Summary
Ligandlara maruz kalmanın zamanlaması gelişimsel sonuçlarını etkileyebilir. Burada kanat diskhücrelerinden Dpp adı verilen Drosophila kemik morfogenetik proteininin (BMP) nasıl görüntülenebildiğini gösteriyoruz.
Abstract
Transforming Büyüme Faktörü-beta (TGF-β) süper ailesi, çok hücreli organizmalarda erişkin yapıların erken embriyonik desenleşeme ve gelişimi için gereklidir. TGF-β süper familyası TGF-β, kemik morfogenetik protein (KBP), Aktivinler, Büyüme ve Farklılaşma Faktörleri ve Nodalları içerir. Uzun hücrelere maruz ligand miktarı etkileri için önemli olduğu bilinmektedir. Uzun menzilli konsantrasyon degradelerinin embriyonik desen kurduğu düşünülüyordu. Ancak, son zamanlarda bu ligands maruz kalma zamanlaması da onların downstream transkripsiyonel sonuçları için önemli olduğu ortaya çıkmıştır. TGF-β süper familya ligi, üretildiği hücreden serbest bırakılmadan gelişimsel bir sonucu olamaz. Yakın zamana kadar, bu ligandların hücrelerden ne zaman salınıldığını belirlemek zordu. Burada kanat primordium veya kanat diskhücrelerinden Decapentaplegic (Dpp) adlı bir Drosophila BMP salınımını ölçmek için nasıl göstereceğim. Bu yöntem diğer sistemler veya sinyal ligands için değiştirilebilir.
Introduction
Kemik Morfogenetik Proteinler (KPS) erken embriyogenez ve yetişkin yapıların desenleme için gereklidir. KİP'ler, yanıt veren hücrelerde büyüme ve hücre farklılaşması için gerekli hedef genlerin transkripsiyonunu etkileyecek şekilde üretilir ve salgılanır. Decapentaplegic (Dpp) kanat1gibi embriyonik ve yetişkin yapıların gelişimi için önemli olan BMP4 bir Drosophila homolog,2,3,4. Çeşitli gruplar yetişkin sinek kanatları desenleme Dpp rolü üzerinde duruldu çünkü 1) kanatları kolayca değerlendirilebilir tutarlı bir venasyon desenli iki şeffaf epitel levhaoluşur; 2) kanat diskleri de makul düz, larva dışında kültürlü olabilir ve görüntü ve desen farklılıkları ölçmek için basit; ve 3) kanat desen gelişimi dpp duyarlı dır ki yoldaki küçük tedirginlikler kanat venasyon deseni etkileyecektir.
Dpp kanat diski5,6,7,8ön /posterior sınırında bulunan hücrelerde üretilir. Dpp tip 1 ve tip 2 serine/ threonine kigaz reseptörleri9,10bir komplekse bağlanır. Dpp bağlanması üzerine tip 2 reseptörü, anneleri Dpp (Mad) ile fosforilasyona yol açan tip 1 reseptörü fosforilasyona, bir Smad 1/5/8 homolog. Fosforlu SMAD ek bir co-Smad acemi (Medea), hangi hedef genleri düzenleyen çekirdek girmek sağlar, bu tür çoğalma veya farklılaşma gibi downstream etkilerine yol açan4,11.
Son zamanlarda, Bates Lab kanat diskiçinde Dpp yanlış salınımı Mad fosforilasyon bir azalmaya yol açabilir göstermiştir, hedef gen ekspresyonu azalma, ve kanat desenleme kusurları12,13. Drosophila kanadıve ilişkili yapıların çeşitli iyon kanalları etkisi gelişimi14,15. Bu iyon kanalları da Dpp sürümü dahil olabilir. Morfojen salınım mekanizmasını belirlerken, serbest bırakma olaylarını görselleştirmek için bir yöntem olması önemlidir.
Dr Aurelio Teleman ve Stephen Cohen Dpp kaybı kurtarmak mümkün bir Dpp-GFP füzyon proteini oluşturdu, biyolojik olarak aktif olduğu anlamına gelir ve biyolojik olarak ilgili bir şekilde serbest bırakılır16. Burada, bu Dpp-GFP'yi kullanarak Dpp sürüm olaylarını nasıl görselleştirdiğimizi anlatıyoruz. GFP asidik veziküllerde olduğunda floresan17söndürülür gibi pH duyarlı olduğu için bu füzyon proteini özellikle yararlıdır. Bu nedenle, GFP ile etiketlenmiş bir protein daha nötr hücre dışı ortama bir vezikül serbest bırakıldığında, GFP floresans yoğunluğu artar17. Dpp-GFP'nin asidik veziküllerde olup olmadığını belirlemek için GFP'nin pH duyarlılığından yararlandık. Hücre içi kompartmanları nötralize eden amonyum klorür ilavesinden önce ve sonra Dpp-GFP ifade eden kanat disklerini görüntüledik18. Amonyum klorür ilavesinden sonra puncta floresansında önemli bir artış bulduk, bu da hücre içi Dpp-GFP'nin amonyum klorür18ilavesinden önce söndürüldünden kaynaklandı. Hücre içi Dpp-GFP'nin veziküller gibi asidik membrana bağlı bölmelerde bulunduğu ve hücre içi bölmelerin pH'ını nötralize etmek için amonyum klorür eklenmesi yle söndeğinin olmadığı sonucuna vardık18. Bu dpp-GFP canlı görüntüleme yararlı bir teknik olarak asidik bölmelerden hücre dışı ortama serbest bırakılır gibi Drosophila kanat diskinde Dpp dinamikleri görselleştirmek için yapar.
Burada, Dpp-GFP kullanarak Dpp sürüm olaylarını görselleştirmek için kullandığımız yöntemi açıklıyoruz. Dpp-GFP UAS-GAL4 sistemi19kullanılarak Drosophila kanat diskleri kendi yerli desen ifade edilebilir. Bu, Irk kanallarının Dpp salınımını18'eetkilediğini belirlemek için kullanılan yöntemdir. Bu yöntemi canlı görüntüleme z-yığınları ile doğruladık. Bir odak düzleminde elde ettiğimizde Dpp-GFP puncta'nın zaman serisinde odak düzleminde hareket diğini görmüyoruz. Biz de bir z-yığın görüntülenmiş eğer Dpp-GFP puncta hareketi görmüyorum. Bu yöntemle görülen Dpp-GFP puncta'sının hücre içi veziküllerin hareketi yerine serbest bırakma olayları olduğu sonucuna varıyoruz. Dpp-GFP canlı görüntüleme Bu yöntem potansiyel Dpp dinamikleri üzerindeki etkileri için Dpp sürümü diğer putatif değiştiriciler test etmek için kullanılabilir veya diğer ligands dinamikleri bakmak için değiştirilebilir
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Diseksiyon için Larva Oluşturmak için Yumurta Toplama
- Çapraz 30-40 bakire dişi Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu 10-15 erkek Sp/CyO-GFP uçar; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu.
NOT: Dpp-GAL4 ve UAS-Dpp-GFP içeren iki genotip, dengeleyicilerde larva evresinde uygun singenin seçilmesine olanak tanıyan larva belirteçleri olduğu sürece kullanılabilir. - Yumurta toplamak için, çapraz sinekleri taze bir yiyecek şişesine çevirin ve şişeden çıkarmadan önce 3-4 saat yumurtlamalarına izin verin. Yumurta yumurtlama teşvik etmek için, su küçük bir miktar ile karışık tozmaya yapılmış maya ezmesi küçük bir miktar sinekler şişe tanıtıldı önce gıda üstüne eklenebilir. Çapraz sinekler aynı seti saklanabilir ve yumurta koleksiyonları 7 güne kadar kullanılabilir.
NOT: Herhangi bir standart Drosophila mısır unu gıda tarifi kabul edilebilir olmalıdır. Burada kullanılan hazegh ve Reis20tarafından açıklanan gıda tarifi . - Larvalar üçüncü instar (gezinme) aşamasında olana kadar yumurta toplama şişelerini yaklaşık 144 saat boyunca 25 °C'de tutun.
- Diseksiyon için uygun larvaları seçmek için (hem Dpp-GAL4 hem de UAS-Dpp-GFP'yi ifade edenler) önce Tb olmayan larvaları seçerler. Bu larvalar kısa ve yağlı değil, normal uzunlukta olacaktır.
- Tüberküloz olmayan larvalar arasında CyO-GFP ve Dpp-GFP ifade eden larvalar olacaktır. Larvaları ifade eden Dpp-GFP'yi seçmek için, bunları floresan stereomikroskop altında görüntüleyin. Hem Dpp-GFP hem de CyO-GFP ifade eden larvalar bazı GFP floresan olacak iken, GFP kanat diskleri ile sınırlı ve floresan çok daha az parlak olan gfp ifade larvaları ayırt edici dpp-GFP. Diseksiyon için bu daha az parlak larvaları seçin.
2. Larva Görüntüleme ve Diseksiyon için Çözüm Hazırlama
- Kanat disklerinin canlı görüntülenmesi için modifiye HL3 media21 (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.5 mM CaCl2 dyhidrat, 4 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 mM trehalose dishidrat, 115 mM sakaroz, 5 mM HEPES) hazırlayın. Bu ortam kanat diskinin görüntüleme21için canlı tutulmasını sağlar.
- HEPES kullanarak pH'ı 7.1'e ayarlayın ve 0,22 μm filtre ile filtre uygulayın. Bu ortamı hem kanat diski diseksiyonları hem de canlı görüntüleme için montaj ortamı olarak kullanın.
3. Kanat Diski Montajı için Slayt Hazırlama
- İki adet renksiz çift taraflı teyp genişlikte bir mikroskop slaytı üzerinde yerleştirin ve aralarında yaklaşık 5 mm'lik bir boşluk bırakarak. Bant parçaları, teybin uçlarının mikroskop kaydırağının kenarlarıyla dolup taşacak kadar uzun olmalıdır.
- Hiçbir ortamın altından sızaması için bandı slayta sıkıca bastırmak için düz bir kenar (bir çift kesme çikisinin sapucu gibi) kullanın.
- İki bant parçası arasına 25 μL'lik değiştirilmiş HL3 ortamı yerleştirin. Kanat diski, bantın kapağın diski ezmesini önleyecek şekilde bant parçaları arasında bu ortam damlasına monte edilecektir(Şekil 1A).
4. Görüntüleme için Kanat Disklerinin Diseksiyonu ve Montajı
- Hazırlanan modifiye HL3 medya26larvaları diseksiyon .
- İki çift forceps kullanarak larvaları yavaşça ikiye ayırın ve larvanın arka yarısını atın.
- Larvanın ön yarısının ortasını bir çift forceps ile tutun ve larva tamamen ters dönene kadar ağız kancalarını larvaya geri itmek için başka bir çift kapalı çile kullanın.
- Kanat diskleri en kolay larvaher iki tarafında aşağı çalıştırmak trakea iki koyu renkli birincil dalları keskin virajlar arayarak bulunabilir. Kanat diskleri ters bir larva da trakea bu virajlar altında doğrudan yatıyor.
- Kanat disklerini yavaşça çıkarın ve hazırlanan mikroskop kaydırağında 25 μL HL3 ortama aktarın. Disklerin yüzdürülmesi nedeniyle, incelenmiş kanat disklerine hiçbir trakea parçasının bağlı kalmadığından emin olmak önemlidir, bu da görüntülemeyi zorlaştırabilir.
- Kanat diskini, kanat kesesinin peripodial tarafının mikroskop kaydıraktan yukarı bakacak şekilde yerleştirin (bkz. Şekil 1A,B).
- Kanat diskini ve bandı bir kapak fişi ile kapatın ve oje kullanarak kapak fişini kapatın. Cila kurudıktan sonra, hemen aşağıdaki görüntüleme adımlarına geçin.
5. Görüntüleme Dpp Salınımı
- 40x yağ amacı ve 488 nm lazer ile konfokal lazer tarama mikroskobu kullanarak monte kanat diski görüntüleyin. Dpp-GFP hücrelerin bu merkezi şerit serbest bırakılan Dpp-GFP küçük puncta ile kanat diskinin merkezinde aşağı GFP floresan bir şerit olarak görünmelidir.
- Dpp sürümü görselleştirmek için 2 dakika için 2 Hz hızında görüntüleri toplayın. En iyi sonuçlar için lazeri, görüntü koleksiyonu sırasında aşırı beyazlatmayı önlemek için Dpp serbest hücrelerinin net bir görüntüsünü elde edecek kadar güçlü bir ayarda ayarlayın. Görüntüler daha sonra AVI dosyaları (sıkıştırma, 3 kare / s) Dpp sürümü video dosyaları elde etmek için dışa aktarılabilir bir zaman serisi olarak toplanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 2 bu protokolün temsili canlı görüntüleme sonuçlarını gösterir. Protokol başarılı olduğunda, Dpp-GFP kanat diskinin merkezinde nisbeten aşağı doğru bir şerit olarak görülebilir ve çekirdekleri Dpp-GFP bölgesinde floresan olmayan daireler olarak görülebilir (Şekil 2). Dpp-GFP sürümü görünür ve kaybolan floresan puncta olarak görülebilir. Dpp-GFP floresansının hücre cisimlerinde ve hücre cisimlerinden uzak larda ortaya çıktığını ve kaybolduğunu gözlemledik. Dpp sinyalleme hücre gövdesinden22,23kadar uzanan sitokinler denilen aktin tabanlı filopodia benzeri yapılara bağlıdır. Bu nedenle, bu sunulan videolar da Dpp üreten hücre organları uzak görselleştirilmiş Dpp-GFP puncta sitokinmes veya sitokin "sinaps"15muhtemeldir muhtemeldir . Bu puncta d/v sınırına en yakın olan ve Dpp-GFP şeridindeki boşluk olarak görülebilen bir sınırdır.
Şekil 3, optimal olmayan bir sonucu gösterir. Burada açıklanan yöntemde, kanat diskleri peripodial tarafının mikroskop kaydıraktan uzağa doğru yüzlerini kesiştirdi, böylece disk peripodial tarafından görüntülenir (Şekil 1B'degösterildiği gibi). Kanat diski ters taraftan görüntülenirse, yani mikroskop slaytına doğru peripodial tarafı, Dpp-GFP floresansı odak dışında görünür ve çözünürlük zayıf olur, sonuç şekil 3'tegösterilen alt optimal sonuçla sonuçlanır. Bu nedenle adım 4.6, bu sonucu önlemek için görüntülemeden önce kanat diskinin doğru yönde düz yattığından emin olmak için önemlidir.
Şekil 4 bir Dpp>GFP(dpp-GAL4; UAS-GFP) üçüncü instar larva kanat diski. GFP Dpp'ye kaynaştırıldığında, hücre gövdelerinin dışında delinme görünümünü gözlemlemeyiz. Bu denetim, Dpp-GFP'nin tek başına GFP'den farklı davrandığının sonucu için önemlidir.
Şekil 5 bir dpp-GAL4 sürücüsünün tek başına üçüncü instar larva kanat diskinin bir zaman serisi gösterir. Görüntüler, diğer örneklerle aynı mikroskop edinme ayarlarıyla alınmıştır. Bu görüntüler, Dpp-GFP ifade edilmediğinde floresan puncta'nın görünmediğini göstermektedir.
Şekil 1: Kanat diski montaj kurulumunun çizimi. Dpp-GFP sürümü görüntülemek için, parçalanmış kanat diskleri gösterildiği gibi monte edilmelidir. (A) İki adet çift taraflı bant, mikroskop slaytına geniş bir şekilde yerleştirilir ve kanat diski bant arasına modifiye edilmiş HL3 ortama monte edilir. (B) Doğru monte edilmiş kanat diskinin yan görünümü. Disk, kanat kesesinin peripodial tarafının kapak kaymasına doğru yukarı doğru bakabilmesi için yönlendirilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Kanat diskinde Dpp-GFP sürümü temsilcisi video. Dpp-GFP kanat diskinde UAS-GAL4 sistemi kullanılarak ifade edildi. Burada Gösterilen Dpp-GFP sürümü canlı görüntüleme sonuçlarının temsili bir video. Hücre çekirdekleri floresan dairesel boşluklar olarak görülebilir. Gizli Dpp-GFP parlak puncta olarak görülebilir. Kontrast nedeniyle, bu parlak puncta Dpp üreten hücre organları içeren bölge dışında gözlemlemek için en kolay. Böyle bir alan, ilk birkaç kareden sonra kaybolan bir dikdörtgenle gösterilir. Kanat diskinin ventral ve arka yönleri oklarla gösterilir. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Dpp-GFP salınım görüntülemesinin suboptimal sonucu. Kanat diski peripodial yan yüz aşağı yönlendirilmiş ise oluşan bir suboptimal sonuç örneği. Kanat disk iposu Dpp-GFP'nin yanlış yönlendirmesi nedeniyle odak noktası değildir, net çekirdekler görülemez ve mikroskobun parametreleri nasıl ayarlanırsa ayarlansın çözünürlük zayıf kalır. Kanat diskinin ventral ve arka yönleri oklarla gösterilir. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Kanat diskinin Dpp üreten hücrelerinde GFP ifadesinin temsili videosu. GFP ifadesi hücre gövdelerinde parlak bir şekilde görünür ve çevrede salınan parlak puncta olarak görünmez. Kanat diskinin ventral ve arka yönleri oklarla gösterilir. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Dpp-GFP veya GFP ifadesi olmadan dpp-Gal4 üçüncü instar kanat disklerinin temsili video. Gal4, UAS-GFP veya UAS-Dpp-GFP eksikliği nedeniyle GFP veya Dpp-GFP ifadesini kullanamıyorsa floresan gözlenmez. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dpp gibi BmP'ler, komşu veya görünüşte uzak hücrelerde hücre içi sinyal bir çağlayan neden membran bağlı reseptörleri karmaşık bir bağlamak zaman önemli bir etki yapmak. Dr Thomas Kornberg'in laboratuvarı göstermiştir ki, sitokinler15,24,25olarak adlandırılan aktin bazlı ince filapodia benzeri yapılar kullanarak sinyal alan Dpp sinyal temas hücrelerini üreten hücreler . Bu veriler, bu bağlamda gelişimsel hücre-hücre iletişiminin nöronal sinaps26'yabenzeyebileceğini göstermektedir. Sinaptik iletişimde, nörotransmitter salınımDinamikleri postsinaptik hücre üzerindeki etkisi için çok önemlidir. Benzer şekilde, Dpp sürümü dinamikleri de downstream sonuçları için önemlidir12. Bu nedenle, farklı genetik arka planlar ve koşullar da Dpp salınımını etkileyen faktörlerin ne olduğunu anlamak için Dpp salınımının dinamiklerini ölçebilmek önemlidir.
Burada görüntü Dpp sürümü için optimize yöntemi sunduk. Ayrıca görüntüleme için kanat diskkültür kuyuları kullanarak çalıştık. Kuyunun çok derini, Dpp sürüm olaylarına odaklanmakta güçlük çekebilir. Buna ek olarak, kanat diski canlı görüntüleme sırasında hareket edebilir, bu da analizi zorlaştırır. Çift taraflı bant, kapak kayması ile kaydırak arasında kanat diskinin ezilmesinin önlenmesi için yeterli boşluk sağlarken, uygun netleme sağlar. Mikroskobun ısınmasına izin vermek için görüntülemeden yarım saat önce mikroskobu niçin döndürmenin görüntünün video boyunca sürüklenmesini engellediğini bulduk. Kanat diskinin yukarı bakacak şekilde kanat kesesinin peripodial tarafı ile yerleştirilmesi Dpp salınımını görüntülemede çok önemlidir. Biz ters yönelim bize Dpp serbest olayları görüntü izin vermez bulundu.
Bu yöntem Dpp salınımının genetik değiştiriciler aramak için kullanılabilir. Bir iyon kanalının inhibisyonunun Dpp salınımını etkilediğini gözlemledik12. Diğer iyon kanalları da Dpp sürüm dinamiklerini etkileyebilir. Ayrıca teratojenler gibi çevresel koşulların Dpp salınımını nasıl etkilediğini test edebilir. Serbest bırakma dinamiği birkaç farklı gelişimsel sinyal ligands downstream sonuçları için önemli olabilir. Biz sadece nasıl görüntü Dpp sürümü açıklanan olsa da, Kirpi gibi diğer ligands sittonem aracılı sinyal gözlenmiştir ve benzer bir mekanizma tarafından düzenlenebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Dr. Sarala Pradhan'a bu protokolün daha önceki bir versiyonu üzerinde çalıştığı için teşekkür ederiz. Bu protokolü geliştirirken finansman için NSF-IOS 1354282'ye teşekkür ederiz. Nih-NIDCR RO1DE025311'e şu anda laboratuvarımızı finanse ettiği için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Baker's yeast | Red Star | ||
| CaCl2 dyhydrate | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Coverslips | VWR | 484-457 | |
| Double-sided tape | Scotch | ||
| Drosophila Agar Type II | Apex | 66-104 | |
| Drosophila melanogaster: Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu | This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center | ||
| Drosophila melanogaster: Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu | This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center | ||
| Dumont Tweezers #5 | World Precision Instruments | 500233 | Forceps for dissecting |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| KCl | Fisher Scientific | AC193780010 | |
| Light Corn Syrup | Karo | ||
| Malt Extract | Breiss | ||
| MgCl2 | Fisher Scientific | AC223210010 | |
| Microscope slides | Sigma Aldrich | S8400 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| NaHCO3 | RPI | S22060-1000.0 | |
| Nail polish | Electron Micsroscopy Sciences | 72180 | |
| Propionic Acid | VWR | U330-09 | |
| Soy Flour | ADM Specialty Ingredients | 062-100 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| Sucrose | Fisher | S512 | |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | |
| Trehalose dyhydrate | Chem-Impex International, Inc. | 00766 | |
| Yellow Corn Meal | Quaker | ||
| Zeiss LSM 780 confocal microscope | Zeiss | Microscope for live imaging | |
| Zeiss SteREO Discovery.V8 microscope | Zeiss | Microscope for dissections |
References
- Ferguson, E. L., Anderson, K. V. Decapentaplegic acts as a morphogen to organize dorsal-ventral pattern in the Drosophila embryo. Cell. 71 (3), 451-461 (1992).
- Ferguson, E. L., Anderson, K. V. Localized enhancement and repression of the activity of the TGF-beta family member, decapentaplegic, is necessary for dorsal-ventral pattern formation in the Drosophila embryo. Development. 114 (3), 583-597 (1992).
- Wharton, K. A., Ray, R. P., Gelbart, W. M. An activity gradient of decapentaplegic is necessary for the specification of dorsal pattern elements in the Drosophila embryo. Development. 117 (2), 807-822 (1993).
- Raftery, L. A., Twombly, V., Wharton, K., Gelbart, W. M. Genetic screens to identify elements of the decapentaplegic signaling pathway in Drosophila. Genetics. 139 (1), 241-254 (1995).
- Raftery, L. A., Sanicola, M., Blackman, R. K., Gelbart, W. M. The relationship of decapentaplegic and engrailed expression in Drosophila imaginal disks: do these genes mark the anterior-posterior compartment boundary. Development. 113 (1), 27-33 (1991).
- Blackman, R. K., Sanicola, M., Raftery, L. A., Gillevet, T., Gelbart, W. M. An extensive 3' cis-regulatory region directs the imaginal disk expression of decapentaplegic, a member of the TGF-beta family in Drosophila. Development. 111 (3), 657-666 (1991).
- de Celis, J. F. Expression and function of decapentaplegic and thick veins during the differentiation of the veins in the Drosophila wing. Development. 124 (5), 1007-1018 (1997).
- De Celis, J. F. Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins. Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).
- Letsou, A., et al. Drosophila Dpp signaling is mediated by the punt gene product: a dual ligand-binding type II receptor of the TGF beta receptor family. Cell. 80 (6), 899-908 (1995).
- Nellen, D., Affolter, M., Basler, K. Receptor serine/threonine kinases implicated in the control of Drosophila body pattern by decapentaplegic. Cell. 78 (2), 225-237 (1994).
- Raftery, L. A., Sutherland, D. J. TGF-beta family signal transduction in Drosophila development: from Mad to Smads. Developmental Biology. 210 (2), 251-268 (1999).
- Dahal, G. R., Pradhan, S. J., Bates, E. A. Inwardly rectifying potassium channels regulate Dpp release in the Drosophila wing disc. Development. 144 (15), 2771-2783 (2017).
- Dahal, G. R., et al. An inwardly rectifying K+ channel is required for patterning. Development. 139 (19), 3653-3664 (2012).
- George, L. F., et al. Ion Channel Contributions to Wing Development in Drosophila melanogaster. G3. 9 (4), Bethesda. 999-1008 (2019).
- Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. Glutamate signaling at cytoneme synapses. Science. 363 (6430), 948-955 (2019).
- Teleman, A. A., Cohen, S. M. Dpp gradient formation in the Drosophila wing imaginal disc. Cell. 103 (6), 971-980 (2000).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Dahal, G. R., Pradhan, S. J., Bates, E. A. Inwardly rectifying potassium channels influence Drosophila wing morphogenesis by regulating Dpp release. Development. 144 (15), 2771-2783 (2017).
- Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
- Hazegh, K. E., Reis, T. A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (117), e54744 (2016).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. Journal of Neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).
- Hsiung, F., Ramirez-Weber, F. A., Iwaki, D. D., Kornberg, T. B. Dependence of Drosophila wing imaginal disc cytonemes on Decapentaplegic. Nature. 437 (7058), 560-563 (2005).
- Roy, S., Hsiung, F., Kornberg, T. B. Specificity of Drosophila cytonemes for distinct signaling pathways. Science. 332 (6027), 354-358 (2011).
- Kornberg, T. B., Roy, S. Cytonemes as specialized signaling filopodia. Development. 141 (4), 729-736 (2014).
- Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein. Science. 343 (6173), 1244624 (2014).
- Kornberg, T. B., Roy, S. Communicating by touch--neurons are not alone. Trends in Cell Biology. 24 (6), 370-376 (2014).
