Summary
Här visar vi hur man utför intravital mikroskopi på post-kapillär venules av musen cremaster muskel. Vanligen tillämpas på olika modeller av inflammation och sepsis, särskilt de som induceras av kemokines och cytokiner, vi belysa dess relevans i studien av muscolopathies med överdrivna muskulös leukocyte infiltration.
Abstract
Intravital mikroskopi (IVM) används ofta för att övervaka fysiologiska och patofysiologiska processer inom leukocyte rekrytering kaskad in vivo. Det nuvarande protokollet representerar en praktisk och reproducerbar metod för att visualisera leukocyte endotel interaktion leder till leukocyte rekrytering i skelettmuskulaturen härrör vävnad inom intakt organismen av musen. Modellen är tillämplig på alla forskningsområden som fokuserar på granulocyteaktivering och deras roll i sjukdom.
Vi tillhandahåller ett steg för steg protokoll för att guida genom metoden och för att belysa potentiella fallgropar och tekniska svårigheter. Protokollet omfattar följande aspekter: experimentella inställningar och nödvändigt material, anestesi av musen, dissekering av cremaster muskel samt trakeal och halspulsådern cannulation, IVM inspelningar och offline analys. Dataformat som vidhäftande leukocyter, rullande flöde (RF) och rullande fluxfraktion (RFF) förklaras i detalj och lämpliga tillämpningar diskuteras. Representativa resultat från dystrofiin bristfälliga mdx möss finns i resultatavsnittet.
IVM är ett kraftfullt verktyg för att bedöma leukocyte rekrytering i en in vivo inställning; Men delineating till exempel endotel och leukocyte funktion kan kräva en kombination med ex vivo inställningar som flöde kammare experiment. Dessutom kan den genetiska bakgrunden hos djur av intresse i hög grad påverka grundläggande rekrytering, vilket kräver individuell finjustering av det protokoll som tillhandahålls. Trots sina begränsningar kan IVM fungera som en plattform för att lätt översätta in vitro-fynd till en levande ryggradsdjur organism.
Introduction
Intravital mikroskopi (IVM) är ett vanligt tillämpat verktyg inom leukocytebiologi. Leukocyte rekrytering följer en kaskad av väldefinierade händelser som initierats av leukocyte fånga, rullande och vidhäftning till endotelväggen, och slutligen transmigration och extravasation av leukocyter till den faktiska platsen för inflammation1. Varje steg medieras och kontrolleras av olika chemokines (t.ex. IL-8/CXCL8), receptorer (t.ex.2,3 Samspelet mellan olika regulatoriska webbplatser, kontrollerande faktorer och medlare av leukocyt rekrytering kaskad som receptor av avancerade glycation slutprodukter (RAGE), intercellulära vidhäftning molekyl 1 (ICAM-1), C-X-C motiv ligand (CXCL)1/2 och deras receptor CXCR2 upptäcktes med IVM4,5,6,77,8,9.
Metoden för IVM har beskrivits för många olika organ och vävnader såsom tarmen10, hud11, lymfkörtlar12, embryonala äggula säck13 och andra. Den mest studerade metoden för IVM är dock cremaster-modellen, som först beskrevs hos råttor14. Även om den fortfarande används hos råttor15,används metoden numera huvudsakligen hos möss på grund av det höga förekomst av olika transgena linjer. Vår grupp har nyligen belyst den potentiella roll cremaster IVM inom inflammatoriska muscolopathies som Duchennes muskeldystrofi (DMD) studera dystrophin-brist mdx möss16. På grund av sin tunna sammanvävd och lättillgänglig fibersammansättning representerar cremastermuskeln den idealiska kandidatmuskeln som ska studeras som ett helt fäste med hjälp av ljus- eller fluorescerande mikroskopi. Leukocyte rekrytering och extravasation sker huvudsakligen i post-kapillär venules, som lätt kan identifieras på en kontinuerlig muskulös lager i cremaster muskeln.
Fördelen med in vivo-avbildning jämfört med andra in vitro-analyser är dess biologiska sammanhang i en levande organism. Samtidigt kan delineating cellspecifika bidrag till förändrad leukocytrekrytering kräva ytterligare in vitro-modeller som flödeskammare eller endotelanalyser. Kombinationen av flera metoder kommer att ge mest övertygande data. Forskare bör vara medvetna om begränsningarna i cremaster modellen som någon kirurgisk manipulation kommer att leda till ökad leukocyte människohandel och rekrytering. Därför är baslinjerekrytering svårt att uppskatta med denna metod. Trots sin breda tillämpning kan IVM av cremaster vara utmanande och en ny inställning kan ta tid och resurser att upprätta. Vi tillhandahåller nu ett enkelt protokoll som kommer att bidra till att undvika några av de vanligaste misstagen i IVM. Dessutom kommer begränsningar att diskuteras och kostnadsfria metoder kommer att belysas där så är tillämpligt.
IVM av cremaster representerar ett idealiskt tillvägagångssätt som skall genomföras inom området inflammatoriska och infektiösa studier. Mer specifikt kan cremaster-modellen vara av stort intresse för forskare som studerar skelettmuskelbiologi i samband med inflammatorisk sjukdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djur inhystes under kontrollerat, och specifik pathogen-fritt villkorar på IBFEN (Interfakultäre Biomedizinische Forschungseinrichtung), Heidelberg. Alla förfaranden som beskrivs här godkändes av den lokala IRB och Regierungspraesidium Karlsruhe, Baden-Wuerttemberg, Tyskland.
1. Anestesi administration
- Bedöva musen genom intraperitoneal (i.p.) bolus injektion av 125 mg/kg ketamin och 12,5 mg/kg xylazine.
- Placera och fäst musen i en dorsal recumbent position på en värmedyna för att upprätthålla kroppstemperaturen på musen (36,5-38 °C). Använd en icke-absorberbar steril sutur (6/0) för att linda en enkel slinga runt framtänderna och tejpa ihop södnad till värmedynan. Denna fixering syftar till att hålla munnen öppen för att undvika störningar i andningen.
- Kontrollera musen för lämpligt djup av anestesi genom interdigital tå nypa (tillbakadragande bör inte ses).
- När tillräcklig anestesi har uppnåtts fortsätt till kirurgisk förberedelse. Upprepad bekräfta anestesi längs det pågående experimentet var 30 min. Åter administrera läkemedel som beskrivs ovan om det behövs.
- Ekvilibrate fysiologisk saltlösning (PSS, sammansättning: 132 mmol/L NaCl, 4,7 mmol/L KCl, 1,2 mmol/L MgS04, 2,0 mmol/L CaCl2, 18 mmol/L NaHCO3) med 5% CO2/95% N2 i 15 minuter. Bubbla kontinuerligt PSS med 5% CO2/95% N2 under hela experimentet och hålla på 37 °C.
2. Kirurgisk beredning av luftstrupen och halspulsådern (tillval)
- Dissekera huden från nackområdet genom att försiktigt dra huden med pincett i mittlinjen. Använd sax för att applicera ett cirkulärt snitt på 1-2 cm i diameter för att ge tillräckligt med utrymme för kirurgisk beredning.
- Dissekera försiktigt den omgivande muskeln, fett och bindväv med hjälp av pincett.
- Gör ett tvärgående snitt (~ 1,3 mm) i luftstrupen med liten kirurgisk sax och för in ett polyetenrör (I.D x O.D. 0,034" x 0,050") inuti trakeans caudaländel för att säkra de övre luftvägarna.
- Fäst röret i luftstrupen med en enda rund knut sutur (6/0 USP).
- Lokalisera halspulsådern längs höger sida av luftstrupen och dissekera den omgivande vävnaden från halspulsådern väggen. Alternativt kan halspulsådern eller även svansvenen användas för i.v. access. Försök att undvika skador på vagalnerven, eftersom den ligger nära.
- Passera två bitar av sutur (6/0) under halspulsådern. Placera den första kraniala suturen proximala, nära bifurkation av halspulsådern och binda den permanent. Den andra suturen kommer att placeras ca 5-8 mm distala från den första och senare användas för att säkra röret i halspulsådern. Knyt den inte än.
- Förbered ett polyetenrör (I.D x O.D. 0.011" x 0.024") med en längd av 30 cm genom att böja änddelen till en 1 ml sprutanål fylld med saltlösning (0,9% NaCl). Rigorös spolning är viktigt för att förhindra luftemboliisering under beredning.
- Använd en 7 mm kärlklämma för att klämma fast halspulsådern distally av den andra suturen.
- Utför ett litet tvärgående snitt (~0,5 mm) i halspulsådern och för in det sterila polyetenröret. Säkra röret i artären med hjälp av den andra suturen som förberetts tidigare.
- Ta bort kärlklämman och applicera försiktigt lite spänning på sprutan som är ansluten till polyetenröret. Denna halspulsådernkateter kan nu användas för att administrera läkemedel eller ta blodprov om det behövs, även övervakning av blodtryck eller puls är möjlig med respektive enheter.
3. Kirurgisk beredning av cremaster muskeln
- Överför musen på värmedynan (tillsammans med värmedynan) till den skräddarsydda plastramen som håller scenen för senare mikroskopi. Rikta musen med pungen mot mikroskopstadiet.
- Omvärderar anestesdjupet innan du fortsätter; administrera en halv dos av anestesi under behov.
- Lokalisera pungen, hålla den på sin mest distala del med hjälp av pincett, dra den försiktigt och skär av en cirkulär del av pungen hud med ca 5 mm i diameter. Se till att inte skada de underliggande strukturerna såsom cremaster muskeln. Se till att hålla den öppna vävnaden väl hydrerad med saltlösning.
- Dissekera lös bindväv med hjälp av två pincett och lokalisera båda testikel.
- Håll en testis distally och försiktigt börja dra ut den, ta bort omgivande bindväv steg för steg.
- När testiklet är exteriör, stift sin distala änden till gummiringen som omger scenen. Vid exteriör, återfukta vävnaden med saltlösning under hela processen.
- Kritiskt steg: Ta försiktigt bort bindväv utan att skada den underliggande cremaster muskeln. Överskott av bindväv kan hindra synen i senare mikroskopi och kan ge suddiga bilder.
- Pin den distala delen av testikel ner och öppna cremaster muskeln med en liten tvärgående snitt (ca 1 mm), följt av längsgående snitt från den mycket distala till proximala änden. Som ett resultat cremaster muskeln bör öppna sfäriskt. Makroskopiskt synligt kärl bör inte avhuggas, eftersom detta kan påverka hemodynamiken.
- Sprid försiktigt muskeln över glasscenen och fäst den på gummiringen. Se till att inte röra eller skada den centrala regionen, eftersom mikroskopi kommer att utföras här.
Varning: Överskottsstretch kan hindra blodflödet. - Pin resterande test är åt sidan för att ge tillgång till regionen av intresse. Se till att fukta med PSS upprepade gånger för att förhindra torkning. Den monterade muskeln är nu klar för mikroskopi.
4. Intravital mikroskopi
- Placera den monterade cremaster muskeln i upprätt mikroskop och utföra mikroskop med hjälp av en 40x mål.
- Hämta data och exportera med hög dataflödesavbildningsspektrografi.
- Utför inspelningar under kontinuerlig överfusion med förvärmd (35-37 °C) PSS17. Applicera superfusion av en liten slang som har tejpats till det upprätt målet för mikroskopet för att möjliggöra kontinuerlig droppande av PSS tillsammans med målet ner på muskelvävnaden.
- Identifiera postkapillär venules (sammanflödet av två mindre kärl) och mät mikrocirkulationen på venules med en diameter på 20-40 μm.
- Spela in högupplösta bilder av mikrocirkulationen från cremastermuskeln i en tidsintervall på 30 s. Eftersom det kan finnas liten sammandragning och avslappning av muskelvävnaden under inspelning, se till att kontinuerligt justera fokus. Generellt tenderar musen att uppvisa stabil cirkulation i ca 2 timmar. Det är möjligt att förvärva flera inspelningar av olika fartyg från olika regioner. En eller båda testiken kan användas därefter.
OBS: Eftersom detta är en modell av inflammation, vanliga sätt att induktion är: systemisk tillämpning eller Nlokal scrotal injektion av pro inflammatoriska medlare samt superfusion med till exempel N-Formylmethionyl-leucyl-fenylalanin (fMLP). Lokal TNF-α-stimulering används ofta för att utlösa leukocyte rekrytering; LPS-inducerad endotoxemia är en modell av SIRS allvarliga systemisk inflammation.
5. Leukocyte visualisering
OBS: Vidhäftande och rullande leukocyter kan lätt ses utan ytterligare visualisering. För att bestämma mittlinjens hastighet för fritt rörliga leukocyter, utför differentialfärgning.
- Om eGFP märkta möss används, direkt analysera dem genom fluorescensmikroskopi.
- Använd rodaminfärgning för icke-eGFP-märkta musstammar.
- Administrera rodamin 6G vid 0,2 mg/kg kroppsvikt. Upprepade doser kan krävas för att uppnå tillräcklig färgning intensitet. Se till att hålla små volymer, eftersom större volymer kan påverka hemodynamic parametrar.
- För omedelbar färgning av leukocyter, administrera fläcken via halspulsådern. Om halspulsåderns dissekering inte har utförts, kan tillräcklig färgning uppnås genom i.p. applicering med samma dos18. Som ett alternativ till halspulsådernkateterisering kan någon annan venkateterisering utföras.
OBS: Tänk på att rhodamin färgning, till skillnad från eGFP märkning, visar tidsmultnet av fluorescens intensitet samt en övergripande färgning högst ca 80% av leukocyter vid högre koncentrationer. - Visualisera fritt rörliga rhodamin färgade leukocyter genom fluorescensmikroskopi.
6. Slutet av experimentet
Den totala beräknade tiden för att utföra detta protokoll bör vara 90 – 150 minuter.
- Avsluta experimentet med dödshjälp genom cervikal störning.
- För ytterligare analyser, såsom transmigration, fixa cremaster muskeln i PFA medan fortfarande sträckte sig på scenen och färgas för histologi som krävs.
7. Offlineanalys
- Analysera följande parametrar som enkla räknas under videouppspelning.
- Beräkna valsflödet [tal/min]: antal rullande celler som passerar en imaginär linje/min
- Beräkna vidhäftning [tal/mm2]: antal celler som är självhäftande mot kärlväggen inom synfältet ≥ 30 s/kärlyta [mm2].
- Mät följande hemodynamic och microvascular parametrar mäts med ImageJ.
- Beräkna kärldiametern [μm] som innerväggsdiameter.
- Beräkna fartygets längd [μm] som fartygets mittlinjelängd.
- Beräkna mittlinjehastighet
som erhålls från bildruta-till-ram-videoanalys av fritt rörliga leukocyter i mittlinjen.
- Använd följande ekvationer som en uppskattning.
- Beräkna kärlytan i [mm2]: kärllängd [μm] x kärldiameter [μm] x π x 10-6.
- Beräkna väggskjuxhastighet:
4,9 x (8 x mittlinjehastighet x 0,625/kärldiameter [μm]). - Beräkna medelvärdet för blodflödet hastighet: center linje hastighet x 0,625.
- Beräkna totalt
leukocytspänss : 
systemiskt leukocytantal x (genomsnittlig blodflödeshastighet x 60/1000) x π x 
. - Beräkna rullningsflödesfraktion [%]: rullande flöde/totalt leukocytflöde x 100.
som erhålls från bildruta-till-ram-videoanalys av fritt rörliga leukocyter i mittlinjen.
4,9 x (8 
leukocytspänss : 
systemiskt leukocytantal x (genomsnittlig blodflödeshastighet 
.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
IVM enligt det angivna protokollet kommer att ge unika insikter i kaskaden av leukocyte rekrytering i skelettmuskulaturen. Resultatavsnittet kommer att fokusera på typiska resultat som erhållits av IVM och belysa potentiella problem som kan uppstå.
Den experimentella installationen för intravitalmikroskopi beskrivs i figur 1. Beredning av cremaster muskeln och avlägsnande av bindväv är avgörande för att få fokuserade mikroskopiska bilder med en enhetlig yta. Överskott bindväv leder så småningom till suddiga mikroskopiska bilder (Supplemental Video 1) när du utför IVM. Figur 2 visar representativa mikroskopiska bilder som kan erhållas med hjälp av IVM. För det första identifieras postkapillär venule, som bör vara mellan 20-40 μm i diameter, genom sammanflödet av två mindre fartyg. Endast vidhäftande och rullande leukocyter kan visualiseras, cirkulerande leukocyter får endast spåras i slow motion-repris av inspelade videor. Antalet vidhäftande leukocyter definieras som stationära leukocyter under en tid av 30 sekunder och uttryckt per mm2 av kärlytan (figur 2). Antalet rullande leukocyter som passerar ett tidigare definierat tvärsnitt av fartyget räknas. rullande hastigheter kan erhållas i offlineanalys. Valsningen kan uttryckas som rullningsflöde (RF = antal rullande celler över en fördefinierad linje/min) eller som rullningsflödesfraktion (RFF i % = RF/total leukocyter som passerar kärlet). RF är starkt beroende av antalet cirkulerande celler, medan RFF påverkas mindre av förändringar i antalet vita blodkroppar (WBCs). Observera att i många fall leukocyte anslutning och rullande är omvänt relaterade; ett stort antal vidhäftande leukocyter kan minska poolen av fritt cirkulerande celler och därmed dämpa leukocyte rullande.
Tekniska utmaningar och potentiella fallgropar
Cremaster muskeln omsluter testikel och monterar en sfärisk struktur. För att montera muskeln på inspelningsstadiet krävs ett längsgående snitt för att öppna sfären. Detta kan påverka den totala mikrovaskulaturen eftersom små kärl kan vara avskurna. För att undvika partiskhet för att förändra blodflödet, är det lämpligt att välja det centrala området för omordning. Detta område bör varken beröras eller manipuleras. Dessutom kan mikrokautery förhindra blödning och förändringar i mikrovaskulär hemodynamik. Blodflödet av omgivande kapillärer ger i allmänhet en värdefull ledtråd om cirkulationen påverkas på grund av beredning inom intresseområdet. I allmänhet tenderar mer proximala kärl (mot musens kropp) att visa bättre mikrocirkulation, men bildtagning kan kompliceras av ökad rörelse och störningar som uppstår till följd av att djuret andas.
För att förhindra att cremaster muskeln torkar ut under mikroskopisk inspelning, permanent superfusion av vävnaden är framstående. Otillräcklig eller avbruten fuktning kommer att resultera i torkning av vävnaden och fel på försöket.
Pinning av cremaster vävnad är nödvändigt att hålla den sträckt och på plats. För att platta till den tvärstrimmiga muskeln krävs mild sträckning. För lite stretch resulterar i ojämn vävnad, vilket komplicerar mikroskopi, överdriven stretching kommer att begränsa blodflödet och skada vävnaden. Återigen kapillär blodflödet ger en tillförlitlig status av den totala cirkulationstillståndet i vävnaden. Erfarenhet och praxis krävs för att bestämma graden av stretch vid montering av vävnaden.
Långa förberedelsetider kommer att påverka organismens övergripande inflammatoriska tillstånd och biasdata. Se därför till att fokusera på frågan om intresse samtidigt utforma experimentet och hålla förberedelsetider så kort som behövs. Om ingen läkemedelsadministration, övervaka eller blodprov krävs en singular beredning av cremaster vävnad kan vara tillräckligt.
I de flesta inställningar kommer olika försöksgrupper att jämföras med vilda djur. Det är av central betydelse att se till att hemodynamic och mikrovaskulära parametrar är likartade mellan experimentella grupper (tabell 1). En mängd parametrar kan påverka leukocyte rekrytering in vivo, inklusive hjärtminutvolym, kärldiameter, mittlinje hastighet, vägg skjuvfrekvens och antalet cirkulerande leukocyter. Tabell 1 visar data från två olika transgena muslinjer, dystrofiens bristfällig mdxmus och lys-eGFP-musen (som uttrycker eGFP under lys-promotorn i neutrofiler och makrofager). Medan parametrar som kärldiametern kan styras av prövaren, centrumhastigheten och skjuxhastigheten beror på hemodynamiken hos den enskilda försöksgruppen eller musstammen. Det är tydligt att den mittlinjehastighet och väggskjuvningshastigheten skiljer sig avsevärt mellan mdx- och lys-eGFP-möss (tabell 1) vilket gör meningsfull jämförelse av IVM-data omöjlig (statistisk analys genom t-test med Welchs korrigering, signifikansen sattes till P < 0,05). Den centerline hastigheten påverkas av hjärtminutvolym, perifer vaskulär resistens och intravasal volym. Till exempel, en stor volym av rhodamin eller något annat experimentellt ämne som ges via halspulsådern kateter ökar post kapillär mittlinje hastighet och hämmar leukocyte fånga och rullande (Supplemental Video 2). Tvärtom, hjärtsvikt, djup anestesi eller hypotermi kan minska post-kapillär flöde. Innan man närmar sig offlineanalys av IVM-data bör krav på datakvalitet (t.ex. hemodynamiska parametrar inom fysiologiska områden) definieras för att dra meningsfulla slutsatser och minska bias.
För att bestämma mittlinjen hastighet, fritt cirkulerande leukocyter måste visualiseras. Antingen kan fluorescerande leukocyter (som hos lys-eGFP-möss) användas eller leukocyter färgas med fluorescerande reagenser som rhodamin (figur 3). Rhodamin kan appliceras via halspulsådernkatetern eller som en i.p. injektion. Eftersom rhodamin gradvis tas upp av andra celltyper samt, en titrering av dosering och tid är viktigt. Överdriven dosering och långa intervall kommer att ge betydande bakgrund under mikroskopi.
Slutligen vill vi påpeka biologisk mångfald av olika musstammar. Förutom genetiskt modifierade stammar, även allmänt accepterade vilda typ stammar kan visa fysiologiska varians. Figur 4 jämför vanliga svarta 6 (C57BL/6) med svarta 10 (C57BL/10ScSn) möss. Svarta 6 möss visar tydligt förbättrad rullande, vidhäftning och transmigration av leukocyter jämfört med svarta 10 möss (statistisk analys av enkelriktad ANOVA med Tukeys post-hoc-test; signifikansen sattes till P < 0,05), även om båda stammarna skulle kallas vildtyp. Därför bör korrekt genetisk bakgrund övervägas, särskilt när man använder transgena möss. I vår experimentella miljö skulle en jämförelse av svarta 6 möss och transgena mdx möss (svart 10 bakgrund) till stor del dölja den förbättrade inflammatoriska tillstånd dystrophin bristfällig mdx möss över deras korrekta svarta 10 vild typ bakgrund (Figur 4).
Figur 1: Schematisk experimentell inställning av IVM på cremaster muskel. Efter anestesi kanineras luftstrupen och en kateter placeras i halspulsådern. Cremaster muskeln exponeras och förbereds för intravital mikroskopi på en upprätt mikroskop med antingen ljus mikroskop eller fluorescerande mikroskopi. Videor erhålls för senare offlineanalys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Representativt segment efter kapillär venule från intravitalmikroskopi med sekventiella ramar. Den vänstra kolumnen visar ljus mikroskopiska bilder, för bättre visualisering fartyget beskrivs med prickade linjer. Venule identifieras med konfluentkärl (märkta med röda asterisker) och en kärldiameter på <40 μm. Den högra kolumnen visar en schematisk representation av motsvarande vänstra bild, som visar leukocyter i rött. De första fyra raderna visar sekventiella bilder av samma fartyg över tiden. Den nedre raden indikerar vidhäftande leukocyter. I den schematiska representationen markeras individuella leukocyter och deras rullande avstånd. Vid offlineanalys adherence per kvadratmillimeter kan rullande flöde samt rullande hastighet beräknas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Rullande leukocyter kan visualiseras genom transgent uttryck av fluorescerande markörer eller genom sekundär färgning med rhodamin. Representativa mikroskopiska bilder av leukocyte rekrytering av eGFP leukocyter och rhodamin märkt leukocyter från n = 3 djur vardera. Rullande neutrofiler som uttrycker eGFP under lys-promotorn från lys-eGFP-transgena möss kan direkt detekteras genom immunofluorescerande mikroskopi (vänster kolumn). Leukocyter utan fluorescerande beslutsfattare kan färgas av intravenös eller intraperitoneal injektion av rhodamin (höger kolumn). Särskilt är rhodamin inte uteslutande tas upp av neutrofiler, vilket ger betydligt mer bakgrund. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Jämförelse av leukocyterekrytering i olika stammar av transgen och vild typ av mus. A)Rullningsflödesfraktion.( B)vidhäftning och (C) transmigration av leukocyter jämförs mellan svart 6 (C57BL/6J), svart 10 (C57BL/10ScSnJ) och mdx möss (C57BL/10ScSn-DmdmdxJ), visas som medelvärdet + SEM. Svarta 6 möss visar förbättrad leukocyte rekrytering jämfört med svarta 10 möss. På samma sätt har mdx-möss större rekrytering jämfört med svarta 10, men inte jämfört med svarta 6 vilda möss. Dessa data visar hur viktigt det är att tilldela korrekta genetiska kontroller. Data från minst n = 3 djur per grupp. Statistisk analys genom enkelriktad ANOVA med Tukeys post-hoc-analys. Betydelse sattes till P < 0,05. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Mus stam | Nej. av möss | Nej. av venules | Fartygets diameter | Hastighet mittlinje | Vägg skjurhastighet | Systemisk WBC |
| N | N | Μm | μm/s | s-1 | /μl | |
| Mdx | 3 | 12 | 28 ± 4 | 1150 ± 50 | 1010 ± 100 | 5200 ± 300 |
| lys-eGFP | 3 | 15 | 27 ± 2 | 2220 ± 90 | 2030 ± 90 | 5800 ± 100 |
| P | 0.83 | 0.0005 | 0.0016 | 0.13 |
Tabell 1: Relevanta hemodynamic och microvascular parametrar från två olika transgena muslinjer. Kärldiameter, mittlinjehastighet, väggskjutfrekvens och systemiska WBC visas för mdx-möss som saknar dystrofi och lys-eGFP-möss. I det här exemplet visar mdx-möss (C57BL/10J, svart 10 bakgrund) och lys-eGFP-möss (C57BL/6J, svart 6 bakgrund) statistiskt olika mittlinjehastighet och väggskjuvhastighet och bör inte jämföras med IVM. Föredömliga data från minst n = 3 djur per grupp presenteras som medelvärde ± SEM. Statistisk analys genom obetalt t-test med Welchs korrigering. Betydelse sattes till P < 0,05.
Kompletterande Video 1: Mikroskopisk effekt av otillräckligt avlägsnande av bindväv på cremaster muskel. Klicka här för att se den här videon (Högerklicka för att ladda ner).
Kompletterande video 2: Förändrat blodflöde genom antingen hypervolemi eller hypotoni. Klicka här för att se den här videon (Högerklicka för att ladda ner).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
IVM som metod har använts i stor utsträckning för att studera olika celltyper i olika organ och har beskrivits och diskuterats ingående19. Huvudsyftet med denna studie är att ge ett effektivt tillvägagångssätt för att inrätta och utföra IVM i cremaster muskeln. Öva metoden kommer att ge tillförlitliga och reproducerbara resultat. Planering och standardisering är därför viktiga faktorer för att behärska tekniken. Framför allt är tekniken mycket beroende av hemodynamic och mikrovaskulära parametrar, som måste övervakas och kontrolleras noggrant för. Som sådan kommer olika hemodynamik mellan grupper ger vilseledande resultat.
Trots sin roll i att studera fysiologiska och patologiska tillstånd, IVM ensam kan inte helt nysta upp enskilda bidrag av specifika celltyper till leukocyte rekrytering i inflammation. För att göra detta kan andra kompletterande metoder kombineras med IVM. Till exempel kan ex vivo metoder som flödeskammare experiment avgränsa mellan effekterna av endotel eller leukocyt. Dessutom är flödeskammare utmärkta inställningar för att översätta gnagare fynd till mänskliga leukocyter, till exempel hos nyfödda spädbarn20. Vidare bör in vitro-metoder som FACS eller immunohistochemistry komplettera IVM experiment. Varje metod kan lägga till specifik information som erhållits från en kontrollerad miljö med små störande faktorer.
Den traumatiska cremaster preparat presenteras här liknar fysiologiska baslinjen villkor för inflammation så nära som möjligt. Ändå är det obligatoriska kirurgiska preparatet i sig en stimulans av inflammation, som måste övervägas för tolkning. Farmakologisk TNF stimulering av cremaster vävnad kan ge ett ytterligare läge för att öka inflammatorisk rekrytering utöver den traumatiska kirurgiska stimulans16. Ytterligare, olika mus stammar kan visa förändrade svar mot standardiserade stimuli. Vi har visat att även vanliga vilda typ stammar kan uppvisa olika baslinje tillstånd av leukocyte rekrytering. Detta visar vikten av att tilldela korrekta genetiska kontroller och upprätta baslinjedata för nya experimentella grupper när experiment planeras. Eftersom transgena stammar är mycket rikliga i dessa dagar, är det troligt att även samma stammar kan variera över tiden beroende på avel.
Sammantaget är IVM ett kraftfullt verktyg för att övervaka leukocyterekrytering i musens biologiska sammanhang och bör åtföljas av ex vivo- och in vitro-tekniker. Vidare tillåter cremaster IVM en mängd olika lägen inklusive specifik cellfärgning, inflammatorisk stimulering eller farmakologisk manipulation och förbehandling. Som sådan kan det fungera som en plattform för att utvärdera olika farmakologiska medlare och deras biologiska effekter i prekliniska studier särskilt inom inflammation och mer specifikt i inflammatoriska muskulapatier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av det tyska federala ministeriet för utbildning och forskning (BMBF) 01GL1746E som en del av PRIMAL Consortium. Författarna erkänner Britta Heckmann och Silvia Pezer för skickligt tekniskt bistånd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Ketanest S | Pfizer Pharma GmbH | PZN: 08509909 | anesthesia. Generic / IUPAC Name: ketamine |
| Xylazine | CP-Pharma GmbH | Article-nr.: 1205 | anesthesia. Generic / IUPAC Name: xylazine (as hidrochloride) |
| Saline Solution | B. Braun Melsungen | PZN 02737756 | surgical preparation. Generic / IUPAC Name: sodium chloride |
| Syringe needle Omnican F | B. Braun Melsungen | REF 9161502 | surgical preparation |
| Suture 6/0 USP | Resorba | REF 4217 | surgical preparation |
| Polyethylene tube #10 | BD GmbH | Supplier No. 427401 | surgical preparation |
| Polyethylene tube #90 | BD GmbH | Supplier No. 427421 | surgical preparation |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | CAS Number 989-38-8 | leukocyte staining. Generic / IUPAC Name: ethyl 2-[3-(ethylamino)-6-ethylimino-2,7-dimethylxanthen-9-yl]benzoate |
| Setup Equipment | |||
| Upright microscope | Olympus | BX51W1 | microscopy |
| 40-fold objective | Zeiss | Achroplan 40 × /0.80 W | microscopy |
| ImSpector software | Lavision Biotec GmbH | ver. 4.0.469 | software |
| ImageJ | National Institute of Health, USA | ver. 1.51j8 | software |
References
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
- Zanardo, R. C. O., et al. A down-regulatable E-selectin ligand is functionally important for PSGL-1-independent leukocyte-endothelial cell interactions. Blood. 104 (12), 3766-3773 (2004).
- Woodfin, A., et al. ICAM-1-expressing neutrophils exhibit enhanced effector functions in murine models of endotoxemia. Blood. 127 (7), 898-907 (2016).
- Frommhold, D., et al. RAGE and ICAM-1 cooperate in mediating leukocyte recruitment during acute inflammation in vivo. Blood. 116 (5), 841-849 (2010).
- Braach, N., et al. RAGE controls activation and anti-inflammatory signalling of protein C. PloS One. 9 (2), 89422 (2014).
- Frommhold, D., et al. RAGE and ICAM-1 differentially control leukocyte recruitment during acute inflammation in a stimulus-dependent manner. BMC Immunology. 12 (1), 56 (2011).
- Braach, N., et al. Anti-inflammatory functions of protein C require RAGE and ICAM-1 in a stimulus-dependent manner. Mediators of Inflammation. 2014, 743678 (2014).
- Girbl, T., et al. Distinct Compartmentalization of the Chemokines CXCL1 and CXCL2 and the Atypical Receptor ACKR1 Determine Discrete Stages of Neutrophil Diapedesis. Immunity. 49 (6), 1062-1076 (2018).
- Smith, M. L., Olson, T. S., Ley, K. CXCR2- and E-selectin-induced neutrophil arrest during inflammation in vivo. The Journal of Experimental Medicine. 200 (7), 935-939 (2004).
- Emre, Y., Jemelin, S., Imhof, B. A. Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time. Journal of Visualized Experiments. (105), (2015).
- Eriksson, E., Boykin, J. V., Pittman, R. N. Method for in vivo microscopy of the cutaneous microcirculation of the hairless mouse ear. Microvascular Research. 19 (3), 374-379 (1980).
- von Andrian, U. H. Intravital microscopy of the peripheral lymph node microcirculation in mice. Microcirculation. 3 (3), New York, N.Y. 287-300 (1996).
- Hudalla, H., et al. LPS-induced maternal inflammation promotes fetal leukocyte recruitment and prenatal organ infiltration in mice. Pediatric Research. 84 (5), 757-764 (2018).
- Grant, R. T. Direct observation ok skeletal muscle blood vessels (rat cremaster). The Journal of Physiology. 172 (1), 123-137 (1964).
- Thiele, J. R., Goerendt, K., Stark, G. B., Eisenhardt, S. U. Real-time digital imaging of leukocyte-endothelial interaction in ischemia-reperfusion injury (IRI) of the rat cremaster muscle. Journal of Visualized Experiments. (66), e3973 (2012).
- Kranig, S. A., et al. Dystrophin deficiency promotes leukocyte recruitment in mdx mice. Pediatric Research. 11, 4457 (2019).
- Bagher, P., Segal, S. S. The mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation. Journal of Visualized Experiments. (52), e2874 (2011).
- Reichenbach, Z. W., Li, H., Gaughan, J. P., Elliott, M., Tuma, R. IV and IP administration of rhodamine in visualization of WBC-BBB interactions in cerebral vessels. Microscopy Research and Technique. 78 (10), 894-899 (2015).
- Secklehner, J., Lo Celso, C., Carlin, L. M. Intravital microscopy in historic and contemporary immunology. Immunology and Cell Biology. 95 (6), 506-513 (2017).
- Nussbaum, C., et al. Neutrophil and endothelial adhesive function during human fetal ontogeny. Journal of Leukocyte Biology. 93 (2), 175-184 (2013).
