Summary

Imagem Dpp Liberação de um disco de asa drosophila

Published: October 30, 2019
doi:

Summary

O momento da exposição a ligantes pode afetar suas conseqüências de desenvolvimento. Aqui mostramos como a liberação de imagem de uma proteína morfogenética óssea Drosophila (BMP) chamada Dpp das células do disco da asa.

Abstract

A superfamília transformadora Fator de Crescimento-beta (TGF-β) é essencial para o padrão embrionário precoce e o desenvolvimento de estruturas adultas em organismos multicelulares. A superfamília TGF-β inclui TGF-β, proteína morfogenética óssea (BMPs), Activins, Fatores de Crescimento e Diferenciação e Nodals. Há muito se sabe que a quantidade de ligand expostos às células é importante para seus efeitos. Pensava-se que gradientes de concentração de longo alcance criaram padrão embrionário. No entanto, recentemente, tornou-se claro que o momento da exposição a esses ligantes também é importante para suas conseqüências transcricionais a jusante. Um ligand superfamily de TGF-β não pode ter uma conseqüência desenvolvente até que esteja liberado da pilha em que foi produzido. Até recentemente, era difícil determinar quando esses ligantes eram liberados das células. Aqui mostramos como medir a liberação de um BMP Drosophila chamado Decapentaplegic (Dpp) das células do primordium asa ou disco de asa. Este método pode ser modificado para outros sistemas ou ligantes de sinalização.

Introduction

As proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs) são essenciais para a embriogênese embrionária precoce e o padrão das estruturas adultas. Os BMPs são produzidos e secretados para afetar a transcrição dos genes-alvo necessários para o crescimento e a diferenciação celular nas células de resposta. Decapentapla (Dpp) é um homolog Drosophila de BMP4 que é importante para o desenvolvimento de estruturas embrionárias e adultas como a asa1,2,3,4. Vários grupos se concentraram no papel de Dpp no padrão de asas de mosca adulta saem por 1) as asas são compostas por duas folhas transparentes de epitélia com um padrão de venação consistente que pode ser facilmente avaliado; 2) os discos de asa também são razoavelmente planos, podem ser cultivados fora da larva, e são simples de imagem e quantificar diferenças no padrão; e 3) o desenvolvimento do padrão de asa é sensível a Dpp de tal forma que pequenas perturbações no caminho terá impacto padrão de venação das asas.

Dpp é produzido em células localizadas no limite anterior/posterior do disco de asa5,6,7,8. Dpp se liga a um complexo de receptores de quinase serina/threonina tipo 19,10. Após a ligação Dpp, o receptor tipo 2 fosforiatos o receptor tipo 1 que, em seguida, fosforiatomães contra Dpp (Mad), um smad 1/5/8 homolog. O SMAD fosforilado recruta um co-Smad adicional (Madea), que permite entrar no núcleo onde regula os genes-alvo, levando a efeitos a jusante, como proliferação ou diferenciação4,11.

Recentemente, o Laboratório Bates mostrou que a liberação inadequada de Dpp dentro do disco de asa pode levar a uma diminuição da fosforiação louca, redução na expressão gênica alvo e defeitos de padronização de asa12,13. Vários canais de íons impactam o desenvolvimento da asa drosophila e estruturas associadas14,15. Esses canais de íons também podem estar envolvidos na liberação do Dpp. Ao determinar o mecanismo de liberação de morfogênio, é importante que haja um método para visualizar eventos de liberação.

Drs. Aurelio Teleman e Stephen Cohen criou uma proteína de fusão Dpp-GFP que é capaz de resgatar a perda de Dpp, o que significa que é biologicamente ativo e é lançado de forma biologicamente relevante16. Aqui, descrevemos como visualizamos os eventos de lançamento do Dpp usando este Dpp-GFP. Esta proteína de fusão é particularmente útil porque gfp é pH sensível de tal forma que quando está em vesículas ácidas, a fluorescência é saciada17. Portanto, quando uma proteína marcada com GFP é liberada de uma vesícula para o ambiente extracelular mais neutro, a intensidade da fluorescência gfp aumenta17. Aproveitamos a sensibilidade ao pH da GFP para determinar se o Dpp-GFP reside em vesículas ácidas. Nós imagemddiscos de asa expressando Dpp-GFP antes e depois da adição de cloreto de amônio, que neutraliza compartimentos intracelulares vesículas18. Encontramos um aumento significativo na fluorescência de puncta após a adição de cloreto de amônio, sugerindo que o Dpp-GFP intracelular é saciado antes da adição de cloreto de amônio18. Concluímos que o Dpp-GFP intracelular reside em compartimentos ácidos ligados à membrana, como vesículas, e é insaciável após a adição de cloreto de amônio para neutralizar o pH dos compartimentos intracelulares18. Isso torna a imagem ao vivo do Dpp-GFP uma técnica útil para visualizar a dinâmica do Dpp no disco da asa drosophila, uma vez que é liberado de compartimentos ácidos para o ambiente extracelular.

Aqui, descrevemos o método que usamos para visualizar eventos de lançamento do Dpp usando o Dpp-GFP. Dpp-GFP pode ser expressa em seu padrão nativo em discos de asa Drosophila usando o sistema UAS-GAL419. Este é o método que foi usado para determinar que os canais Irk impacto Dpp liberação18. Validamos o método por meio de imagens ao vivo z-pilhas. Nós não vemos Dpp-GFP puncta movendo-se dentro do plano de foco na série de tempo, se adquirimos em um plano de foco. Nós também não vemos movimento de Dpp-GFP puncta se nós imaged em um z-pilha. Concluímos que o Dpp-GFP puncta visto usando este método são eventos de liberação, em vez de movimento de vesículas intracelularmente. Este método de imagem ao vivo do Dpp-GFP poderia potencialmente ser usado para testar outros modificadores putativos de liberação Dpp por seu impacto na dinâmica Dpp ou poderia ser modificado para olhar para a dinâmica de outros ligantes

Protocol

1. Coleta de ovos para gerar larvas para dissecação Cruz 30-40 virgem fêmea Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu voa para 10-15 masculino Sp / CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu.Nota: Quaisquer dois genótipos contendo Dpp-GAL4 e UAS-Dpp-GFP podem ser usados enquanto os balanceadores tiverem marcadores larvais que permitem a seleção da progênie apropriada durante o estágio larval. Para coletar ovos, vire as moscas cruzadas em um frasco fresco de comida e permita que elas coloquem por 3-4 h antes…

Representative Results

A figura 2 mostra resultados representativos de imagem ao vivo deste protocolo. Quando o protocolo é bem sucedido, Dpp-GFP pode ser visto como uma faixa para baixo do centro do disco de asa com núcleos visíveis como círculos não fluorescentes dentro da região dpp-GFP (Figura 2). A liberação de Dpp-GFP é visível como pontuatura fluorescente que aparece e desaparece. Observamos a fluorescência de Dpp-GFP aparecendo e desaparecendo nos corpos celulares e…

Discussion

BMPs como Dpp fazer seu impacto significativo quando ligam um complexo de receptores ligados à membrana para causar uma cascata de sinalização intracelular em células vizinhas ou aparentemente distantes. O laboratório do Dr. Thomas Kornberg mostrou que as células que produzem as células de contato com sinal Dpp que recebem o sinal usando estruturas finas de filapodia à base de actina chamadas citonemes15,24,25. Estes dad…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gostaríamos de agradecer ao Dr. Sarala Pradhan por trabalhar em uma versão anterior deste protocolo. Gostaríamos de agradecer ao NSF-IOS 1354282 pelo financiamento enquanto desenvolvemos este protocolo. Gostaríamos de agradecer ao NIH-NIDCR RO1DE025311 pelo financiamento do nosso laboratório atualmente.

Materials

Baker's yeast Red Star    
CaCl2 dyhydrate Fisher Scientific C79-500
Coverslips VWR 484-457
Double-sided tape Scotch
Drosophila Agar Type II Apex 66-104
Drosophila melanogaster: Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center
Drosophila melanogaster: Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center
Dumont Tweezers #5 World Precision Instruments 500233 Forceps for dissecting
HEPES Sigma Aldrich H3375
KCl Fisher Scientific AC193780010
Light Corn Syrup Karo
Malt Extract Breiss
MgCl2 Fisher Scientific AC223210010
Microscope slides Sigma Aldrich S8400
NaCl Fisher Scientific S271-500
NaHCO3 RPI S22060-1000.0
Nail polish Electron Micsroscopy Sciences 72180
Propionic Acid VWR U330-09
Soy Flour ADM Specialty Ingredients 062-100
Sucrose Fisher Scientific S5-3
Sucrose Fisher S512
Tegosept Genesee Scientific 20-259
Trehalose dyhydrate Chem-Impex International, Inc. 00766
Yellow Corn Meal Quaker
Zeiss LSM 780 confocal microscope Zeiss Microscope for live imaging
Zeiss SteREO Discovery.V8 microscope Zeiss Microscope for dissections

References

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Cite This Article
George, L. F., Bates, E. A. Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc. J. Vis. Exp. (152), e60528, doi:10.3791/60528 (2019).

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