.
- חישוב אורך כלי הקיבול [μm] כאורך הקו המרכזי של כלי הקיבול.
- לחשב מהירות
קו מרכז המתקבל ניתוח וידאו מסגרת למסגרת של לוקיציטים בחופשיות במרכז קו.
- השתמש במשוואות הבאות כהערכה.
- חישוב משטח כלי דם ב [mm2]: אורך הספינה [μm] x בקוטר כלי הקיבול [μm] x π x 10-6.
- חשב את קצב
ההטיה של הקיר: 4.9 x (8 x מרכז קו מהירות x 0.625/בקוטר הספינה [μm]). - חישוב מהירות זרימת הדם הממוצע: קו מרכז מהירות x 0.625.
- חישוב השטף
הכולל של לוקמיה מערכתית 
x (משמעות זרימת הדם מהירות x 60/1000) x π x 
. - חישוב שבר שטף הגלגול [%]: השטף הגלגול/השטף הכולל לוקיציט x 100.
קו מרכז המתקבל ניתוח וידאו מסגרת למסגרת של לוקיציטים בחופשיות במרכז קו.
ההטיה של הקיר: 4.9 x (8 
הכולל של לוקמיה מערכתית 
x (משמעות זרימת הדם מהירות 
.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
IVM לפי הפרוטוקול המסופק תניב תובנות ייחודיות לתוך המפל של גיוס לוקיציט שריר השלד. סעיף התוצאות יתמקד בתוצאות אופייניות המתקבלות על-ידי IVM וידגיש בעיות פוטנציאליות שעלולות להיתקל בהן.
התוכנית הניסיונית למיקרוסקופיה הינה מחולקת באיור 1. הכנת שריר cremaster והסרת רקמת החיבור חיונית כדי להשיג תמונות מיקרוסקופיים ממוקדת עם משטח אחיד. רקמת חיבור עודפת מובילה בסופו של דבר לתמונות מיקרוסקופיים מטושטשות (וידאו משלים 1) בעת ביצוע ivm. איור 2 מציג דימויים מיקרוסקופיים מייצגים שניתן להשיג באמצעות ivm. ראשון, שלאחר נימי, אשר צריך להיות בין 20-40 יקרומטר בקוטר, מזוהים על ידי הזרימה של שני כלי קטן יותר. רק חסיד ומתגלגל לוקיציטים יכול להיות דמיינו, במחזור הלוקוציטים ניתן לעקוב רק בהילוך חוזר איטי של קטעי וידאו מוקלט. מספרם של הלוקוציטים מוגדר כלוקוציטים נייחים לאורך זמן של 30 שניות ומבוטא ב-mm2 של משטח הספינה (איור 2). מספר הלוקוציטים המתגלגל העובר את החתך שהוגדר בעבר בכלי הקיבול נספר; המהירויות המתגלגלת עשויות להתקבל בניתוח לא מקוון. גלגול עשוי להתבטא כשטף מתגלגל (RF = מספר התאים הרולינג על קו מוגדר מראש/מזערי) או כמו שבר שטף מתגלגל (RFF ב% = RF/סה כ שטף לוקיציטים עובר את כלי). RF הוא תלוי מאוד במספר התאים המחזורי, ואילו RFF מושפע פחות משינויים בספירת תאי דם לבנים (WBCs). שימו לב כי במקרים רבים הדבקות והגלגול הינם בעלי הקשר הפוך; מספר גבוה של לוקיולוציטים עשוי להפחית את הבריכה של תאים מחזורי בחופשיות ובכך לצנן מתגלגל לתאי.
אתגרים טכניים ומלכודות פוטנציאליות
. ומרכיב מבנה כדורי כדי לטעון את השריר אל שלב ההקלטה, חתך האורך נדרש כדי לפתוח את הכדור. הדבר עלול להשפיע על המיקרוקובלטורה הכולל ככלי קיבול קטנים עלולים להיות קטועים. כדי למנוע הטיה לזרימת דם ששונתה, מומלץ לבחור את האזור המרכזי לסידור מסדר. אין לגעת באזור זה ולא להשפיע עליו. בנוסף, מיקרוקאולטרי עשוי למנוע דימום ושינויים הומודינמיקה microנימי. זרימת הדם של נימים סביב בדרך כלל מספק רמז רב ערך אם המחזור מושפע בשל ההכנה בתוך תחום הריבית. באופן כללי, הכלים האבופי יותר (לכיוון הגוף של העכבר) נוטים להראות מיקרו מחזור טוב יותר, אולם לכידת תמונה עשויה להיות מסובכת על ידי תנועה מוגברת והפרעות הנובעות מנשימת החיה.
כדי למנוע את השריר cremaster מייבוש במהלך הקלטה מיקרוסקופית, סופר היתוך קבוע של הרקמה הוא מפורסמים. הרטבה לא מספיקה או מופסקת תגרום לייבוש הרקמה וכישלון הניסוי.
הצמדת רקמת cremaster הוא הכרחי כדי לשמור אותו נמתח ובמקום. כדי לשטח את השריר מפוצל, נדרש מתיחה עדינה. מתיחה קטנה מדי תוצאות רקמה אחידה, אשר מסבך מיקרוסקופ, מתיחה מוגזמת תגביל את זרימת הדם ולפגוע ברקמה. שוב זרימת דם נימי מספק מעמד אמין של מצבו הכולל של זרימת הדם של הרקמה. ניסיון ותרגול נדרש כדי לקבוע את דרגת המתיחה בעת הרכבת הרקמה.
זמני ההכנה הארוכה ישפיעו על המצב הדלקתי הכולל של האורגניזם ונתוני הטיה. לכן, הקפידו להתמקד בשאלת הריבית תוך כדי עיצוב הניסוי ושמרו על זמני ההכנה קצרים ככל הצורך. אם לא מינהל הסמים, הניטור או בדיקות הדם נדרשים הכנה יחיד של רקמת cremaster עשוי להספיק.
ברוב ההגדרות, קבוצות נסיוניות שונות יושוו לחיות סוג פראי. משמעות הדבר היא בעלת חשיבות מרכזית כדי לוודא שהפרמטרים של הומודינמיקה ומיקרוכלי דם דומים בין קבוצות נסיוניות (טבלה 1). מספר רב של פרמטרים עשויים להשפיע על גיוס לוקמיה בvivo, כולל פלט לב, קוטר הספינה, מהירות הקו המרכזי, שיעור ההטיה של הקיר ומספרם של הלוקוציטים במחזור. טבלה 1 מציגה נתונים משני קווים שונים של העכבר הטרנסגניים, העכבר הmdx לקויה הדיסטרופין ואת העכבר Lys-egfp (ביטוי egfp תחת היזם lys ב נויטרופילים ו מקרופאגים). בעוד פרמטרים כגון קוטר כלי יכול להיות נשלט על ידי החוקר, מהירות קו האמצע ואת קצב ההטיה תלוי הומודינמיקה של הקבוצה הניסיונית הפרט או את מאמץ העכבר. ברור, המהירות קו האמצע והקיר להטות את הקצב שונים באופן משמעותי בין העכבר הmdx ו-lys-eGFP (שולחן 1) עושה השוואה משמעותית של נתוני ivm בלתי אפשרי (ניתוח סטטיסטי על ידי t-test עם תיקון של וולש, המשמעות הוגדרה ב P < 0.05). מהירות האמצע מושפע מתפוקת הלב, עמידות בכלי דם היקפיים ונפח בלתי-אפי. לדוגמה, נפח גדול של rhodamine או כל חומר ניסיוני אחר שניתנו באמצעות קטטר העורק מגביר את המהירות קו האמצע מהירות ומעכב לכידת לוקיציט וגלגול (וידאו משלים 2). להיפך, אי ספיקת לב, הרדמה עמוקה או היפותרמיה עלולה להקטין את הזרימה לאחר נימי. לפני שמתקרבים לניתוח לא מקוון של נתוני IVM, יש להגדיר דרישות של איכות נתונים (לדוגמה, פרמטרים הומודינמיים בתוך טווחים פיזיולוגיים), כדי להסיק מסקנות משמעותיות ולהקטין את ההטיה.
כדי לקבוע את מהירות האמצע, המחזור החופשי של הלוקוציטים צריך להיות מדמיינו. גם, לוקיציטים פלורסנט (כמו בעכברים lys-eGFP) ניתן להשתמש או לוקיציטים חייב להיות צבוע עם ריאגנטים פלורסנט כמו rhodamine (איור 3). רודמון יכול להיות מיושם דרך צנתר העורק הראש או כזריקה כגון. מאחר והרומדן מועבר בהדרגה על ידי סוגי תאים אחרים כמו גם, טיטור של מינון וזמן הוא חיוני. מינון עודף ומרווחי זמן ארוכים יפיקו רקע משמעותי במהלך המיקרוסקופיה.
לבסוף, אנחנו אוהבים להצביע על מגוון ביולוגי של זנים שונים של העכבר. מלבד זנים ששונו גנטית, גם בדרך כלל מקובלים זנים סוג פראי עשוי להראות שונות פיזיולוגית. איור 4 משווה שחור מועסק בדרך כלל 6 (C57BL/6) כדי שחור 10 (C57BL/10ScSn) עכברים. שחור 6 עכברים בבירור להראות מתגלגל משופר, הדבקה ו טרנסלוציטים של leucocytes לעומת שחור 10 עכברים (ניתוח סטטיסטי על ידי מערכת ANOVA בדרך אחת עם Tukey ' s הבדיקה הפוסט-הוק; המשמעות הוגדרה ב P < 0.05), אף על פי שני זנים המכונה סוג פראי. לכן, הרקע הגנטי הנכון צריך להיחשב, במיוחד בעת ניצול עכברים הטרנסגניים. במסגרת הניסיונית שלנו, השוואה של 6 עכברים שחור ועכברים mdx טרנסגניים (שחור 10 רקע) היה מסתיר במידה רבה את המצב הדלקתי משופר של עכברים mdx הדיסטרופין לקויה מעל שחור הנכון שלהם 10 סוג הרקע פראי (איור 4).
איור 1: כיוונון נסיוני סכמטי של ivm על שריר cremaster. לאחר ההרדמה, קנה הנשימה הוא קננולה. וצנתר מוצב בעורק הראשי השריר הקרמסטר נחשף ומוכן למיקרוסקופיה במיקרוסקופ זקוף בעזרת מיקרוסקופ אור או פלורסנט. סרטי וידאו מתקבלים לניתוח לא מקוון מאוחר יותר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מקטע שלאחר קפילר מפלח מיקרוסקופ עם מסגרות רציפות. העמודה השמאלית מציגה תמונות מיקרוסקופיים קלות, להדמיה טובה יותר הכלי מחולק לקווים מנוקדים. הווריד מזוהה על ידי כלי שוטפת (מסומן על ידי כוכביות אדומות) וקוטר של כלי קיבול של < 40 μm. העמודה הימנית מתארת ייצוג סכמטי של התמונה השמאלית המתאימה, המציגה את הלוקוציטים באדום. ארבע השורות הראשונות מציגות תמונות רציפים של אותו כלי לאורך זמן. השורה התחתונה מצביעה על לוקיציטים. בייצוג הסכימטי, הלוקוציטים הבודדים ומרחק הגלגול שלהם מסומנים. הדבקות בניתוח לא מקוון למילימטר מרובע, שטף מתגלגל כמו גם מהירות גלגול עשוי להיות מחושב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: לוקיציטים מתגלגל עשוי להיות מדמיין על ידי ביטוי טרנסגניים של סמנים פלורסנט או על ידי כתמים משניים עם rhodamine. מייצגים תמונות מיקרוסקופיים של גיוס לוקיציט של eGFP לוקיציטים ו rhodamine המסומנים לוקיציטים מ n = 3 בעלי חיים כל אחד. מתגלגל נויטרופילים ביטוי eGFP תחת היזם lys מ lys-eGFP עכברים הטרנסגניים ניתן לזהות ישירות על-ידי מיקרוסקופ אימונולואוורניאני (העמודה השמאלית). לוקיציטים ללא יצרני פלורסנט עשויים להיות מוכתמים בהזרקה או הזרקה בתוך הצפק (עמודה מימין). בעיקר, rhodamine לא נלקח באופן בלעדי על ידי נויטרופילים, נותן רקע משמעותי יותר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: השוואה של גיוס לוקיציט בזנים שונים של העכבר סוג הטרנסגניים. (א) שבר השטף המתגלגל, (ב) הדבקה ו (ג) הגירה של leucocytes מושווה בין שחור 6 (C57BL/6j), שחור 10 (C57BL/10scsnj) ועכברים Mdx (C57BL/10scsn-dmdmdxJ), המוצג כממוצע + SEM. שחור 6 עכברים להראות גיוס לוקיציט משופרת לעומת 10 עכברים שחור באופן דומה, עכברים mdx יש גיוס גבוה יותר לעומת שחור 10, אבל לא לעומת שחור 6 עכברים סוג פראי. נתונים אלה מדגים את החשיבות של הקצאת פקדים גנטיים נכונים. נתונים מ לפחות n = 3 בעלי חיים לכל קבוצה. ניתוח סטטיסטי של ANOVA בכיוון אחד עם הניתוח הפוסט-הוק של Tukey. המשמעות הוגדרה ב-P < 0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| מאמץ העכבר | לא. של עכברים | לא. של | קוטר כלי | מהירות קו אמצע | שיעור גזירה בקיר | מערכתית-WBC |
| N | n | יקרומטר | μm/s | s-1 | /μi | |
| mdx | 3 | 12 | 28 ± 4 | 1150 ± 50 | 1010 ± 100 | 5200 ± 300 |
| ליס-eGFP | 3 | 15 | 27 ± 2 | 2220 ± 90 | 2030 ± 90 | 5800 ± 100 |
| P | 0.83 | 0.0005 | 0.0016 | 0.13 |
טבלה 1: פרמטרים רלוונטיים של הומודינמיקה ומיקרוכלי דם משני קווי עכבר טרנסגניים שונים. קוטר הספינה, מהירות הקו המרכזי, קצב הטיית הקיר ומערכתית WBCs מוצגים עבור עכברים mdx חסר הדיסטרופין ו-lys-eGFP עכברים. בדוגמה זו עכברים mdx (C57BL/10J, שחור 10 רקע) ו-lys-eGFP עכברים (C57BL/6J, שחור 6 רקע) להראות סטטיסטית מהירות שונה קו האמצע ואת הקיר שיעור להטות ואין להשוות באמצעות IVM. נתונים למופת מתוך לפחות n = 3 בעלי חיים לכל קבוצה מוצגים כממוצע ± SEM. ניתוח סטטיסטי על ידי מבחן t מזווג עם תיקון של וולש. המשמעות הוגדרה ב-P < 0.05.
וידאו משלים 1: השפעה מיקרוסקופית של הסרה מספיק של רקמת החיבור על שריר cremaster. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה (לחץ לחיצה ימנית להורדה).
וידאו משלים 2: זרימת דם משתנה על ידי או hypervolemia או לחץ דם. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה (לחץ לחיצה ימנית להורדה).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
IVM כשיטה נעשה שימוש נרחב כדי ללמוד סוגים שונים של תאים באיברים שונים ותיאר בהרחבה ודנו19. המטרה העיקרית של מחקר זה היא לספק גישה יעילה להגדיר ולבצע IVM בשריר cremaster. תרגול השיטה יפיק תוצאות אמינות ומיוצרות. לפיכך, תכנון וסטנדרטיזציה הם גורמי מפתח לשלוט בטכניקה. מעל לכל, הטכניקה תלויה מאוד פרמטרים הומודינמיים ומיקרוכלי דם, אשר צריך להיות מפוקח בקפדנות ונשלט עבור. ככזה, הומודינמיקה שונה בין קבוצות תניב תוצאות מטעה.
למרות תפקידה בחקר התנאים הפיזיולוגיים והפתולוגיים, IVM בלבד לא יכול לחשוף במלואו את התרומה האישית של סוגי תאים ספציפיים לגיוס לוקיציט בדלקת. לשם כך, ניתן לשלב שיטות משלימות אחרות עם IVM. לדוגמה, שיטות vivo לשעבר כגון ניסויים בתאי הזרימה עשויים להתוות בין השפעות האנדותל או הלוקוציט. כמו כן, תאי הזרימה הם כיוונונים מצוינים לתרגם ממצאים מכרסמים ללוציטים אנושיים, למשל בתינוקות היילוד20. עוד, בשיטות חוץ גופית כמו FACS או אימונוהיסטוכימיה צריך להשלים ניסויים IVM. כל שיטה יכולה להוסיף מידע מסוים שנרכש מסביבה מבוקרת עם גורמים מייסדים קטנים.
ההכנה הטראומטית המוצגת כאן דומה לתנאי הבסיס הפיזיולוגי של דלקת באופן הדוק ככל האפשר. עם זאת, הכנה כירורגית החובה עצמה היא גירוי של דלקת, אשר חייב להיחשב לפרשנות. גירוי TNF תרופתי של רקמת cremaster עשוי לספק מצב נוסף כדי להגביר את הגיוס דלקתית מעבר גירוי טראומטי כירורגי16. עוד, זני עכבר שונים עשויים להציג תגובות ששונו כלפי גירויים סטנדרטיים. הדגמנו כי אפילו זנים נפוצים סוג פראי עשוי להפגין מצבים בסיסיים שונים של גיוס לוקיציט. הדבר מציג את החשיבות של הקצאת פקדים גנטיים נכונים והקמת נתוני בסיס עבור קבוצות נסיוניות חדשות בעת תכנון ניסויים. כמו זנים טרנסגניים מאוד שופע בימים אלה, סביר להניח כי גם זנים זהים עשויים להיות שונים לאורך זמן, תלוי ברבייה.
ביחד, IVM הוא כלי רב עוצמה כדי לפקח על גיוס לוקיציט בהקשר הביולוגי של העכבר צריך להיות מלווה עם לשעבר vivo ובטכניקות מבחנה. עוד, cremaster IVM מאפשר מגוון רחב של מצבים שונים כולל כתמים תא ספציפי, גירוי דלקתי או מניפולציה פרמקולוגית וטיפול מקדים. ככזה הוא עשוי לשמש פלטפורמה להערכת מגשרים תרופתי שונים והשפעות ביולוגיות שלהם במחקרים קדם קליניים במיוחד בתחום הדלקת ובמיוחד בmusculopathies דלקתיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
מחקר זה היה נתמך על ידי הממשלה הפדרלית הגרמני של החינוך והמחקר (BMBF) 01GL1746E כחלק הקונסורציום הראשוני. המחברים מכירים ברטה הירמן וסילביה Pezer לקבלת סיוע טכני מיומן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Ketanest S | Pfizer Pharma GmbH | PZN: 08509909 | anesthesia. Generic / IUPAC Name: ketamine |
| Xylazine | CP-Pharma GmbH | Article-nr.: 1205 | anesthesia. Generic / IUPAC Name: xylazine (as hidrochloride) |
| Saline Solution | B. Braun Melsungen | PZN 02737756 | surgical preparation. Generic / IUPAC Name: sodium chloride |
| Syringe needle Omnican F | B. Braun Melsungen | REF 9161502 | surgical preparation |
| Suture 6/0 USP | Resorba | REF 4217 | surgical preparation |
| Polyethylene tube #10 | BD GmbH | Supplier No. 427401 | surgical preparation |
| Polyethylene tube #90 | BD GmbH | Supplier No. 427421 | surgical preparation |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | CAS Number 989-38-8 | leukocyte staining. Generic / IUPAC Name: ethyl 2-[3-(ethylamino)-6-ethylimino-2,7-dimethylxanthen-9-yl]benzoate |
| Setup Equipment | |||
| Upright microscope | Olympus | BX51W1 | microscopy |
| 40-fold objective | Zeiss | Achroplan 40 × /0.80 W | microscopy |
| ImSpector software | Lavision Biotec GmbH | ver. 4.0.469 | software |
| ImageJ | National Institute of Health, USA | ver. 1.51j8 | software |
References
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
- Zanardo, R. C. O., et al. A down-regulatable E-selectin ligand is functionally important for PSGL-1-independent leukocyte-endothelial cell interactions. Blood. 104 (12), 3766-3773 (2004).
- Woodfin, A., et al. ICAM-1-expressing neutrophils exhibit enhanced effector functions in murine models of endotoxemia. Blood. 127 (7), 898-907 (2016).
- Frommhold, D., et al. RAGE and ICAM-1 cooperate in mediating leukocyte recruitment during acute inflammation in vivo. Blood. 116 (5), 841-849 (2010).
- Braach, N., et al. RAGE controls activation and anti-inflammatory signalling of protein C. PloS One. 9 (2), 89422 (2014).
- Frommhold, D., et al. RAGE and ICAM-1 differentially control leukocyte recruitment during acute inflammation in a stimulus-dependent manner. BMC Immunology. 12 (1), 56 (2011).
- Braach, N., et al. Anti-inflammatory functions of protein C require RAGE and ICAM-1 in a stimulus-dependent manner. Mediators of Inflammation. 2014, 743678 (2014).
- Girbl, T., et al. Distinct Compartmentalization of the Chemokines CXCL1 and CXCL2 and the Atypical Receptor ACKR1 Determine Discrete Stages of Neutrophil Diapedesis. Immunity. 49 (6), 1062-1076 (2018).
- Smith, M. L., Olson, T. S., Ley, K. CXCR2- and E-selectin-induced neutrophil arrest during inflammation in vivo. The Journal of Experimental Medicine. 200 (7), 935-939 (2004).
- Emre, Y., Jemelin, S., Imhof, B. A. Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time. Journal of Visualized Experiments. (105), (2015).
- Eriksson, E., Boykin, J. V., Pittman, R. N. Method for in vivo microscopy of the cutaneous microcirculation of the hairless mouse ear. Microvascular Research. 19 (3), 374-379 (1980).
- von Andrian, U. H. Intravital microscopy of the peripheral lymph node microcirculation in mice. Microcirculation. 3 (3), New York, N.Y. 287-300 (1996).
- Hudalla, H., et al. LPS-induced maternal inflammation promotes fetal leukocyte recruitment and prenatal organ infiltration in mice. Pediatric Research. 84 (5), 757-764 (2018).
- Grant, R. T. Direct observation ok skeletal muscle blood vessels (rat cremaster). The Journal of Physiology. 172 (1), 123-137 (1964).
- Thiele, J. R., Goerendt, K., Stark, G. B., Eisenhardt, S. U. Real-time digital imaging of leukocyte-endothelial interaction in ischemia-reperfusion injury (IRI) of the rat cremaster muscle. Journal of Visualized Experiments. (66), e3973 (2012).
- Kranig, S. A., et al. Dystrophin deficiency promotes leukocyte recruitment in mdx mice. Pediatric Research. 11, 4457 (2019).
- Bagher, P., Segal, S. S. The mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation. Journal of Visualized Experiments. (52), e2874 (2011).
- Reichenbach, Z. W., Li, H., Gaughan, J. P., Elliott, M., Tuma, R. IV and IP administration of rhodamine in visualization of WBC-BBB interactions in cerebral vessels. Microscopy Research and Technique. 78 (10), 894-899 (2015).
- Secklehner, J., Lo Celso, C., Carlin, L. M. Intravital microscopy in historic and contemporary immunology. Immunology and Cell Biology. 95 (6), 506-513 (2017).
- Nussbaum, C., et al. Neutrophil and endothelial adhesive function during human fetal ontogeny. Journal of Leukocyte Biology. 93 (2), 175-184 (2013).
