Summary
Her viser vi, hvordan man udfører intravital mikroskopi på post-kapillær venules af musen cremaster muskel. Almindeligt anvendt på forskellige modeller af inflammation og sepsis, især dem, der induceres af chemokiner og cytokiner, vi fremhæve dens relevans i studiet af muscoloiatier involverer overdrevet muskuløs leukocyt infiltration.
Abstract
Intravital mikroskopi (IVM) er almindeligt anvendt til at overvåge fysiologiske og patofysiologiske processer inden for leukocyt rekruttering kaskade in vivo. Den nuværende protokol repræsenterer en praktisk og reproducerbar metode til at visualisere leukocyte endothelium interaktion fører til leukocyt rekruttering i skeletmuskulatur afledt væv i den intakte organisme af musen. Modellen gælder for alle forskningsområder, der fokuserer på granulocyt aktivering og deres rolle i sygdom.
Vi leverer en trinvis protokol til at guide gennem metoden og til at fremhæve potentielle faldgruber og tekniske vanskeligheder. Protokollen dækker følgende aspekter: eksperimentelle indstillinger og nødvendigt materiale, anæstesi af musen, dissektion af cremaster muskel samt trakeal og carotis cannulation, IVM optagelser og offline analyse. Dataformater som klæbende leukocytter, rullende flux (RF) og rullende flux fraktion (RFF) er forklaret i detaljer og passende applikationer diskuteres. Repræsentative resultater fra dystrophin mangelfuld mdx mus er fastsat i resultatsektionen.
IVM er et effektivt værktøj til at vurdere leukocyt rekruttering i en in vivo indstilling; men delineating for eksempel endotel og leukocyt funktion kan kræve en kombination med ex vivo opsætninger som flow kammer eksperimenter. Desuden kan den genetiske baggrund for dyr af interesse i høj grad påvirke baseline rekruttering, kræver individuel finjustering af den fastsatte protokol. På trods af sine begrænsninger, iVM kan tjene som en platform til let oversætte in vitro resultater i en levende hvirveldyr organisme.
Introduction
Intravital mikroskopi (IVM) er et almindeligt anvendt værktøj inden for leukocyt biologi. Leukocyte rekruttering følger en kaskade af veldefinerede begivenheder indledt af leukocyt fange, rullende og vedhæftning til endotelvæggen, og endelig transmigration og extravasation af leukocytter til det faktiske sted for inflammation1. Hvert trin medieres og kontrolleres af forskellige chemokiner (f.eks.2,3 Samspillet mellem forskellige regulerende steder, kontrollerende faktorer og mediatorer af leukocyt rekruttering kaskade som receptor af avancerede glykering slutprodukter (RAGE), intercellulær vedhæftning molekyle 1 (ICAM-1), C-X-C motiv ligand (CXCL)1/2 og deres receptor CXCR2 blev afsløret ved hjælp af IVM4,5,6,7,8,9.
Metoden til IVM er blevet beskrevet for mange forskellige organer og væv såsom tarmen10, hud11, lymfeknuder12, embryonale æggeblomme sæk13 og andre. Men den mest undersøgte metode til IVM er cremaster model, først beskrevet i rotter14. Mens der stadig anvendes i rotter15, metoden er i dag hovedsageligt anvendes i mus på grund af den høje overflod af forskellige transgene linjer. Vores gruppe har for nylig fremhævet den potentielle rolle cremaster IVM inden for inflammatoriske muscolopathies som Duchenne muskelsvind (DMD) studerer dystrophin-mangelfuld mdx mus16. På grund af sin tynde sammenvævede og let tilgængelige fibersammensætning repræsenterer cremaster-musklen den ideelle kandidatmuskel, der skal studeres som en hel mount ved hjælp af lys eller fluorescerende mikroskopi. Leukocyte rekruttering og ekstravasation hovedsageligt finde sted i post-kapillær venules, som let kan identificeres på en kontinuerlig muskuløs lag i cremaster muskel.
Fordelen ved in vivo-billeddannelse sammenlignet med andre in vitro-analyser er dens biologiske kontekst i en levende organisme. Samtidig kan delineating cellespecifikke bidrag til ændret leukocytrekruttering kræve yderligere in vitro-modeller som flowkamre eller endotelaser. Kombinationen af flere metoder vil give mest overbevisende data. Forskere bør være opmærksomme på begrænsningerne i cremaster model som enhver kirurgisk manipulation vil føre til øget leukocyte handel og rekruttering. Derfor er det vanskeligt at vurdere baseline rekruttering med denne metode. På trods af sin brede anvendelse, kan IVM af cremaster være udfordrende og en ny opsætning kan tage tid og ressourcer til at etablere. Vi leverer nu en nem protokol, som vil bidrage til at undgå nogle af de almindelige fejl i IVM. Begrænsninger vil også blive drøftet, og gratis metoder vil blive fremhævet, hvor det er relevant.
IVM af cremaster repræsenterer en ideel tilgang, der skal gennemføres inden for inflammatoriske og smitsomme undersøgelser. Mere specifikt, cremaster model kan være af stor interesse for forskere studerer skeletmuskulatur biologi i forbindelse med inflammatorisk sygdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyrene blev opstaldet under kontrollerede og specifikke patogenfrie forhold på IBF (Interfakultäre Biomedizinische Forschungseinrichtung), Heidelberg. Alle de procedurer, der er beskrevet her, blev godkendt af den lokale IRB og Regierungspraesidium Karlsruhe, Baden-Wuerttemberg, Tyskland.
1. Anæstesi administration
- Bedøve musen ved intraperitoneal (i.p.) bolus injektion af 125 mg/kg ketamin og 12,5 mg/kg xylazine.
- Placer og fastgør musen i en rygliggende liggende position på en varmepude for at opretholde musens kropstemperatur (36,5-38 °C). Brug en ikke-absorberbar steril sutur (6/0) til at vikle en simpel løkke rundt om fronttænderne og tape de sammenføjningsender af suturen til varmepuden. Denne fiksering har til formål at holde munden åben for at undgå forstyrrelser i vejrtrækningen.
- Kontroller musen for passende dybde af anæstesi ved interdigital tå knivspids (tilbagetrækning bør ikke ses).
- Når tilstrækkelig anæstesi er nået gå videre til kirurgisk forberedelse. Gentagne gange bekræfte anæstesi langs den igangværende eksperiment hver 30 min. Re-administrere narkotika som beskrevet ovenfor, hvis det er nødvendigt.
- Equilibrate fysiologisk saltopløsning (PSS, sammensætning: 132 mmol/L NaCl, 4,7 mmol/L KCl, 1,2 mmol/L MgS04,2,0 mmol/L CaCl2, 18 mmol/L NaHCO3) med 5% CO2/95% N2 i 15 minutter. Bubble PSS med 5% CO2/95% N2 gennem hele forsøget og hold ved 37 °C.
2. Kirurgisk præparat af luftrøret og halspulsåren (valgfrit)
- Dissekere huden fra halsområdet ved forsigtigt at trække huden med en pincet i midterlinjen. Brug en saks til at anvende et cirkulært snit på 1-2 cm i diameter for at give plads nok til kirurgisk forberedelse.
- Omhyggeligt dissekere de omkringliggende muskler, fedt og bindevæv ved hjælp af pincet.
- Lav et tværgående snit (~ 1,3 mm) ind i luftrøret ved hjælp af små kirurgiske saks og indføre en polyethylen rør (ID x AD 0,034" x 0,050 ") inde i caudal ende af luftrøret for at sikre de øvre luftveje.
- Anbring røret i luftrøret med en enkelt cirkulær knudesutur (6/0 USP).
- Find halspulsåren langs højre side af luftrøret og dissekere det omgivende væv fra halspulsåren væggen. Alternativt kan halspulsåren eller også halvenen bruges til i.v. adgang. Prøv at undgå skader på vagus nerven, da det er placeret tæt.
- Pass to stykker sutur (6 / 0) under halspulsåren. Placer den første kraniesutur proksimalt, tæt på tvedeling af halspulsårer og binde det permanent. Den anden sutur vil blive placeret omkring 5-8 mm distale fra den første og senere bruges til at sikre røret i halspulsåren. Bind den ikke endnu.
- Der fremstilles et polyethylenrør (ID x O.D. 0,011" x 0,024") med en længde på 30 cm ved at bøje endedelen til en 1 ml sprøjtekanyle fyldt med saltvand (0,9% NaCl). Streng rødmen er vigtig for at forhindre luftembolisering under forberedelse.
- Brug en 7 mm karclips til at klemme halspulsåren distalt af den anden sutur.
- Udfør et lille tværgående snit (~0,5 mm) i halspulsåren og fremfør det sterile polyethylenrør. Fastgør røret i arterien ved hjælp af den anden sutur forberedt før.
- Fjern beholderens clips, og påfør forsigtigt lidt spænding på sprøjten, der er tilsluttet polyethylenrøret. Dette carotis kateter kan nu bruges til at administrere narkotika eller tage blodprøver, hvis det kræves, selv overvågning af blodtryk eller puls er muligt med respektive enheder.
3. Kirurgisk forberedelse af cremaster musklen
- Overfør musen på varmepladen (sammen med varmepuden) til den specialfremstillede plastramme, der holder scenen til senere mikroskopi. Orienter musen med sin pung mod mikroskopfasen.
- Revurdere dybden af anæstesi, før du fortsætter; genindadministrere en kvart til halv dosis anæstesi, hvis det er nødvendigt.
- Lokalisere pungen, holde den på sin mest distale del ved hjælp af pincet, trække det forsigtigt og afbrød en cirkulær del af scrotal hud med omkring 5 mm i diameter. Sørg for ikke at skade de underliggende strukturer såsom cremaster muskel. Sørg for at holde det åbne væv godt hydreret med saltvandsopløsning.
- Dissekere løs bindevæv ved hjælp af to pincet og lokalisere begge testikler.
- Hold en testis distally og forsigtigt begynde at trække det ud, fjerne omgivende bindevæv trin for trin.
- Når testiklerne er eksterier, fastgør dens distale ende til gummiringen omkring scenen. Ved eksteribilisering, fugtvævet med saltvandsopløsning under hele processen.
- Kritisk trin: Fjern forsigtigt bindevæv uden at skade den underliggende cremaster muskel. Overskydende bindevæv kan blokere synet i senere mikroskopi og kan producere slørede billeder.
- Pin den distale del af testis ned og åbne cremaster muskel med en lille tværgående snit (ca. 1 mm), efterfulgt af langsgående snit fra den meget distale til den proksimale ende. Som et resultat cremaster muskel bør åbne sfærisk. Makroskopisk synlige fartøj bør ikke afskåret, da dette kan påvirke hæmodynamik.
- Forsigtigt sprede musklen over glasscenen og pin det til gummiringen. Sørg for ikke at røre eller skade den centrale region, da mikroskopi vil blive udført her.
Forsigtig: Overskydende strækning kan blokere blodgennemstrømningen. - Pin de resterende testier til side for at give adgang til regionen af interesse. Sørg for at fugte med PSS gentagne gange for at forhindre tørring. Den monterede muskel er nu klar til mikroskopi.
4. Intravital mikroskopi
- Placer den monterede cremaster muskel i opretstående mikroskop og udføre mikroskopi ved hjælp af en 40x mål.
- Anskaf data og eksport ved hjælp af billeddannelsesspektrografi med høj overførselstilførslen.
- Udfør optagelser under kontinuerlig overfusion med forvarmet (35-37 °C) PSS17. Påfør superfusion af en lille slange, der er blevet tapede til oprejst mål af mikroskopet for at tillade kontinuerlig dryp af PSS sammen med målet ned på muskelvæv.
- Identificer postkapillær venuler (sammenløbet af to mindre kar) og mål mikrocirkulationen på venuler med en diameter på 20-40 μm.
- Optag billeder i høj opløsning af mikrocirkulationen fra cremastermusklen i et tidsinterval på 30 s. Da der kan være let sammentrækning og afslapning af muskelvæv under optagelsen, Sørg for løbende at justere fokus. Generelt musen har tendens til at udstille stabil cirkulation i ca 2 timer. Det er muligt at erhverve flere optagelser af forskellige fartøjer fra forskellige regioner. Den ene eller begge testkan anvendes efterfølgende.
BEMÆRK: Da dette er en model af betændelse, almindelige måder induktion er: systemisk anvendelse eller lokal scrotal Ninjektion af pro inflammatoriske mediatorer samt superfusion med for eksempel N-Formylmethionyl-leucyl-phenylalanin (fMLP). Lokal TNF-α stimulation er almindeligt anvendt til at udløse leukocyt rekruttering; LPS-induceret endotoxemia er en model af SIRS svær systemisk inflammation.
5. Leukocyte visualisering
BEMÆRK: Klæbende og rullende leukocytter kan nemt ses uden yderligere visualisering. For at bestemme midterlinjen hastighed frit bevægelige leukocytter, udføre differentialfarvning.
- Hvis der anvendes eGFP-mærkede mus, skal du analysere dem direkte ved fluorescensmikroskopi.
- For ikke-eGFP-mærkede musestammer skal du bruge rhodaminefarvning.
- Administrere rhodamin 6G ved 0,2 mg/kg kropsvægt. Gentagne doser kan være nødvendige for at opnå tilstrækkelig farvning intensiteter. Sørg for at holde små mængder, da større mængder kan påvirke hæmodynamiske parametre.
- For øjeblikkelig farvning af leukocytter, administrere pletten via halspulsåren. Hvis der ikke er udført halspulsårens dissektion, kan der opnås tilstrækkelig farvning ved i.p. anvendelse med samme dosis18. Som et alternativ til halspulsåren kateterisation, enhver anden venekateterisering kan udføres.
BEMÆRK: Husk, at rhodamin farvning, i modsætning til eGFP mærkning, viser tid henfald af fluorescens intensitet samt en samlet farvning maksimum på omkring 80% af leukocytter ved højere koncentrationer. - Visualiser frit bevægende rhodamine farvede leukocytter ved fluorescens mikroskopi.
6. Forsøgets afslutning
BEMÆRK: Den samlede anslåede tid til at udføre denne protokol bør være 90 – 150 minutter.
- Afslut forsøget med aktiv dødshjælp ved cervikal dislokation.
- For yderligere analyser, såsom transmigration, fastgør cremastermusklen i PFA, mens den stadig strakte sig på scenen og farves for histologi efter behov.
7. Offline analyse
- Analysér følgende parametre som simple optællinger under videoafspilning.
- Beregn rulleflux [tal/min]: antal rullende celler, der passerer en imaginær linje/min
- Konstion [antal/mm2]: antal celler klæber til karvæggen inden for synsfeltet ≥ 30 s/vaskulær overflade [mm2].
- Mål følgende hæmodynamiske og mikrovaskulære parametre måles ved hjælp af ImageJ.
- Beholderens diameter [μm] beregnes som den indre vægdiameter.
- Beholderens længde [μm] beregnes som fartøjets midterlinjelængde.
- Beregn midterlinjehastighed
opnået fra frame-to-frame video analyse af frit bevægelige leukocytter i midterlinjen.
- Brug følgende ligninger som et forkalkulationslayout.
- Vaskulær overflade i [mm2]: beholderens længde [μm] x beholderdiameter [μm] x π x 10-6.
- Beregn vægforskydningshastigheden:
4,9 x (8 x midterlinjehastighed x 0,625/kardiameter [μm]). - Beregn den gennemsnitlige blodgennemstrømningshastighed : midterlinjehastighed x 0,625.
- Beregn den
samlede leukocytflux : 
systemisk leukocyttal x (gennemsnitlig blodgennemstrømningshastighed 
x 60/1000) x π x . - Beregn rullende fluxfraktion [%]: rullende flux/total leukocyt flux x 100.
opnået fra frame-to-frame video analyse af frit bevægelige leukocytter i midterlinjen.
4,9 x (8 x midterlinjehastighed 
samlede leukocytflux : 
systemisk leukocyttal x (gennemsnitlig blodgennemstrømningshastighed 
x 60/1000) x π x .Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
IVM som pr den medfølgende protokol vil give unikke indsigter i kaskade af leukocyte rekruttering i skeletmuskulatur. Afsnittet resultater vil fokusere på typiske resultater opnået ved IVM og fremhæve potentielle problemer, der kan støde på.
Den eksperimentelle opsætning for intravital mikroskopi er beskrevet i figur 1. Forberedelse af cremaster musklen og fjernelse af bindevæv er afgørende for at opnå fokuserede mikroskopiske billeder med en ensartet overflade. Overskydende bindevæv i sidste ende fører til slørede mikroskopiske billeder (Supplerende Video 1), når de udfører IVM. Figur 2 viser repræsentative mikroskopiske billeder, der kan fås ved hjælp af IVM. For det første identificeres postkapillære venuler, som skal være mellem 20-40 μm i diameter, ved sammenløbet af to mindre fartøjer. Kun klæbende og rullende leukocytter kan visualiseres, cirkulerende leukocytter kan kun spores i slowmotion replay af optagede videoer. Antallet af klæbende leukocytter defineres som stationære leukocytter over en tid på 30 sekunder og udtrykt pr. mm2 af fartøjets overflade (Figur 2). Antallet af rullende leukocytter, der passerer et tidligere defineret tværsnit af fartøjet, tælles. rullende hastigheder kan opnås ved offlineanalyse. Valsning kan udtrykkes som rullende flux (RF = antal rullende celler over en foruddefineret linje/min) eller som rullende fluxfraktion (RFF i % = RF/total leukocytter, der passerer fartøjet). RF er meget afhængig af antallet af cirkulerende celler, mens RFF er mindre påvirket af ændringer i antallet af hvide blodlegemer (WBCs). Bemærk, at i mange tilfælde leukocyte overholdelse og rullende er omvendt relateret; et stort antal klæbende leukocytter kan reducere puljen af frit cirkulerende celler og dermed dæmpe leukocytrullende.
Tekniske udfordringer og potentielle faldgruber
Cremaster musklen omslutter testiklerne og samler en sfærisk struktur. For at montere musklen på optagelsesfasen kræves der et indsnit i længderetningen for at åbne kuglen. Dette kan påvirke den samlede mikrotidulatur, da små fartøjer kan blive afskåret. For at undgå bias til ændret blodgennemstrømning, er det tilrådeligt at vælge det centrale område for genbestilling. Dette område bør hverken røres eller manipuleres. Derudover kan mikrocautery forhindre blødning og ændringer i mikrovaskulær hæmodynamik. Blodgennemstrømningen af omkringliggende kapillærer generelt giver et værdifuldt vink, hvis omsætning er påvirket på grund af forberedelse inden for det område af interesse. Generelt har mere proksimale kar (mod kroppen af musen) tendens til at vise bedre mikrocirkulation, men billedoptagelse kan kompliceres af øget bevægelse og forstyrrelser, der skyldes vejrtrækning af dyret.
For at forhindre cremaster musklen i at tørre ud under mikroskopisk optagelse, permanent superfusion af vævet er fremtrædende. Utilstrækkelig eller afbrudt fugtning vil resultere i tørring af vævet og svigt af forsøget.
Pinning af cremaster væv er nødvendigt at holde det strakt og på plads. At flade den tværstribede muskel, blid stretching er påkrævet. For lidt stretch resulterer i ujævnt væv, hvilket komplicerer mikroskopi, overdreven stretching vil begrænse blodgennemstrømningen og skade vævet. Igen kapillær blodgennemstrømning giver en pålidelig status af den samlede kredsløbssygdomme tilstand af vævet. Erfaring og praksis er nødvendig for at bestemme graden af stretch, når du monterer vævet.
Lange forberedelsestider vil påvirke organismens samlede inflammatoriske tilstand og biasdata. Sørg derfor for at fokusere på spørgsmålet om interesse, mens du designer eksperimentet og holder tilberedningstiden så korte som nødvendigt. Hvis ingen lægemiddeladministration, overvåge eller blodprøver er påkrævet en enestående forberedelse af cremaster væv kan være tilstrækkelig.
I de fleste sammenhænge vil forskellige forsøgsgrupper blive sammenlignet med vilde dyr. Det er af afgørende betydning at sikre, at hæmodynamiske og mikrovaskulære parametre er ens mellem forsøgsgrupper (tabel 1). Et væld af parametre kan påvirke leukocyt rekruttering in vivo, herunder hjerteoutput, fartøjdiameter, centerlinjehastighed, vægforskydningshastighed og antallet af cirkulerende leukocytter. Tabel 1 viser data fra to forskellige transgene muselinjer, dystrophin-mus, der mangler mdx-mus, og lys-eGFP-musen (udtrykker eGFP under lyspromotor i neutrofiler og makrofager). Mens parametre såsom fartøjets diameter kan styres af investigator, afhænger centerlinjehastigheden og forskydningshastigheden af den enkelte forsøgsgruppes eller musestammens hæmodynamik. Det er klart, at midterlinjen hastighed og væg forskydning sats er signifikant forskellige mellem mdx og lys-eGFP mus (Tabel 1) gør meningsfuld sammenligning af IVM data umuligt (statistisk analyse ved t-test med Welch's korrektion, signifikans blev sat til P < 0,05). Midterlinjen hastighed er påvirket af hjerte-output, perifer vaskulær modstand og intravasal volumen. For eksempel, en stor mængde af rhodamin eller andre eksperimentelle stof givet via caroter kateteret øger post kapillær centerlinje hastighed og hæmmer leukocyt fange og rullende (Supplerende Video 2). Tværtimod, hjertesvigt, dyb anæstesi eller hypotermi kan falde post-kapillær flow. Før man nærmer sig offlineanalyse af IVM-data, bør kravene til datakvalitet (f.eks. hæmodynamiske parametre inden for fysiologiske områder) defineres for at drage meningsfulde konklusioner og reducere skævheder.
For at bestemme midterlinjen hastighed, frit cirkulerende leukocytter skal visualiseres. Enten kan der anvendes fluorescerende leukocytter (som i lys-eGFP-mus), eller leukocytter skal anvendes med fluorescerende reagenser som rhodamin (figur 3). Rhodamine kan påføres via caroterkatetret eller som en i.p. injektion. Da rhodamine gradvist tages op af andre celletyper samt, en titrering af dosering og tid er afgørende. Overskydende dosering og lange intervaller vil give betydelig baggrund under mikroskopi.
Endelig vil vi gerne påpege den biologiske mangfoldighed af forskellige musestammer. Udover genetisk ændrede stammer, også generelt accepteret vilde type stammer kan vise fysiologiske varians. Figur 4 sammenligner almindeligt anvendte sorte 6 (C57BL/6) med sorte 10 (C57BL/10ScSn) mus. Sort 6 mus viser tydeligt forbedret rulning, vedhæftning og transmigration af leucocytter sammenlignet med sorte 10 mus (statistisk analyse af envejs ANOVA med Tukey's post-hoc test; betydning blev sat til P < 0,05), selv om begge stammer ville blive omtalt som vilde type. Derfor bør korrekt genetisk baggrund overvejes, især når der anvendes transgene mus. I vores eksperimentelle indstilling, en sammenligning af sorte 6 mus og transgene mdx mus (sort 10 baggrund) ville i vid udstrækning skjule den forbedrede inflammatoriske tilstand dystrophin mangelfuld mdx mus over deres korrekte sorte 10 vilde type baggrund (Figur 4).
Figur 1: Skematisk eksperimentel opsætning af IVM på cremaster muskel. Efter anæstesi, luftrøret er kanyleret og et kateter er placeret i halspulsåren. Cremaster musklen er udsat og forberedt til intravital mikroskopi på en opretstående mikroskop ved hjælp af enten lys mikroskopi eller fluorescerende mikroskopi. Videoer er opnået til senere offline analyse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Repræsentativt venulesegment efter kapillær fra intravital mikroskopi med sekventielle rammer. Den venstre kolonne viser lette mikroskopiske billeder, for bedre visualisering fartøjet er skitseret med prikkede linjer. Venuden identificeres ved omflydende beholdere (mærket med røde stjerner) og en kardiameter på <40 μm. Højre kolonne viser en skematisk repræsentation af det tilsvarende venstre billede, der viser leukocytter med rødt. De første fire rækker viser sekventielle billeder af det samme fartøj over tid. Den nederste række angiver klæbende leukocytter. I den skematiske repræsentation er individuelle leukocytter og deres rulleafstand markeret. I offline analyse overholdelse per kvadratmillimeter, rullende flux samt rullende hastighed kan beregnes. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Rullende leukocytter kan visualiseres ved transgent ekspression af fluorescerende markører eller ved sekundær farvning med rhodamin. Repræsentative mikroskopiske billeder af leukocytrekruttering af eGFP leukocytter og rhodamin mærket leukocytter fra n = 3 dyr hver. Rullende neutrofiler, der udtrykker eGFP under lyspromotor en lys-eGFP-transgene mus, kan påvises direkte ved immunfluorescerende mikroskopi (venstre kolonne). Leukocytter uden fluorescerende beslutningstagere kan farves ved intravenøs eller intraperitoneal injektion af rhodamin (højre kolonne). Især er rhodamine ikke udelukkende taget op af neutrofiler, hvilket giver væsentligmere baggrund. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Sammenligning af leukocyt rekruttering i forskellige transgene og vilde type mus stammer. (A) Rolling flux fraktion, (B) vedhæftning og (C) transmigration af leucocytter sammenlignes mellem sort 6 (C57BL/6J), sort 10 (C57BL/10ScSnJ) og mdx mus (C57BL/10ScSn-DmdmdxJ), vist som gennemsnit + SEM. Black 6 mus viser øget leukocyt rekruttering sammenlignet med sorte 10 mus. På samme måde har mdx mus større rekruttering sammenlignet med sort 10, men ikke sammenlignet med sorte 6 vilde type mus. Disse data viser, hvor vigtigt det er at tildele korrekte genetiske kontroller. Data fra mindst n = 3 dyr pr. gruppe. Statistisk analyse ved envejs ANOVA med Tukey's post-hoc analyse. Betydningen blev sat til P < 0,05. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Mus stamme | Nej. af mus | Nej. af venuler | Fartøjets diameter | Midterlinjehastighed | Sats for vægforskydning | Systemisk WBC |
| N | N | Μm | μm/s | s-1 | /μl | |
| Mdx | 3 | 12 | 28 ± 4 | 1150 ± 50 | 1010 ± 100 | 5200 ± 300 |
| lys-eGFP | 3 | 15 | 27 ± 2 | 2220 ± 90 | 2030 ± 90 | 5800 ± 100 |
| P | 0.83 | 0.0005 | 0.0016 | 0.13 |
Tabel 1: Relevante hæmodynamiske og mikrovaskulære parametre fra to forskellige transgene muselinjer. Fartøjsdiameter, centerlinjehastighed, vægforskydningshastighed og systemiske WBCs vises for mdx-mus, der mangler dystrophin- og lys-eGFP-mus. I dette eksempel viser mdx-mus (C57BL/10J, sort 10 baggrund) og lys-eGFP-mus (C57BL/6J, sort 6 baggrund) statistisk forskellige centerlinjehastighed og vægforskydningshastighed og bør ikke sammenlignes ved hjælp af IVM. Eksemplariske data fra mindst n = 3 dyr pr. gruppe præsenteres som gennemsnitlig ± SEM. Statistisk analyse ved ikke-parret t-test med Welchs korrektion. Betydningen blev sat til P < 0,05.
Supplerende Video 1: Mikroskopisk effekt af utilstrækkelig fjernelse af bindevæv på cremaster muskel. Klik her for at se denne video (Højreklik for at downloade).
Supplerende Video 2: Ændret blodgennemstrømning med enten hypervolæmi eller hypotension. Klik her for at se denne video (Højreklik for at downloade).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
IVM som metode er blevet udbredt til at studere forskellige celletyper i forskellige organer og er blevet udførligt beskrevet og drøftet19. Hovedformålet med denne undersøgelse er at give en effektiv tilgang til at oprette og udføre IVM i cremaster muskel. Øve metoden vil producere pålidelige og reproducerbare resultater. Således planlægning og standardisering er vigtige faktorer for at mestre teknikken. Frem for alt er teknikken meget afhængig af hæmodynamiske og mikrovaskulære parametre, som skal overvåges nøje og kontrolleres for. Som sådan vil forskellige hæmodynamik mellem grupper give vildledende resultater.
På trods af sin rolle i at studere fysiologiske og patologiske tilstande, IVM alene kan ikke fuldt optrævle individuelle bidrag af specifikke celletyper til leukocyt rekruttering i inflammation. Med dette kan andre supplerende metoder kombineres med IVM. For eksempel, ex vivo metoder som flow kammer eksperimenter kan afgrænse mellem virkningerne af endotelet eller leukocyte. Også flow kamre er fremragende opsætninger til at oversætte gnaver resultater til menneskelige leukocytter, for eksempel hos nyfødte spædbørn20. Endvidere bør in vitro-metoder som FACS eller immunhistokemi supplere IVM-eksperimenter. Hver metode kan tilføje specifikke oplysninger fra et kontrolleret miljø med ringe konfunderende faktorer.
Den traumatiske cremaster præparat præsenteres her ligner fysiologiske baseline betingelser for inflammation så tæt som muligt. Men den obligatoriske kirurgiske præparat i sig selv er en stimulus af betændelse, som skal overvejes til fortolkning. Farmakologisk TNF stimulation af cremaster væv kan give en ekstra tilstand til at øge inflammatorisk rekruttering ud over den traumatiske kirurgiske stimulus16. Yderligere, forskellige musestammer kan vise ændrede reaktioner mod standardiserede stimuli. Vi har vist, at selv almindelige vilde type stammer kan udvise forskellige baseline tilstande af leukocyte rekruttering. Dette viser vigtigheden af at tildele korrekte genetiske kontroller og etablere basisdata for nye eksperimentelle grupper, når de planlægger eksperimenter. Som transgene stammer er meget rigelige i disse dage, er det sandsynligt, at selv samme stammer kan variere over tid afhængigt af avl.
Samlet set er IVM et effektivt værktøj til at overvåge leukocyt rekruttering i den biologiske sammenhæng med musen og bør ledsages af ex vivo og in vitro teknikker. Yderligere, cremaster IVM tillader en række forskellige tilstande, herunder specifikke celle farvning, inflammatorisk stimulation eller farmakologisk manipulation og forbehandling. Som sådan kan det tjene som en platform til at evaluere forskellige farmakologiske mediatorer og deres biologiske virkninger i prækliniske undersøgelser, især inden for inflammation og mere specifikt i inflammatoriske muskotopatier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af det tyske forbundsministerium for uddannelse og forskning (BMBF) 01GL1746E som en del af PRIMAL Consortium. Forfatterne anerkender Britta Heckmann og Silvia Pezer for dygtig teknisk bistand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Ketanest S | Pfizer Pharma GmbH | PZN: 08509909 | anesthesia. Generic / IUPAC Name: ketamine |
| Xylazine | CP-Pharma GmbH | Article-nr.: 1205 | anesthesia. Generic / IUPAC Name: xylazine (as hidrochloride) |
| Saline Solution | B. Braun Melsungen | PZN 02737756 | surgical preparation. Generic / IUPAC Name: sodium chloride |
| Syringe needle Omnican F | B. Braun Melsungen | REF 9161502 | surgical preparation |
| Suture 6/0 USP | Resorba | REF 4217 | surgical preparation |
| Polyethylene tube #10 | BD GmbH | Supplier No. 427401 | surgical preparation |
| Polyethylene tube #90 | BD GmbH | Supplier No. 427421 | surgical preparation |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | CAS Number 989-38-8 | leukocyte staining. Generic / IUPAC Name: ethyl 2-[3-(ethylamino)-6-ethylimino-2,7-dimethylxanthen-9-yl]benzoate |
| Setup Equipment | |||
| Upright microscope | Olympus | BX51W1 | microscopy |
| 40-fold objective | Zeiss | Achroplan 40 × /0.80 W | microscopy |
| ImSpector software | Lavision Biotec GmbH | ver. 4.0.469 | software |
| ImageJ | National Institute of Health, USA | ver. 1.51j8 | software |
References
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
- Zanardo, R. C. O., et al. A down-regulatable E-selectin ligand is functionally important for PSGL-1-independent leukocyte-endothelial cell interactions. Blood. 104 (12), 3766-3773 (2004).
- Woodfin, A., et al. ICAM-1-expressing neutrophils exhibit enhanced effector functions in murine models of endotoxemia. Blood. 127 (7), 898-907 (2016).
- Frommhold, D., et al. RAGE and ICAM-1 cooperate in mediating leukocyte recruitment during acute inflammation in vivo. Blood. 116 (5), 841-849 (2010).
- Braach, N., et al. RAGE controls activation and anti-inflammatory signalling of protein C. PloS One. 9 (2), 89422 (2014).
- Frommhold, D., et al. RAGE and ICAM-1 differentially control leukocyte recruitment during acute inflammation in a stimulus-dependent manner. BMC Immunology. 12 (1), 56 (2011).
- Braach, N., et al. Anti-inflammatory functions of protein C require RAGE and ICAM-1 in a stimulus-dependent manner. Mediators of Inflammation. 2014, 743678 (2014).
- Girbl, T., et al. Distinct Compartmentalization of the Chemokines CXCL1 and CXCL2 and the Atypical Receptor ACKR1 Determine Discrete Stages of Neutrophil Diapedesis. Immunity. 49 (6), 1062-1076 (2018).
- Smith, M. L., Olson, T. S., Ley, K. CXCR2- and E-selectin-induced neutrophil arrest during inflammation in vivo. The Journal of Experimental Medicine. 200 (7), 935-939 (2004).
- Emre, Y., Jemelin, S., Imhof, B. A. Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time. Journal of Visualized Experiments. (105), (2015).
- Eriksson, E., Boykin, J. V., Pittman, R. N. Method for in vivo microscopy of the cutaneous microcirculation of the hairless mouse ear. Microvascular Research. 19 (3), 374-379 (1980).
- von Andrian, U. H. Intravital microscopy of the peripheral lymph node microcirculation in mice. Microcirculation. 3 (3), New York, N.Y. 287-300 (1996).
- Hudalla, H., et al. LPS-induced maternal inflammation promotes fetal leukocyte recruitment and prenatal organ infiltration in mice. Pediatric Research. 84 (5), 757-764 (2018).
- Grant, R. T. Direct observation ok skeletal muscle blood vessels (rat cremaster). The Journal of Physiology. 172 (1), 123-137 (1964).
- Thiele, J. R., Goerendt, K., Stark, G. B., Eisenhardt, S. U. Real-time digital imaging of leukocyte-endothelial interaction in ischemia-reperfusion injury (IRI) of the rat cremaster muscle. Journal of Visualized Experiments. (66), e3973 (2012).
- Kranig, S. A., et al. Dystrophin deficiency promotes leukocyte recruitment in mdx mice. Pediatric Research. 11, 4457 (2019).
- Bagher, P., Segal, S. S. The mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation. Journal of Visualized Experiments. (52), e2874 (2011).
- Reichenbach, Z. W., Li, H., Gaughan, J. P., Elliott, M., Tuma, R. IV and IP administration of rhodamine in visualization of WBC-BBB interactions in cerebral vessels. Microscopy Research and Technique. 78 (10), 894-899 (2015).
- Secklehner, J., Lo Celso, C., Carlin, L. M. Intravital microscopy in historic and contemporary immunology. Immunology and Cell Biology. 95 (6), 506-513 (2017).
- Nussbaum, C., et al. Neutrophil and endothelial adhesive function during human fetal ontogeny. Journal of Leukocyte Biology. 93 (2), 175-184 (2013).
