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Bioengineering

व्यक्तिगत लिपोसोम्स के बीच रचनात्मक इनमोमोसिटी का पता लगाने के लिए एक मात्रात्मक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी आधारित एकल लिपोसम परख

Published: December 13, 2019 doi: 10.3791/60538
Automatic Translation
1,3, 1,2,3, 1,2,3
1Center for Nanomedicine and Theranostics, Technical University of Denmark, 2Center for Intestinal Absorption and Transport of Biopharmaceuticals, Technical University of Denmark, 3Department of Health Technology, Technical University of Denmark

Summary

यह प्रोटोकॉल लिपोसोम्स के निर्माण का वर्णन करता है और इन्हें सतह पर कैसे स्थिर किया जा सकता है और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके बड़े पैमाने पर समानांतर तरीके से व्यक्तिगत रूप से चित्रित किया जा सकता है। यह जनसंख्या के एकल लिपोसोम के बीच आकार और रचनात्मक अमोटिजनता के परिमाणीकरण के लिए अनुमति देता है।

Abstract

झिल्ली मॉडल सिस्टम या दवा वितरण वाहक के रूप में लिपोसोम को नियोजित करने वाले अधिकांश शोध थोक पठन-आउट तकनीकों पर निर्भर करता है और इस प्रकार आंतरिक रूप से कलाकारों की टुकड़ी के सभी लिपोसोम को समान माना जाता है। हालांकि, एकल कण स्तर पर लिपोसोम का निरीक्षण करने में सक्षम नए प्रयोगात्मक प्लेटफार्मों ने व्यक्तिगत लिपोसोम पर प्रोटीन-झिल्ली इंटरैक्शन या ड्रग कैरियर गुणों पर अत्यधिक परिष्कृत और मात्रात्मक अध्ययन करना संभव बना दिया है, इस प्रकार कलाकारों की टुकड़ी औसत से त्रुटियों से परहेज । यहां हम फ्लोरेसेंस आधारित माइक्रोस्कोपी परख का उपयोग करके एकल लिपोसोम तैयार करने, पता लगाने और विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, जिससे इस तरह के एकल कण मापको सुविधाजनक होती है। सेटअप एक बड़े पैमाने पर समानांतर तरीके से व्यक्तिगत liposomes इमेजिंग के लिए अनुमति देता है और अंतर नमूना आकार और रचनात्मक असंगति प्रकट करने के लिए कार्यरत है । इसके अतिरिक्त, प्रोटोकॉल एकल लिपोसोम स्तर पर लिपोसोम का अध्ययन करने के फायदों, परख की सीमाओं और अन्य शोध प्रश्नों का अध्ययन करने के लिए इसे संशोधित करते समय विचार किए जाने वाले महत्वपूर्ण विशेषताओं का वर्णन करता है।

Introduction

लिपोसोम गोलाकार फॉस्फोलिपिड आधारित वेसिकल्स हैं जिनका बुनियादी और लागू अनुसंधान दोनों में भारी उपयोग किया जाता है। वे उत्कृष्ट झिल्ली मॉडल सिस्टम के रूप में कार्य करते हैं, क्योंकि उनके शारीरिक गुणों को लिपोसोम1,2बनाने वाले लिपिड घटकों को अलग करके आसानी से हेरफेर किया जा सकता है। इसके अलावा, लिपोसोम्स सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले दवा वितरण नैनोकैरियर सिस्टम का गठन करते हैं, जो बेहतर फार्माकोकिनेटिक्स और फार्माकोडायनामिक्स के साथ-साथ उच्च जैव अनुकूलता3की पेशकश करते हैं।

कई वर्षों के लिए, liposomes मुख्य रूप से थोक तकनीकों का उपयोग कर अध्ययन किया गया है, केवल कलाकारों की टुकड़ी औसत पढ़ने के मूल्यों के लिए उपयोग दे रही है । यह इन अध्ययनों के बहुमत का नेतृत्व किया है लगता है कि कलाकारों की टुकड़ी में सभी liposomes समान हैं । हालांकि, इस तरह के पहनावा-औसत मूल्य केवल तभी सही हैं जब अंतर्निहित डेटासेट समान रूप से मतलब मूल्य के आसपास वितरित किया जाता है, लेकिन यदि डेटासेट में कई स्वतंत्र आबादी शामिल है, उदाहरण के लिए, एक झूठी और पक्षपातपूर्ण निष्कर्ष का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं। इसके अतिरिक्त, कलाकारों की टुकड़ी संभालने का मतलब पूरी आबादी का प्रतिनिधित्व करने के लिए liposomes के बीच inhomogeneity के भीतर बंदरगाह जानकारी को नजरअंदाज कर सकते हैं । हाल ही में मात्रात्मक परख उभरा है जो एकल लिपोसोम की जांच करने में सक्षम हैं, जिसमें लिपोसोम आकार4,लिपिड संरचना5,6और एनकैप्सुलेशन दक्षता7सहित महत्वपूर्ण भौतिक रासायनिक गुणों के संबंध में व्यक्तिगत लिपोसोम के बीच बड़ी असंगति का खुलासा किया गया है, जो एकल लिपोसोम स्तर पर लिपोसोम का अध्ययन करने के महत्व को रेखांकित करता है।

एक शोध क्षेत्र जहां लिपोसोम गुणों के औसत से पहनावा पूर्वाग्रह परिणामों के लिए दिखाया गया है लिपोसोम आकार पर निर्भर प्रोटीन झिल्ली बातचीत8,9का अध्ययन कर रहा है । परंपरागत रूप से, ऐसी प्रक्रियाओं का अध्ययन करने वाले शोधकर्ताओं को विभिन्न ताकना आकार9के साथ फिल्टर के माध्यम से बाहर निकालकर विभिन्न पहनावा औसत व्यास के साथ लिपोसोम तैयार करने तक सीमित किया गया है। हालांकि, एकल लिपोसोम परखों का उपयोग करके व्यक्तिगत लिपोसोम के व्यास को निकालने से बड़ी आबादी ओवरलैप हुई है, जिसमें लिपोसोम्स ने 100 एनएम और 200 एनएम फिल्टर का उपयोग करके अपने आकार वितरण4में 70% तक ओवरलैप प्रदर्शित किया है। यह लिपोसोम आकार-निर्भर प्रोटीन-झिल्ली इंटरैक्शन10के थोक मापको गंभीर रूप से पूर्वाग्रह सकता है। एकल लिपोसोम परख का उपयोग करके झिल्ली-प्रोटीन इंटरैक्शन अध्ययन ों का प्रदर्शन करते हुए, शोधकर्ताओं ने इसके बजाय नमूने के भीतर आकार-पॉलीफैलाव का लाभ उठाया, जिससे उन्हें प्रत्येक प्रयोग के भीतर लिपोसोम व्यास की एक विस्तृत श्रृंखला का अध्ययन करने की अनुमति दी गई, जिससे नई खोजों को सुविधाजनक बनाया जा सके कि झिल्ली वक्रता और संरचना झिल्ली4,11,12में प्रोटीन भर्ती को कैसे प्रभावित कर सकती है। एक अन्य क्षेत्र जहां एकल लिपोसोम परखों के अनुप्रयोग ने सहायक सिद्ध किया है , प्रोटीन-मध्यस्थता झिल्ली संलयन13,14 के मशीनीअध्ययनोंमें है । इस तरह के गतिज मापन के लिए, व्यक्तिगत संलयन घटनाओं का अध्ययन करने की क्षमता संलयन प्रक्रिया के प्रयोगात्मक सिंक्रोनाइजेशन की आवश्यकता को समाप्त कर दिया, नई यंत्रवादी अंतर्दृष्टि है कि अंयथा थोक पहनावा माप में किया स्थानिक औसत में खो गया है की अनुमति । इसके अतिरिक्त, एकल लिपोसोम का उपयोग झिल्ली पाड़ के रूप में किया गया है, जिससे व्यक्तिगत प्रोटीन की माप की अनुमति होती है और ट्रांसम्मेम्पल प्रोटीन संरचनात्मक गतिशीलता15,16पर नए ज्ञान की पेशकश की जाती है। इसके अलावा, इस तरह के प्रोटेओलियोपोसोम-आधारित सेटअप ने व्यक्तिगत ट्रांसमेम्ब्रेन ट्रांसपोर्टरों17 और पोर बनाने वाले प्रोटीन परिसरों18 के साथ-साथ बायोएक्टिव झिल्ली-पार्मेबिलाइजिंग पेप्टाइड्स19के तंत्र का अध्ययन करना संभव बनाया। एकल लिपोसोम का उपयोग सतह-स्थिर एकल लिपोसोम के साथ नरम पदार्थ नैनोफ्लूडिक के रूप में भी किया गया है जो10-19 एल की मात्रा में एंजाइमैटिक प्रतिक्रियाओं के लिए कक्षों के रूप में सेवारत हैं, जो न्यूनतम उत्पाद खपत20के साथ स्क्रीनिंग परखों की थ्रूपुट और जटिलता को बढ़ा ते हैं।

हाल ही में, एक लिपोसोम परख विस्तार के पहले से ही अपूर्व स्तर पर दवा वितरण liposomes विशेषता के लिए इस्तेमाल किया गया है । शोधकर्ता21व्यक्तिगत लिपोसोम ्स की सतह से जुड़े बहुलक की मात्रा में महत्वपूर्ण संक्षमता की मात्रा निर्धारित करने में सक्षम थे । एकल लिपोसोम परखों ने जटिल मीडिया में दवा वितरण लिपोसोम के माप की भी अनुमति दी, जैसे रक्त प्लाज्मा, खुलासा कैसे लिपिड एंकर के माध्यम से लिपोसोम सतह पर लंगर डाले तत्वों को विवो परिसंचरण22में अनुभव के दौरान अनुभवी शर्तों के संपर्क में आने पर विसोशन के लिए अतिसंवेदनशील हो सकता है । कुल मिलाकर, बहुमुखी प्रतिभा और एकल लिपोसोम परख की उपयोगिता समस्याओं की महान विविधता इन सेटअप को संबोधित करने के लिए नियोजित किया गया है द्वारा प्रमाणित कर रहे हैं, और हम कल्पना है कि कार्यप्रणाली को विकसित किया जाना जारी रहेगा और नए वैज्ञानिक क्षेत्रों में उपयोग मिल ।

यहां हम एक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी आधारित एकल लिपोसोम परख का वर्णन करते हैं जो व्यक्तिगत लिपोसोम ्स को उच्च-थ्रूपुट तरीके से अध्ययन करने की अनुमति देता है(चित्रा 1)। विधि को समझाने के लिए, हम इसका उपयोग एक कलाकारों की टुकड़ी के भीतर व्यक्तिगत लिपोसोम के बीच आकार और रचनात्मक अमोटिजनता की मात्रा निर्धारित करने के लिए करते हैं। परख एक प्रचलित कांच की सतह पर स्थिर एकल लिपोसोम्स की फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप इमेजिंग को नियोजित करता है। हम पहले लिपोसोम फैब्रिकेशन प्रक्रिया में महत्वपूर्ण चरणों का वर्णन करते हैं जो उचित फ्लोरोसेंट लिपोसोम लेबलिंग और स्थिरीकरण सुनिश्चित करता है। फिर, हम उचित लिपोसोम सतह घनत्व सुनिश्चित करने की प्रक्रिया को रेखांकित करने से पहले लिपोसोम इम्मोबिलाइजेशन की सुविधा के लिए आवश्यक सतह तैयारी का वर्णन करते हैं। हम उच्च गुणवत्ता वाली छवियों को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण माइक्रोस्कोपी मापदंडों पर चर्चा करते हैं और यह रेखांकित करते हैं कि कैसे सरल डेटा विश्लेषण करना है, जिससे लिपोसोम आकार और रचनात्मक अमोसिटी को निकालने की अनुमति मिलती है। इस जेनेरिक प्रोटोकॉल इच्छुक शोधकर्ता के लिए एक अच्छा आधार प्रदान करने के लिए अपने या अपने विशिष्ट अनुसंधान ब्याज के लिए आगे परख विकसित करना चाहिए ।

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Protocol

1. लिपोसोम तैयारी

नोट: संक्षेप में, लिपोसोम की तैयारी में आमतौर पर तीन महत्वपूर्ण कदम शामिल होते हैं: 1) वांछित लिपिड संरचना की सूखी लिपिड फिल्मों की तैयारी; 2) लिपोसोम के गठन के लिए लिपिड का रिहाइड्रेशन; और 3) लिपोसोम आबादी के आकार और लैमलैरिटी को नियंत्रित करना।

  1. लिपिड को तौलें और उन्हें कांच की शीशियों में टेर्ट-ब्यूटानोल: पानी (9:1) में भंग करें।
    1. POPC भंग (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-फॉस्फोकोलिन; मेगावाट = 760 ग्राम/मोल) से 50 मीटर तक।
    2. कोलेस्ट्रॉल (मेगावाट = 387 ग्राम/मोल) को 25 मीटर तक घोलें।
    3. डोप-एटो488 (1,2-डायोलियोइल-एसएन-ग्लिसेरो-3-फॉस्फोथेनॉलमाइन-एटो488 को भंग करें; मेगावाट = 1,316 ग्राम/मोल) से 01 मीटर।
    4. डोप-एटो655 (1,2-डायोलियोइल-एसएन-ग्लिसेरो-3-फॉस्फोथेनॉलमाइन-एटो655 को भंग करें; मेगावाट = 1,368 ग्राम/मोल) से 01 मीटर तक।
    5. डीएसपीई-PEG2000-बायोटिन (1,2-डिस्टेरिल-एसएन-ग्लाइसेरो-3-फॉस्फेथेथेनॉलामामाइन-एन-[बायोटिनिल (पॉलीथीन ग्लाइकोल)-2000]; मेगावाट = 3,017 ग्राम/मोल) से 01 मीटर तक।
      नोट: लिपिड को 55 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें और लिपिड को पूरी तरह से भंग करने के लिए चुंबकीय सरगर्मी का उपयोग करें। वैकल्पिक रूप से, एक ध्वनि स्नान का उपयोग करें। अप्रयुक्त लिपिड स्टॉक को कई महीनों तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
  2. पीओपीसी के मोलर अनुपात में 1.1 चरण में तैयार लिपिड स्टॉक मिलाएं: कोलेस्ट्रॉल: डोप-एटी488: डोप-एटी655:DOPE-PEG-biotin 68.95:30:0.5:0.5:0.05, पीओसी के 138 माइक्रोन, कोलेस्ट्रॉल के 120 माइक्रोन, प्रत्येक फ्लोरोसेंटी लेबल लिपिड के 500 माइक्रोन, और 50 माइक्रोन जोड़कर डीएसपीई-खूंटी-बायोटिन एक ताजा ग्लास शीशी के लिए ।
    नोट: ब्याज के विशिष्ट प्रश्न को संबोधित करने के लिए सटीक लिपोसोम संरचना को आसानी से संशोधित किया जा सकता है। अधिक विस्तार के लिए चर्चा देखें।
  3. कांच की शीशी के ढक्कन को ढीला कर दें, और तरल नाइट्रोजन में शीशी को स्नैप-फ्रीज कर दें।
  4. लिओफिलाइज फ्रोजन लिपिड मिश्रण को रात भर।
  5. सूखे लिपिड में 200 एमएम डी-सोर्बिटोल बफर (सोर्बिटोल बफर) का 1 एमएल जोड़ें।
  6. मिश्रण को 45 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें और कम से कम 1 घंटे के लिए चुंबकीय सरगर्मी का पर्दाफाश करें।
    नोट: बफर विशिष्ट सवाल है कि संबोधित किया जा रहा है प्रतिबिंबित करना चाहिए (उदाहरण के लिए, झिल्ली प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने के लिए शारीरिक शर्तों, या दवा वितरण liposomes का अध्ययन करने के लिए एक विशिष्ट चिकित्सकीय अनुमोदित बफर) । हालांकि, यदि अध्ययन के लिए एक विशिष्ट बफर की आवश्यकता नहीं है, तो लिपोसोम की बहुता को कम करने के लिए रिहाइड्रेशन के लिए आयनों के बिना बफर लागू किया जा सकता है।
  7. तरल नाइट्रोजन में शीशी सूई द्वारा लिपिड निलंबन फ्रीज, और जब तक निलंबन पूरी तरह से जमे हुए है रुको ।
  8. जब तक मिश्रण पूरी तरह से गल न जाए तब तक 55 डिग्री सेल्सियस पर हीटिंग बाथ में जमे हुए निलंबन को डुबोएं।
  9. जब तक लिपोसोम निलंबन 11 फ्रीज/गल चक्र की कुल को उजागर किया गया है कदम १.७ और १.८ दोहराएं ।
    नोट: दोहराया फ्रीज/गल चक्र लिपोसोम मल्टीलैमेरेट223को कम करने के लिए दिखाया गया है, जो एकल लिपोसोम परख की सटीकता के लिए सर्वोपरि है, के रूप में बहुमंडलीय liposomes liposomes के liposome आकार अनुपात बनाम फ्लोरेसेंस तीव्रता तिरछा होगा । बहुलामेल्ली आमतौर पर स्वाभाविक रूप से कम होती है जब निर्माण में 0.5% से अधिक PEGylated लिपिड शामिल है (जैसे आमतौर पर दवा वितरण के लिए लिपोसोम में किया जाता है)24।
  10. एक मिनी एक्सट्रूजन किट का उपयोग करके 800 एनएम पॉलीकार्बोनेट फिल्टर के माध्यम से एक बार लिपोसोम निलंबन को बाहर निकालें। एक्सट्रूजन किट की असेंबली के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें (सामग्री की तालिकादेखें)।
  11. लिपोसोम्स को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. इमेजिंग चैंबर की सतह तैयारी

  1. बोवाइन सीरम एल्बुमिन (बीएसए; 1 मिलीग्राम/एमएल), बीएसए-बायोटिन (1 मिलीग्राम/एमएल) और स्ट्रेपविडिन (0.025 मिलीग्राम/एमएल) 10 एमएम हेप्स (4-(2-हाइड्रोक्सेथिल) में तैयार करें - 1 - पाइपाज़ीनेस्टॉनिक एसिड) 95 एमएम नैकल बफर (एचपीईएस बफर) ।
    नोट: लिपोसोमल फट को रोकने के लिए, पुनर्जलीकरण के लिए उपयोग किया जाने वाला सोर्बिटोल बफर और सतह तैयार करने के लिए उपयोग किया जाने वाला हेप्स बफर आइसोटोनिक होना चाहिए। इस प्रकार प्रयोग से पहले बफ़र्स की ऑस्मोलैरिटी की जांच करने की सिफारिश की जाती है।
  2. बीएसए के 1,200 माइक्रोन और बीएसए-बायोटिन के 120 माइक्रोन मिलाएं और माइक्रोस्कोपी के लिए 8 अच्छी तरह से स्लाइड में प्रत्येक कुएं में मिश्रण के 300 माइक्रोन जोड़ें।
    नोट: यहां हम एक ग्लास बॉटम (सामग्री की तालिकादेखें) के साथ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 8 अच्छी तरह से माइक्रोस्कोप स्लाइड का उपयोग करते हैं, लेकिन प्रोटोकॉल को आसानी से अनुकूलित माइक्रोस्कोप कक्षों में अनुकूलित किया जा सकता है।
  3. कमरे के तापमान (आरटी) पर 20 न्यूनतम के लिए स्लाइड इनक्यूबेट करें।
  4. स्लाइड 8x को हेप्स बफर के 300 माइक्रोन के साथ धोएं।
    नोट: सावधान रहें कि कुछ सेकंड से अधिक समय तक बफर के बिना कुओं को न छोड़ें, क्योंकि सतह सूखने से यह नुकसान होगा। इसके अलावा, सावधान रहें कि पिपेट टिप के साथ सतह को खरोंच न करें क्योंकि इससे इसे नुकसान भी होगा। इस प्रकार, जब एक कुएं से बफर को एस्पिरेटिंग करें, तो इसे किनारे या कोने से करें।
  5. आरटी में 10 मिन के लिए स्ट्रेप्टाविडिन और इनक्यूबेट के 250 माइक्रोन जोड़ें।
  6. चरण 2.4 में वर्णित 8 वॉश दोहराएं।
  7. प्रत्येक कुएं में सोर्बिटोल बफर के 300 माइक्रोन के साथ माइक्रोस्कोप स्लाइड को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। सॉल्वेंट का वाष्पीकरण सतह को नुकसान पहुंचाएगा, इसलिए माइक्रोस्कोप स्लाइड को पेट्री डिश में डाल दें और इसे पैराफिल्म के साथ सील करें जब तक कि तैयार स्लाइड का तुरंत उपयोग न किया जाए।

3. लिपोसोम इम्मोबिलाइजेशन

  1. सोर्बिटोल बफर में लगभग 20 माइक्रोएम कुल लिपिड के लिए लिपोसोम निलंबन को पतला करें। धारा 1 में प्रक्रिया लगभग 10 एमएम कुल लिपिड का एक लिपोसोम निलंबन निकलेगा।
  2. स्लाइड को माइक्रोस्कोप पर रखें और गाइड के रूप में ग्लास/बफर इंटरफेस से बढ़े हुए लेजर रिफ्लेक्शन सिग्नल का इस्तेमाल करते हुए चैंबर की सतह पर ध्यान दें ।
  3. ताजा HEPES बफर के 300 μL के साथ कक्ष 4x धोलें।
  4. एक माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूब में पतला लिपोसोम स्टॉक (20 माइक्रोएम टोटल लिपिड) के 10 माइक्रोनल जोड़ें।
  5. कक्ष से बफर के 100 माइक्रोन लें, चरण 3.4 में तैयार माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूब में जोड़ें, ठीक से मिलाएं, और 110 माइक्रोन को वापस कक्ष में रखें।
  6. माइक्रोस्कोप के नीचे नमूना रखो, और एक रुडिमेंटल माइक्रोस्कोप सेटिंग का उपयोग करें जो सतह पर स्थिर किए जा रहे लिपोसोम का निरीक्षण करने के लिए लिपोसोम फ्लोरोफोर (एस) से संकेत का पता लगाने में सक्षम है।
  7. एक लिपोसोम सतह घनत्व के लिए लक्ष्य रखें जो व्यक्तिगत लिपोसोम और घने को इंडेंटकरने के लिए पर्याप्त रूप से विरल है कि यह उच्च-थ्रूपुट माप की सुविधा प्रदान करता है। आमतौर पर 50 माइक्रोन x 50 माइक्रोन क्षेत्र का उपयोग करके, प्रति फ्रेम 300−400 लिपोसोम इष्टतम(चित्रा 2)है। यह आमतौर पर 5−10 मिनट के भीतर प्राप्त किया जा सकता है।
    नोट: यदि देखने के क्षेत्र में केवल तेजी से चलने वाले फ्लोरोसेंट कणों का पता लगाया जाता है, तो स्थिरीकरण प्रक्रिया (बीएसए-बायोटिन, स्ट्रेप्टाविडिन, डोप-खूंटी-बायोटिन) के लिए महत्वपूर्ण घटकों में से किसी की अनुपस्थिति या बहुत कम एकाग्रता कारण हो सकती है। यदि कोई लिपोसोम का पता नहीं लगाया जाता है तो यह या तो लिपोसोम्स की कम एकाग्रता, फ्लोरेसेंस का पता लगाने के लिए अनुचित सेटिंग्स, या कांच की सतह पर नहीं एक फोकल विमान के साथ संभावित इमेजिंग से संबंधित हो सकता है।
  8. एक बार एक उपयुक्त लिपोसोम सतह घनत्व तक पहुंच ने के बाद, हेप्स बफर के 200 माइक्रोन के साथ कक्ष 3x धो लें।
    नोट: ध्यान रखें कि स्थिरीकरण गतिज आकार और शुल्क जैसे लिपोसोम गुणों पर भी निर्भर करते हैं और इस प्रकार हमेशा प्रत्येक लिपोसोम निर्माण के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए।

4. छवि अधिग्रहण

नोट: यह अनुभाग प्रयोग करने वाले शोधकर्ता के लिए उपलब्ध माइक्रोस्कोप प्रणाली पर बहुत कुछ निर्भर करेगा। इस प्रकार, इमेजिंग करने के तरीके पर समग्र दिशानिर्देश वर्णित किए जाएंगे। हालांकि, सटीक सेटिंग्स और उन्हें कैसे लागू करने के लिए विभिन्न माइक्रोस्कोप सेटअप के बीच अलग-अलग होगा। उदाहरण के लिए, कुछ सिस्टम वांछित किसी भी उत्सर्जन फ़िल्टर संयोजन को चुनने की अनुमति देते हैं, जबकि अन्य माइक्रोस्कोप विशिष्ट, पूर्व निर्धारित फिल्टर से लैस होते हैं।

  1. एकल लिपोसोम इमेजिंग के लिए माइक्रोस्कोप स्थापित करें। इष्टतम छवि गुणवत्ता और बाद में डेटा विश्लेषण सुनिश्चित करने के लिए एक उच्च ग्रेस्केल रिज़ॉल्यूशन और एक पिक्सेल योजना का उपयोग करें जो व्यक्तिगत लिपोसोम को ओवरसैंपलिंग करने की अनुमति देता है। 50 माइक्रोन x 50 माइक्रोन क्षेत्र के लिए 16 की थोड़ी गहराई और कम से कम 1,024 x 1,024 पिक्सल की सिफारिश की जाती है। यदि उपलब्ध है, तो लाइन-औसतना लाभकारी रूप से शोर को कम करने के लिए लागू किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, प्रति लाइन 3 स्कैन)।
  2. एक उत्तेजना लेजर शक्ति का चयन करें कि दोनों गैर महत्वपूर्ण फ्रेम-टू-फ्रेम ब्लीचिंग सुनिश्चित करता है और पृष्ठभूमि से व्यक्तिगत लिपोसोम को स्पष्ट रूप से भेदभाव करने के लिए पर्याप्त संकेत मजबूत करता है। इष्टतम सेटिंग विशिष्ट माइक्रोस्कोप के साथ-साथ फ्लोरोफोर संयोजन पर निर्भर करेगी। सुनिश्चित करें कि डिटेक्टरसंतृप्त नहीं हैं, क्योंकि यह तीव्रता मात्रा को पूर्वाग्रह देगा।
  3. लिपोसोम्स में डोप-एटो488 और डोप-एटू655 फ्लोरोफोरस दोनों इमेजिंग के लिए कई चैनलों इमेजिंग की आवश्यकता होती है। इस प्रकार, सुनिश्चित करें कि प्रत्येक चैनल को क्रॉस-उत्तेजना से बचने के लिए क्रमिक रूप से इमेज किया गया है। उदाहरण के लिए, पहले 488 एनएम पर रोमांचक द्वारा एक छवि लें और 495−560 एनएम पर उत्सर्जन पढ़ें। इसके बाद 633 एनएम पर रोमांचक होकर एक और छवि लें लेकिन केवल 660−710 एनएम पर उत्सर्जन पढ़ें। विशेष माइक्रोस्कोप प्रणाली (जैसे, जो लेजर और फिल्टर) उपलब्ध पर निर्भर करेगा।
  4. सतह के विभिन्न क्षेत्रों को कवर करना सुनिश्चित करें, नमूने की कम से कम 10 छवियों को प्राप्त करें, इस प्रकार कम से कम 3,000 व्यक्तिगत लिपोसोम इमेजिंग करें। यदि सतह घनत्व 300 लिपोसोम/फ्रेम से कम है, तो अधिक छवियां प्राप्त करें। हर नई छवि के लिए माइक्रोस्कोप को फिर से फोकस करना सुनिश्चित करें।
    नोट: दो चैनल इमेजिंग के लिए, छवि फ़ाइलों का नाम सुनिश्चित करें ताकि विभिन्न फ्लोरेसेंस चैनलों में एक ही लिपोसोम के साथ छवियों के जोड़े को डेटा विश्लेषण के दौरान आसानी से पहचाना जा सके।
  5. रचनात्मक अमोसिटी के माप से संबंधित प्रायोगिक अनिश्चितता की मात्रा निर्धारित करने के लिए, पुनर्फोकस िंग से पहले और बाद में लिपोसोम ्स के समान क्षेत्र को छवि दें (चित्र 3 और पाठ में विवरण देखें)।
  6. माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर से छवियों को .tiff फ़ाइलों के रूप में निर्यात करें। एक ही लिपोसोम के दो चैनलों को व्यक्तिगत रूप से निर्यात करें।

5. डेटा विश्लेषण

नोट: विशेष रूप से विकसित स्वचालित 2डी गॉसियन फिटिंग दिनचर्या पहले6,11,12को नियोजित किया गया है । हालांकि, विधि की प्रयोज्यता को बढ़ाने के लिए एक डेटा विश्लेषण प्रक्रिया जिसे सभी प्रयोगशालाओं में आसानी से लागू किया जा सकता है, वर्णित है।

  1. फिजी (फिजी है जस्ट इमेजेज) सॉफ्टवेयर में एक ही इमेजिंग क्षेत्र में दो अलग-अलग फ्लोरेसेंस चैनलों की .tiff छवियों की इसी जोड़ी को लोड करें।
  2. इमेज मेनू में, रंगचुनें, और दोनों चैनलों का एक समग्र बनाने के लिए मर्ज चैनल फ़ंक्शन का उपयोग करें।
  3. देखें कि क्या दो अलग-अलग चैनलों में इमेज्ड लिपोसोम अच्छा कोलोकलाइजेशन प्रदर्शित करते हैं या क्या दिखाई देने वाला बहाव हुआ है।
    नोट: दो फ्लोरेसेंस चैनलों के बीच बहाव के मामले में (दोनों चैनलों में सिग्नल के बीच एक व्यवस्थित और बराबर एक्स-वाई ऑफसेट के रूप में पहचाना जाता है), फिजी के छवि मेनू में ट्रांसफॉर्म एंड जीटी; अनुवाद समारोह का उपयोग करके फ्रेम में से एक का अनुवाद किया जा सकता है। हालांकि, इस तरह की छवि हेरफेर के साथ देखभाल की जानी चाहिए। इस प्रकार लिपोसोम ्स को इमेजिंग करते समय जितना संभव हो उतना बहाव से बचने की सिफारिश की जाती है।
  4. सुनिश्चित करें कि कॉमडेट प्लगइन (v.0.3.6.1 या नया) स्थापित किया गया है, या प्लगइन्स मेनू में ऐसा करें।
  5. प्लगइन्स मेनू में जाकर कणों का पता लगाने के लिए कॉमडेट प्लगइन खोलें और कॉमडेट v.0.3.6.1 > डिटेक्शन कणोंका चयन करें ।
  6. ComDet में, दोनों चैनलों पर व्यक्तिगत रूप से कार्य करने वाले कणों का चयन करना सुनिश्चित करें। अनुमानित कणोंके आकार के समान सह-स्थानीयकृत स्थानों के बीच अधिकतम दूरी सेट करें। आमतौर पर यहां वर्णित सेटिंग्स के लिए 4 पिक्सल उपयुक्त होते हैं।
  7. सिग्नल-टू-शोर अनुपात को कम मात्रा में फ्लोरेसेंस के साथ मंद कणों का पता लगाने की अनुमति देनी चाहिए । ComDet में, बहुत मंद कणों (SNR = 3)के लिए दोनों चैनलों में पता लगाने की संवेदनशीलता स्थापित करके 3 करने के लिए इस अनुपात सेट ।
    नोट: हालांकि यह SNR मूल्य आमतौर पर उपयुक्त है, इसे उच्च सेट करना आवश्यक हो सकता है (उदाहरण के लिए, यदि बहुत सारे छवि शोर हैं जिन्हें लिपोसोम के रूप में पहचाना जा सकता है और झूठी सकारात्मकता का कारण बन सकता है)।
  8. सुनिश्चित करें कि दोनोंचैनलों में गणना Colocalization और प्लॉट का पता लगाया कणों के साथ बक्से की जांच कर रहे हैं, ठीक दबाने से पहले ।
  9. विश्लेषण चलाने के बाद, परिणाम और सारांश के साथ दो पॉप-अप खिड़कियां दिखाई देंगी। डेटा टेबल परिणामों का निर्यात करें जिसमें कोलोकलाइजेशन डेटा (कण निर्देशांक और प्रत्येक कण की एकीकृत तीव्रता का पता चला) एक .txt फ़ाइल के रूप में तालिका को सहेजकर और सॉफ्टवेयर में आयात करके पसंद के डेटा हैंडलिंग सॉफ्टवेयर को निर्यात करें।
  10. सुनिश्चित करें कि प्रत्येक लिपोसोम केवल एक बार डेटा सेट में शामिल है और चैनल 1/channel2 दोनों के साथ-साथ channel2/channel1 अनुपात दोनों को शामिल किया गया है । इस प्रकार, डेटा को फ़िल्टर करें ताकि केवल Abs_frame = 1 चरण 5.11 में प्लॉट किया गया है।
    नोट: Colocalized = 1चुनकर, छवियों में शोर से झूठी सकारात्मक विश्लेषण से हटाया जा सकता है । हालांकि, मौजूद दो फ्लोरोसेंट घटकों में से केवल एक के साथ किसी भी लिपोसोम को भी विश्लेषण से बाहर रखा जाएगा, इस प्रकार संभावित रूप से विश्लेषण से महत्वपूर्ण डेटा बिंदुओं को हटा दिया जाएगा।
  11. प्रत्येक पाए गए लाइपोसोम के लिए तीव्रता अनुपात वाले डेटा के साथ कॉलम के एक हिस्टोग्राम को प्लॉट करें।
  12. अध्ययन किए गए लिपोसोमल प्रणाली के लिए रचनात्मक अमोवंशता की डिग्री तीव्रता अनुपात वितरण की चौड़ाई द्वारा दर्शाई जाती है। इनमोसिटी की मात्रा निर्धारित करने के लिए, एक गॉसियन फ़ंक्शन के साथ तीव्रता अनुपात हिस्टोग्राम को फिट करें और मतलब (μ) और मानक विचलन (सिग्मा) निकालें। प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग देखें।
  13. इनमोसिटी की डिग्री (डीआई) के लिए एक मूल्य अब DI = सिग्मा/μ के रूप में परिभाषित भिन्नता के गुणांक का उपयोग करके गणना की जा सकती है ।

6. लिपोसोम आकार अंशांकन

  1. लिपोसोम स्टॉक का हिस्सा लें, और चरण 1.10 में वर्णित 50 एनएम पॉलीकार्बोनेट फिल्टर के माध्यम से 21x को बाहर निकालें।
  2. एक माइक्रोसेंट्रोफ्यूज ट्यूब में सोर्बिटोल बफर के 800 माइक्रोन को लिपोसोम निलंबन के 10 माइक्रोन जोड़कर लिपोसोम्स को पतला करें।
  3. पतला लिपोसोम नमूना को पॉलीप्रोपाइलीन एकल उपयोग क्यूवेट में स्थानांतरित करें।
  4. गतिशील प्रकाश बिखरने (डीएलएस) का उपयोग करके आकार को मापें। लिपोसोम निलंबन के आकार और बहुलता को मापने के लिए कम से कम तीन स्वतंत्र रन का प्रदर्शन करें।
    नोट: यदि आवश्यक हो, तो माप के लिए अधिक केंद्रित लिपोसोम निलंबन का उपयोग करें। लिपोसोम्स के आकार को मापने के लिए डीएलएस (जैसे, नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण) के विकल्प भी लागू किए जा सकते हैं। इस तरह के कण-आकार के निर्धारण को कैसे निष्पादित किया जाए, इसका विवरण इस प्रोटोकॉल के दायरे से बाहर है।
  5. 4.1 और 4.2 चरणों में परिभाषित समान प्रयोगात्मक सेटिंग्स का उपयोग करके माइक्रोस्कोप पर अंशांकन लिपोसोम ्स की छवि दें।
  6. अंशांकन छवियों में प्रत्येक अंशांकन लिपोसोम के लिए एकीकृत तीव्रता निकालें: 5.1−5.10 चरणों में वर्णित लिपोसोम फ्लोरेसेंस तीव्रता वाले फ़िल्टर किए गए परिणाम ों की शीट निकालें। परिणाम तालिका से, "इंटीग्रेटेडइंट" कॉलम निकालें।
  7. क्योंकि इसकी झिल्ली में लेबल किए गए लिपोसोम की कुल एकीकृत तीव्रता लिपोसोम के सतह क्षेत्र के आनुपातिक है और इस प्रकार इसके व्यास के वर्ग के आनुपातिक है, इसकी फ्लोरेसेंस तीव्रता के एक वर्ग रूट तीव्रता हिस्टोग्राम की साजिश करें अंशांकन लिपोसोम्स।
  8. एक लॉग सामान्य वितरण के साथ चरण 6.7 में उत्पादित एकीकृत तीव्रता हिस्टोग्राम को फिट करें और अंशांकन लिपोसोम की औसत फ्लोरेसेंस तीव्रता निकालें।
  9. वर्ग रूट तीव्रता (IntSqrt)और लिपोसोम आकार के बीच संबंध निर्धारित करने के लिए, डीएलएस माप से प्राप्त संख्या से तौला औसत लिपोसोम व्यास (व्यास) का उपयोग करसुधारकारक (सी) की गणना करें: व्यास = सी एक्स IntSqrt सी = व्यास के बराबर है/
  10. रचनात्मक अमोसिटी प्रयोग में लिपोसोम के लिए IntSqrt मूल्यों की गणना करें और सुधार कारक के साथ गुणा करके इन्हें व्यास में परिवर्तित करें।
  11. रचनात्मक अमोसिटी लिपोसोम्स के लिए व्यास के एक समारोह के रूप में तीव्रता अनुपात मूल्य को प्लॉट करें, इस प्रकार लगभग 50 एनएम −800 एनएम से फैले लिपोसोम की आबादी के लिए लिपोसोम आकार के एक समारोह के रूप में अमोटिनेशन को प्राप्त करें।

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Representative Results

वर्णित प्रोटोकॉल का पालन करने से बड़े पैमाने पर समानांतर तरीके से एकल लिपोसोम ्स की छवि बनाना संभव हो जाता है(चित्र 1)। लिपोसोम्स की सफल सतह स्थिरीकरण कक्ष (प्रोटोकॉल में चरण 3.6) के लिपोसोम समाधान को जोड़ने पर तुरंत स्पष्ट होना चाहिए क्योंकि विवर्तन सीमित तीव्रता वाले धब्बे छवि में दिखाई देने चाहिए(चित्र 1बी और चित्रा 1सी)।

अच्छे आंकड़े हासिल करने और परख की उच्च-थ्रूपुट क्षमताओं का फायदा उठाने के लिए, कई हजार लिपोसोम को इमेज किया जाना चाहिए। छवियों की एक उचित संख्या में ऐसा करने के लिए, प्रति फ्रेम 300−400 लिपोसोम के घनत्व को प्राप्त करने के लिए पर्याप्त लिपोसोम को स्थिर करने की सिफारिश की जाती है, क्योंकि यह प्रति नमूना छवियों की संख्या को ~ 10 तक लाएगा, इस प्रकार उन छवियों की संख्या को सीमित करेगा जिन्हें प्राप्त और विश्लेषण किया जाना है। एक कम घनत्व डेटा विश्लेषण को अधिक समय लेने वाली बना देगा, जबकि एक उच्च घनत्व छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के लिए एकल लिपोसोम को अलग करने के लिए चुनौतीपूर्ण बना सकता है। 300−400 लिपोसोम ्स की तरह दिखने का दृश्य छाप पाने के लिए, चित्रा 2एदेखें। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि कुछ अनुप्रयोगों के लिए (उदाहरण के लिए, एक प्रोटीन के साथ झिल्ली-प्रोटीन इंटरैक्शन जो बीएसए सतह के लिए बाध्यकारी मजबूत पृष्ठभूमि को प्रकाश में लाना चाहता है) इसे थोड़ा कम घनत्व का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है, जैसे कि शीर्ष दाईं ओर चित्रा 2ए में।

कभी-कभी, छवियों को प्राप्त करते समय उचित ध्यान में देखने के पूरे क्षेत्र को प्राप्त करना मुश्किल होता है, जैसा कि चित्र ा 2बीमें सचित्र होता है। इस तरह के मुद्दों से संकेत मिल सकता है कि नमूना प्लेट झुकाव है, जो प्लेट से उत्पन्न हो सकता है माइक्रोस्कोप पर नमूना धारक पर ठीक से नहीं रखा जा रहा है । इसके अलावा, यदि लिपोसोम बड़े और धुंधले लगते हैं, तो कक्ष में बफर सुखाया गया होगा और सतह सूख गई हो सकती है। लंबे समय तक इमेजिंग करते समय या आरटी से अधिक तापमान पर माप प्रदर्शन करते समय इस मुद्दे को ध्यान में रखना विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। ठीक से संग्रहीत और बाहर liposomes सूख के बीच अंतर वर्णन करने के लिए, पहले और बाहर चैंबर सुखाने के बाद एक ही नमूने की एक छवि चित्रा 2सीमें दिखाया गया है ।

इष्टतम छवि गुणवत्ता सुनिश्चित करने के बाद, दो इमेजिंग चैनलों में प्रत्येक लिपोसोम के लिए एकीकृत तीव्रता इस प्रोटोकॉल की धारा 5 में चरणों के बाद निकाली जा सकती है। ऐसा करने से अद्वितीय तीव्रता मूल्यों की एक सूची बन जाएगी, जिससे हम प्रत्येक व्यक्ति के लिपोसोम के लिए तीव्रता अनुपात की गणना कर सकेंगे। रचनात्मक अमोजातीयता का मूल्यांकन तीव्रता अनुपात हिस्टोग्राम से किया जाता है, आमतौर पर एक मतलब अनुपात मूल्य(चित्रा 3ए)के आसपास एक गॉसियन वितरण का खुलासा होता है। ध्यान दें कि यदि गॉसियन वितरण से मजबूत विचलन मनाया जाता है(चित्रा 3बी),यह इमेजिंग चैनलों में से कम से कम एक के लिए एक पता लगाने संवेदनशीलता मुद्दे को इंगित करता है, सुझाव है कि एक कमजोर संकेत दिखा liposomes के एक सबसेट बाहर रखा गया है । यह इमेजिंग सिस्टम की पता लगाने की सीमा, या डेटा विश्लेषण में लिपोसोम को छोड़कर (उदाहरण के लिए, एक निश्चित न्यूनतम सीमा लागू करते समय) के कारण हो सकता है; चरण 5.7 देखें)।

प्रोटोकॉल में चरण 5.11−5.13 में वर्णित डीआई मूल्य की गणना करने से तैयारी के व्यक्तिगत लिपोसोम के बीच रचनात्मक अमोटिनेशन का मात्रात्मक उपाय होगा। लिपोसोमल प्रणाली के लिए यहां अध्ययन किया, DI = 0.23 ± 0.01(चित्रा 3सी)। इस मूल्य का उपयोग व्यवस्थित रूप से यह तुलना करने के लिए किया जा सकता है कि अलग-अलग लिपोसोम गुण या तैयारी विधियां रचनात्मक अमोजातीयता को कैसे प्रभावित करती हैं। डीआई मूल्य के अर्थ की अवधारणा करने के लिए, हम तीव्रता अनुपात हिस्टोग्राम द्वारा प्रदर्शित सामान्य वितरण का उल्लेख करते हैं, जिसका अर्थ है कि वे अनुभवजन्य 68-95-99.7 नियम का पालन करेंगे। यह नियम एक आबादी के प्रतिशत का वर्णन करता है जो एक, दो और मतलब मूल्य के आसपास तीन मानक विचलन के भीतर आता है। यहां पाए गए 0.23 ± 0.01 के डीआई मूल्य के लिए, इसका मतलब है कि जनसंख्या में 32% लिपोसोम में तीव्रता अनुपात होगा जो कलाकारों की टुकड़ी के मतलब मोलर अनुपात से 23% से अधिक अलग है(चित्रा 3डी)।

नियंत्रण प्रयोग के लिए पहले और बाद में एक ही liposomes इमेजिंग (धारा 4.6), एक ही डेटा विश्लेषण और वास्तविक प्रयोग के लिए के रूप में साजिश रचने परिणाम किया जाता है। ऐसा करने से डीआई मूल्य की प्रायोगिक अनिश्चितता की मात्रा निर्धारित करने की अनुमति मिलती है, जो डीआईअनिश्चितता = 0.10 ± 0.01(चित्रा 3ई)पाई गई थी। हालांकि डीआईअनिश्चितता मूल्य नियोजित इमेजिंग सिस्टम पर निर्भर करेगा, यह पाया गया कि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप सेटअप लगातार लगभग 0.105,6के डीआईअनिश्चितता मूल्यों को जन्म देते हैं। डीआई = 0.23 ± 0.01 का डीआई मूल्य यहां लिपोसोमल प्रणाली के लिए पाया गया प्रयोगात्मक अनिश्चितता से दोगुना से अधिक है, जो तैयारी के व्यक्तिगत लिपोसोम के बीच महत्वपूर्ण रचनात्मक अमोन्यूजीनकी उपस्थिति का सुझाव देता है।

धारा 6 में वर्णित आकार अंशांकन प्रयोग करने से मनमाने ढंग से लिपोसोम तीव्रता मूल्यों को नैनोमीटर में भौतिक व्यास में बदलने की अनुमति मिलेगी। विधि को अन्य इमेजिंगतकनीकों 25 जैसे क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के खिलाफ मान्य किया गया है, जिसमें नैनोमीटर के आकार के लिपोसोम को ऑप्टिकल रूप से हल करने की क्षमता है, हालांकि बहुत कम थ्रूपुट के साथ। वास्तविक प्रयोगों के लिए उपयोग की जाने वाली सटीक उसी माइक्रोस्कोप सेटिंग्स का उपयोग करके नियंत्रण नमूने को इमेजिंग करना, अब डीएलएस(चित्रा 4ए)द्वारा निर्धारित मतलब लिपोसोम व्यास के लिए मतलब लिपोसोम तीव्रता को सहसंबंधित करना संभव है। अगला कदम लिपोसोम तीव्रता वितरण को चित्रित करना है, जो बेहद छोटे लिपोसोम बनाने के खिलाफ शारीरिक बाधाओं के आधार पर, आमतौर पर एक लॉग सामान्य वितरण(चित्र4बी)प्रदर्शित करेगा। यदि वितरण को लॉग सामान्य वितरण (अक्सर कम तीव्रता वाले मूल्यों के साथ लापता लिपोसोम के कारण) द्वारा वर्णित नहीं किया जाता है, तो इसका मतलब है कि लिपोसोम आबादी का एक हिस्सा डेटा विश्लेषण के दौरान कम माइक्रोस्कोप डिटेक्शन संवेदनशीलता या अत्यधिक सख्त मापदंडों के कारण या तो बाहर रखा गया था(चित्र4सी)। निष्पक्ष डेटा व्याख्या सुनिश्चित करने के लिए इन मुद्दों को पकड़ना और संबोधित करना महत्वपूर्ण है । इसके बाद, चित्रा 4बी में प्रत्येक व्यक्ति के लिपोसोम के लिए तीव्रता मूल्यों को चित्रा 4ए (चित्रा 4डी)में निर्धारित सुधार कारक का उपयोग करके वास्तविक व्यास में परिवर्तित किया जा सकता है। प्रत्येक लिपोसोम के आकार का निर्धारण करने के बाद, व्यास के एक समारोह के रूप में डीआई की जांच अब प्रत्येक व्यक्ति के लिपोसोम(चित्र4ई)के लिए तीव्रता अनुपात बनाम व्यास की साजिश रचकर की जा सकती है। यह फ़नल जैसी डेटा संरचना पहले के निष्कर्षों की पुष्टि करती है कि जब लिपोसोम आकार6कम हो जाता है तो डीआई मूल्य बढ़ जाता है। महत्वपूर्ण बात, एक मतलब मूल्य के आसपास तीव्रता अनुपात के प्रसार में सममित वृद्धि से पता चलता है कि लिपोसोम की औसत संरचना में कोई व्यवस्थित आकार-निर्भर भिन्नता नहीं है।

Figure 1
चित्रा 1: एकल लिपोसोम परख। (A)लिपोसोम्स फ्लोरोसेंटी लेबल लिपिड्स डोप-एटीटो488 और डोप-एटो655 की समतुल्य सामग्री के साथ तैयार किए जाते हैं और बायोटिन/स्ट्रेप्टाविडिन लिंकेज का उपयोग करके बीएसए की सतह पर स्थिर होते हैं । (ख)स्थिर लिपोसोम्स को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके चित्रित किया जाता है, जिससे एकल लिपोसोम से फ्लोरेसेंस तीव्रता का पता लगाने की अनुमति मिल जाती है । स्केल बार = 8 μm.(C)में हरे रंग के क्षेत्र के ज़ूम(बी)दो आसन्न liposomes के लिए सतह तीव्रता साजिश के रूप में चित्रित दो चैनलों के बीच उल्टे फ्लोरोसेंट संकेत प्रदर्शित, रचनात्मक अक्षमता की अवधारणा को दर्शाती है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: अनुकूलन और नुकसान। (A)शीर्ष बाईं ओर 50 माइक्रोन x 50 माइक्रोन फ्रेम में 29 लिपोसोम ्स को स्थिर दिखाता है। लिपोसोम इनमोसिटी की उच्च-थ्रूपुट जांच के लिए संभावना का फायदा उठाने के लिए ये प्रति फ्रेम बहुत कम लिपोसोम हैं। शीर्ष अधिकार प्रति फ्रेम 123 लिपोसोम दिखाता है। यह एक उप-इष्टतम घनत्व है लेकिन यदि कई छवियों का अधिग्रहण किया जाता है तो इसका उपयोग किया जा सकता है। नीचे बाईं ओर प्रति फ्रेम 300−400 लिपोसोम दिखाता है। यह यहां वर्णित प्रोटोकॉल के लिए इष्टतम है। नीचे सही प्रति फ्रेम १,५०० से अधिक liposomes से पता चलता है, जो भी व्यक्तिगत liposomes भेद करने के लिए कई है । वहां एक उच्च जोखिम है कि एक ही स्थान वास्तव में दो liposomes एक ही विवर्तन सीमित स्थान के भीतर स्थिर हो जाएगा । (ख)यदि कक्ष को नमूना धारक में ठीक से नहीं रखा जाता है, तो उचित ध्यान में देखने का पूरा क्षेत्र प्राप्त करना असंभव होगा । बाएं माइक्रोग्राफ में प्लेट ट्रैवर्स एक्सिस के चारों ओर झुक रही है, जिससे निचले बाएं कोने को ध्यान से बाहर किया जा रहा है। सही माइक्रोग्राफ में प्लेट देशीयक्ष धुरी के चारों ओर झुका रही है, जिससे भारी झुकाव को जन्म मिलता है। निचले बाएं और ऊपरी दाएं दोनों कोने फोकस से बाहर हैं । (ग)यदि लंबे समय तक या ऊंचे तापमान पर इमेजिंग बफर वाष्पित हो सकता है, जिससे कक्ष से बाहर सूख ने लग सकता है । हमने इस परिदृश्य को यहां विवरणी को पहले और बाद में कक्ष को 3 मिन के लिए सूखने के लिए छोड़ दिया गया था, और फिर कक्ष में ताजा बफर जोड़कर फिर से गीला कर दिया। परिणामस्वरूप लिपोसोम बड़े, धुंधले होते हैं, कम फ्लोरेसेंस तीव्रता होती है, और प्लेट पर फैलती दिखाई देती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: लिपोसोम रचनात्मक अमोवंशता की मात्रा निर्धारित करने के लिए तीव्रता अनुपात हिस्टोग्राम। (क)प्रत्येक व्यक्ति के लिए डोप-एटो488 और डोप-एटीटो655 फ्लोरेसेंस का तीव्रता अनुपात हिस्टोग्राम के रूप में प्लॉट किया गया । (ख)इमेजिंग के दौरान या डेटा उपचार के कदम में संभावित संवेदनशीलता के मुद्दे को दर्शाते हुए एक छोटा हुआ गॉसियन वितरण । (ग)गॉसियन फ़ंक्शन के साथ तीव्रता हिस्टोग्राम को ढालना डीआई मूल्य की गणना करने के लिए उपयोग किए जाने वाले मतलब और मानक विचलन को निकालना संभव बनाता है। (D)0.23 के डीआई मूल्य का अनुवाद 32% जनसंख्या के 32% तक किया जा सकता है जो कलाकारों की टुकड़ी के मतलब मोलर अनुपात से 23% से अधिक भिन्न है। (ई)नियंत्रण प्रयोग पहले और बाद में एक ही liposomes इमेजिंग और फिर वास्तविक प्रयोग के लिए के रूप में एक ही डेटा उपचार प्रक्रिया प्रदर्शन । यह डीआई क्वांटिफिकेशन के लिए प्रायोगिक त्रुटि निर्धारित करने की अनुमति देता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: एनएम में लिपोसोम तीव्रता को भौतिक व्यास में परिवर्तित करना। (A)अंशांकन कारक निर्धारित करने के लिए डीएलएस डेटा की तुलना में 50 एनएम एक्सट्रूड अंशांकन लिपोसोम ्स की तीव्रता हिस्टोग्राम। (ख)प्रयोगात्मक लिपोसोम से IntSqrt मूल्य का एक हिस्टोग्राम आम तौर पर बहुत छोटे liposomes बनाने के खिलाफ शारीरिक बाधाओं के कारण एक लॉग-सामान्य वितरण पैदा करता है । (ग)एक गैर लॉग-सामान्य IntSqrt मूल्य हिस्टोग्राम या तो पता लगाने संवेदनशीलता के साथ मुद्दों को इंगित करता है या कि छोटे liposomes डेटा उपचार के दौरान बाहर रखा गया था । (D)सुधार कारक का उपयोग करके(बी)में लिपोसोम तीव्रता को वास्तविक लिपोसोम व्यास में परिवर्तित कर दिया जाता है। (ई)लिपोसोम व्यास के एक समारोह के रूप में प्लॉट किए गए प्रत्येक लिपोसोम का तीव्रता अनुपात अब प्रदर्शित किया जा सकता है जिससे लिपोसोम आकार के कार्य के रूप में रचनात्मक अमोजातीयता की जांच की अनुमति दी जा सकती है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि जब तक हम विस्तार से वर्णन करते हैं कि व्यक्तिगत लिपोसोम के बीच रचनात्मक अमोजातीयता का अध्ययन करने के लिए एकल लिपोसोम परख का उपयोग कैसे किया जा सकता है, तो मंच बहुत बहुमुखी है। जैसा कि पहले दिखाया गया था और परिचय में चर्चा की गई थी, प्रोटोकॉल को आसानी से झिल्ली-झिल्ली संलयन, प्रोटीन-झिल्ली इंटरैक्शन, या लिपोसोमल ड्रग कैरियर लक्षण वर्णन के पहलुओं का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। किसी भी वैज्ञानिक सवाल ों को संबोधित किया जा रहा है के लिए, एकल लिपोसोम परख की शक्ति कलाकारों की टुकड़ी के व्यक्तिगत घटकों का पता लगाने की क्षमता में निहित है और इस तरह एक मात्रात्मक readout होने, कलाकारों की टुकड़ी औसत प्रभाव से पक्षपाती नहीं है ।

एकल लिपोसम परख सतह इमेजिंग तौर-तरीकों जैसे कुल आंतरिक प्रतिबिंब या कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के लिए उपयुक्त है, जहां जेड-दिशा अनुभागन लिपोसोम परत के ऊपर समाधान से अवांछित पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस को खत्म कर सकता है। हालांकि, यह पहलू उन अध्ययनों के लिए सबसे महत्वपूर्ण है जहां फ्लोरोसेंटी लेबल यौगिक, जैसे पेप्टाइड्स, प्रोटीन, या अन्य लिपोसोम समाधान में जोड़े जाते हैं और इमेजिंग के दौरान वहां रहते हैं। उदाहरण के लिए, यदि परख का उपयोग यहां विस्तार से वर्णित प्रारूप में किया जाता है, जहां फ्लोरोसेंट रंग स्थिर लिपोसोम तक सीमित हैं, तो परख सैद्धांतिक रूप से अधिक मोटे तौर पर उपलब्ध वाइडफील्ड माइक्रोस्कोप का उपयोग करके किया जा सकता है, जिसका पता लगाया जा सकता है सिस्टम काफी संवेदनशील है।

परख में इस्तेमाल किए जाने वाले लिपोसोम ्स को तैयार करने के लिए उपयोग की जाने वाली विधि के संबंध में एक प्राथमिकताएं नहीं हैं। यहां हम विस्तार से एक फ्रीज सुखाने तकनीक के उपयोग का वर्णन करते हैं । हालांकि, पहले क्लोरोफॉर्म आधारित लिपिड रिहाइड्रेशन या इथेनॉल इंजेक्शन आधारित तकनीकों को परख5,6में इस्तेमाल किए जाने वाले लिपोसोम ्सगढ़ने के लिए नियोजित किया गया है। एक महत्वपूर्ण पैरामीटर पिलिड मिश्रण में बायोटिनी लिपिड के एक मिनट के अंश को शामिल करना है ताकि स्थिरीकरण सुनिश्चित किया जा सके (0.05 मोल% अनुशंसित)। एक अन्य आवश्यक तत्व में थोड़ी मात्रा में फ्लोरोसेंटी लेबल लिपिड शामिल करना है। कुल मिलाकर, लिपिड-डाया की मात्रा को जितना संभव हो उतना कम रखा जाना चाहिए ताकि शमन प्रभाव से बचा जा सके और लिपोसोम के भौतिक रासायनिक गुणों में काफी फेरबदल करने से लिपिड-रंगे से बचा जा सके। लिपिड रंगे की मात्रा की निचली सीमा एकाग्रता द्वारा निर्धारित की जाती है, जहां प्रति लिपोसोम व्यक्तिगत लिपिड रंगों की संख्या में उदासीन भिन्नता लिपिड-रंगों की औसत मात्रा की तुलना में महत्वपूर्ण हो जाती है (एक गहन चर्चा केलिए लार्सन एट अल 6 देखें)। इस सीमा से नीचे जाने से निकाली गई तीव्रता में बड़ी अनिश्चितताएं शुरू होंगी । अंत में, लिपिड रंगे की मात्रा एक अच्छा संकेत करने वाली शोर अनुपात के साथ एकल लिपोसोम का सटीक पता लगाने के लिए पर्याप्त उच्च होने की आवश्यकता है। हालांकि पाठ्यक्रम का यह मापदंड इमेजिंग सिस्टम पर निर्भर करता है, हमने पाया कि 0.05 और 0.5 मोल% के बीच लिपिड रंग सांद्रता मामलों के विशाल बहुमत में अच्छी तरह से काम करती है।

यह चुनने के लिए कि लिपोसोम में शामिल करने के लिए कौन सा लिपिड रंगहै, पहली शर्त यह है कि उत्तेजना और उत्सर्जन गुण इमेजिंग सिस्टम की रोशनी और पता लगाने की क्षमताओं से मेल खाते हैं। दूसरा, हम उच्च क्वांटम पैदावार और फोटोस्थिरता दोनों के साथ रंगों का उपयोग करने की सलाह देने वाली विधि की संवेदनशीलता और सटीकता को बढ़ाने के लिए, और हमने पहले सफलतापूर्वक विभिन्न उत्तेजना तरंगदैर्ध्य6,11के साथ रंगों का सफलतापूर्वक उपयोग किया है। इसी तरह के भौतिक रासायनिक गुणों के साथ लिपिड एंकर चुनने में देखभाल की जानी चाहिए ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि लिपिड विभाजन कृत्रिम रूप से उच्च अमोसिटी का कारण नहीं बनता है। उदाहरण के लिए, इस प्रोटोकॉल के लिए, हमने डोप का उपयोग करके फ्लोरोफोरस दोनों को लंगर डाला है, जबकि डोप पर एक फ्लोरोफोर होने और डीपीपीई पर दूसरा फ्लोरोफोर वितरण विषमताओं को जन्म दे सकता है जो लिपोसोम आबादी में अंतर्निहित इनमोमोसिटी से संबंधित नहीं है। विशेष रूप से दोहरे रंग इमेजिंग के लिए यह संकीर्ण उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के साथ रंगों का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है और महत्वपूर्ण खून के माध्यम से, पार बात, और फ्लोरेसेंस गूंज ऊर्जा हस्तांतरण (FRET) रंगों और चैनलों के बीच से बचने के लिए संभव के रूप में सबसे छोटा स्पेक्ट्रल ओवरलैप । फ्लोरोफोर वातावरण में भिन्नता से संबंधित कलाकृतियों से बचने के लिए हम रंगों के साथ काम करना पसंद करते हैं, जो ह्यूजेस एट अल26द्वारा निर्धारित बेहद कम झिल्ली इंटरैक्शन प्रवृत्ति दिखाने के लिए प्रायोगिक रूप से सिद्ध हुए हैं। अंत में, यदि एक विशिष्ट लिपोसोम लिपिड संरचना प्रायोगिक डिजाइन के लिए एक कठिन आवश्यकता नहीं है, तो यह सुनिश्चित करने के लिए कि व्यक्तिगत लिपोसोम एक दूसरे को पीछे हटाना और कुशलता से एकल लिपोसोम12के रूप में स्थिर हैं, नकारात्मक आवेशित लिपिड के 10 मोल% तक शामिल करना फायदेमंद हो सकता है।

एकल लिपोसम परख का एक लाभ छोटे प्रयोगात्मक मात्रा है, जो प्रति प्रयोग किए जाने वाले महंगे या दुर्लभ यौगिकों की मात्रा को बहुत कम कर सकता है। यहां हम 150-300 माइक्रोन के बीच प्रायोगिक मात्रा के साथ मानक और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कक्षों के उपयोग का वर्णन करते हैं। हालांकि, कस्टम-निर्मित माइक्रोस्कोप कक्ष जो मात्रा को 50-80 माइक्रोन की सीमा तक कम कर सकते हैं, का उपयोग किया जा सकता है। इसके अलावा, लिपोसोम खपत बहुत कम है, जिसमें 2 माइक्रोएम कुल लिपिड के आसपास अंतिम एकाग्रता होती है।

एकल लिपोसोम परख का एक नुकसान यह है कि ऊपर वर्णित स्थिरीकरण प्रवृत्तियों में भिन्नता के कारण कक्ष में लिपिड एकाग्रता को नियंत्रित करना मुश्किल है। इसके अतिरिक्त, झिल्ली-प्रोटीन इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए परख लागू करने के संबंध में, फ्लोरोसेंस तीव्रता से सीधे बाध्य प्रोटीन की एकाग्रता या संख्या निर्धारित करना चुनौतीपूर्ण है।

झिल्ली मॉडल सिस्टम (उदाहरण के लिए, फ्लोरोसेंट यौगिकों, पेप्टाइड्स, या प्रोटीन की झिल्ली बातचीत का अध्ययन करने के लिए) के रूप में परख में लिपोसोम का उपयोग करते समय प्रोटीन घटकों के लिए कम गैर-विशिष्ट बाध्यकारी सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है जो सुविधा प्रदान करता है स्थिरता। यदि यह मामला नहीं है, तो उच्च पृष्ठभूमि संकेत का पता लगाया जा सकता है जो लिपोसोम के लिए विशिष्ट बाध्यकारी का पता लगाने से रोक सकता है। यदि उच्च गैर-विशिष्ट पृष्ठभूमि का पता लगाया जाता है तो हमने पहले स्ट्रेप्टाविडिन से न्यूट्राविडिन या एविडिन में बदलकर पृष्ठभूमि को सफलतापूर्वक कम कर दिया है।

प्रवाह साइटोमेट्री जैसी अन्य तकनीकों का उपयोग करके एकल लिपोसोम डिटेक्शन करने से संभवतः माइक्रोस्कोप आधारित परख की तुलना में एक बढ़ी हुई पहचान थ्रूपुट की पेशकश की जा सकती है। हालांकि, यह देखते हुए कि प्रवाह साइटोमीटर कोशिकाओं की तरह बहुत बड़े और उज्जवल नमूनों का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित कर रहे हैं, सबसे अधिक का पता लगाने प्रणाली काफी संवेदनशील नहीं है एक व्यक्ति liposome से अपेक्षाकृत कमजोर फ्लोरेसेंस का पता लगाने के लिए । इसलिए जबकि नए और अधिक संवेदनशील प्रवाह साइटोमेट्री को विकसित किया जा रहा है माइक्रोस्कोप आधारित परख लिपोसोम इन्मोनेस को स्पष्ट करने के लिए सबसे अच्छा समाधान प्रदान करता है जब कुशलतापूर्वक प्रदर्शन किया जाता है और प्रति प्रयोग हजारों लिपोसोम की निगरानी की जाती है।

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Disclosures

लेखक हितों का कोई टकराव नहीं घोषित करते हैं ।

Acknowledgments

इस काम को डेनिश काउंसिल फॉर इंडिपेंडेंट रिसर्च [ग्रांट नंबर 5054-00165B] द्वारा वित्त पोषित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
8-well microscopy slides (µ slides) Ibidi 80827 Microscopy slides with glass bottom
Avanti Mini Extrusion kit Avanti Polar Lipids 610000 Consumables (Whatman filters) can be aquired from GE Healthcare
BSA Sigma A9418
BSA-Biotin Sigma A8549
Cholesterol Avanti Polar Lipids 700000 Traded trough Sigma
Computer with FIJI (Fiji Is Just ImageJ) ComDet plugin must be installed. Also, a data handling software (Excel, MatLab, OpenOffice, GraphPad Prism etc.) able to load .txt files will be needed to plot the data
DOPE-Atto488 Atto-Tech AD488-165
DOPE-Atto655 Atto-Tech AD655-165
DOPE-PEG-Biotin Avanti Polar Lipids 880129 Traded trough Sigma
D-Sorbitol Sigma S-6021
Freeze-dryer e.g. ScanVac Coolsafe from Labogene
Glass vials Brown Chromatography 150903 Glass vials that can resist snap-freezing in liquid nitrogen. The 8 mL version of the vials has a size that also fits with the syringes of the extrusion kit
HCl Honeywell Fluka 258148
Heating bath Capable of heating to minimum 65 °C
Heating plate with Magnet stirring Capable of heating to minimum 65 °C
HEPES Sigma H3375
Liquid nitrogen Including container for storage, e.g. Rubber-bath
Magnetic stirring bars VWR 442-4520 (EU)
Microcentrifuge tubes 1.5 mL Eppendorf 0030 120.086 (EU)
Microscope For the images in this protocol a Leica SP5 confocal microscope has been used
Na HEPES Sigma H7006
NaCl Sigma S9888
NaOH Honeywell Fluka 71686
POPC Avanti Polar Lipids 850457 Traded trough Sigma
Streptavidin Sigma S4762
tert-Butanol (2-methyl-2-propanol) Honeywell Riedel-de Haën 24127
Ultrapure water e.g. MilliQ

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References

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व्यक्तिगत लिपोसोम्स के बीच रचनात्मक इनमोमोसिटी का पता लगाने के लिए एक मात्रात्मक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी आधारित एकल लिपोसम परख
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Münter, R., Andresen, T. L., Larsen, J. B. A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes. J. Vis. Exp. (154), e60538, doi:10.3791/60538 (2019).

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