Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

En kvantitativ fluorescensmikroskopi-baserad Singelliposomanalys för att detektera sammansättningen av Inhomogeniteten mellan enskilda Lipoer

Published: December 13, 2019 doi: 10.3791/60538
Automatic Translation
1,3, 1,2,3, 1,2,3
1Center for Nanomedicine and Theranostics, Technical University of Denmark, 2Center for Intestinal Absorption and Transport of Biopharmaceuticals, Technical University of Denmark, 3Department of Health Technology, Technical University of Denmark

Summary

Detta protokoll beskriver tillverkningen av liposomer och hur dessa kan immobiliseras på en yta och avbildas individuellt i ett massivt parallellt sätt med fluorescens mikroskopi. Detta gör det möjligt att kvantifiera storleken och sammansättningen ohomogenitet mellan enskilda liposomer av befolkningen.

Abstract

De flesta forskning som sysselsätter liposomer som membran modellsystem eller läkemedel leverans bärare förlitar sig på bulk Läs-ut tekniker och därmed i sig förutsätter att alla liposomer i ensemblen vara identiska. Nya experimentella plattformar som kan observera liposomer på enpartikelnivå har dock gjort det möjligt att utföra mycket sofistikerade och kvantitativa studier av protein-membraninteraktioner eller läkemedelsbärar egenskaper på enskilda liposomer, därmed undvika fel från Ensemble medelvärdes. Här presenterar vi ett protokoll för beredning, detektering och analys av enstaka liposomer med hjälp av en fluorescensbaserad mikroskopi-analys som underlättar sådana enpartikelmätningar. Installationen möjliggör avbildning enskilda liposomer i ett massivt parallellt sätt och används för att avslöja intra-Sample storlek och sammansättning inhomogeneities. Dessutom, protokollet beskriver fördelarna med att studera liposomer på den enda Liposom nivå, begränsningarna av analysen, och de viktiga funktioner som ska beaktas när du ändrar den för att studera andra forskningsfrågor.

Introduction

Liposomer är sfäriska fosfolipidbaserade vesikler som används tungt både i grundläggande och tillämpad forskning. De fungerar som utmärkta membran modellsystem, eftersom deras fysiokemiska egenskaper lätt kan manipuleras genom att variera lipidkomponenterna som utgör Liposom1,2. Också, liposomer utgör den mest använda drogen leverans nanocarrier system, erbjuder förbättrad farmakokinetik och farmakodynamik samt hög biokompatibilitet3.

Under många år har liposomer främst studerats med hjälp av bulktekniker, vilket ger endast tillgång till ensemblernas genomsnittliga Läs-och skrivvärden. Detta har lett till att majoriteten av dessa studier förutsätter att alla liposomer i ensemblen är identiska. Sådana värden i ensemblen är dock bara korrekta om den underliggande datauppsättningen är jämnt fördelad runt medelvärdet, men kan representera en falsk och partisk slutsats om datauppsättningen innehåller flera oberoende populationer, till exempel. Dessutom, förutsatt att ensemblen betyder att representera hela befolkningen kan bortse från den information som hyste inom inhomogeniteten mellan liposomer. Först nyligen har kvantitativa analyser framkommit som kan sond enstaka liposomer, avslöjar stora inhomogenitetsmätningar mellan enskilda liposomer med avseende på viktiga fysikalisk-kemiska egenskaper inklusive Liposom storlek4, lipid sammansättning5,6, och inkapsling effektivitet7, belyser vikten av att studera liposomer på den enda Liposom nivå.

Ett forskningsområde där Ensemble medelvärde av Liposom egenskaper har visat sig bias resultat studerar Liposom storlek beroende protein-membran interaktioner8,9. Traditionellt, forskare som studerar sådana processer har begränsats till att förbereda liposomer med olika Ensemble genomsnittliga diametrar genom extrudering genom filter med olika porstorlek9. Emellertid, extrahera diametern av enskilda liposomer med enda Liposom analyser har avslöjat stora befolknings överlappningar, med liposomer extruderad med 100 nm och 200 nm filter visar upp till 70% överlappning i deras storleksfördelning4. Detta kan allvarligt bias bulk mätningar av Liposom storlek beroende protein-membran interaktioner10. Utföra membran-protein interaktionsstudier med den enda Liposom analysen, forskarna i stället drog fördel av storleken-polydispersitet i provet, så att de kan studera ett brett spektrum av Liposom diametrar inom varje enskilt experiment, att underlätta nya upptäckter av hur membran krökning och sammansättning kan påverka protein rekrytering till membran4,11,12. Ett annat område där tillämpningen av enstaka Liposom analyser har visat sig instrumentella är i mekanistiska studier av protein-medierad membran fusion13,14. För sådana kinetiska mätningar, förmågan att studera enskilda fusions händelser lindras behovet av experimentell synkronisering av fusionsprocessen, vilket möjliggör nya mekanistiska insikter som annars skulle ha försvunnit i den spatiotemporal medelvärdes mätningar som gjorts i bulk ensemble. Dessutom har enstaka liposomer använts som en membran ställning, vilket gör det möjligt att mäta enskilda proteiner och erbjuda ny kunskap om transmembranproteinstrukturdynamik15,16. Dessutom har sådana proteoliposome-baserade uppställningar gjort det möjligt att studera funktionen hos enskilda transmembrantransportörer17 och Porbildande proteinkomplex18 samt mekanismen för bioaktiva membran-permeabiliserande peptider19. Enstaka liposomer har också använts som mjuk materia nanofluidik med utanpåliggande singelliposomer som fungerar som kammare för enzymatiska reaktioner i volymer på 10-19 L, vilket ökar genomflödet och komplexiteten hos screening analyserna med minimal produkt åtgång20.

Nyligen, enstaka Liposom analyser har använts för att karakterisera drogen leverans liposomer på en tidigare unprecenbucklig detaljnivå. Forskarna kunde kvantifiera betydande inhomogenitetsmätningar i mängden polymer fäst vid ytan av enskilda liposomer21. Den enda Liposom analyser tillät också mätningar av läkemedelsleverans liposomer i komplexa medier, såsom blodplasma, avslöjar hur element förankrade till Liposom ytan genom lipid ankare kan vara mottagliga för dissociation när liposomer utsätts för förhållanden imitera de upplevt under in vivo cirkulation22. Sammantaget är mångsidigheten och nyttan av den enda Liposom analyser bekräftas av den stora variation av problem dessa inställningar har använts för att ta itu med, och vi föreställa att metoden kommer att fortsätta att utvecklas och hitta användning i nya vetenskapliga områden.

Här beskriver vi en fluorescensmikroskopi-baserad enda Liposom analys som gör att enskilda liposomer kan studeras i en hög genomströmning sätt (figur 1). För att illustrera metoden använder vi den för att kvantifiera storleken och sammansättningen av inhomogeniteten mellan enskilda liposomer inom en ensemble. Analysen sysselsätter fluorescens Mikroskop avbildning av enskilda liposomer immobiliserade på en passive rad glasyta. Vi beskriver först de kritiska stegen i Liposom tillverkningsprocessen som säkerställer korrekt fluorescerande Liposom märkning och immobilisering. Sedan, vi beskriver den ytbehandling som behövs för att underlätta Liposom immobilisering innan beskriver förfarandet för att säkerställa lämpliga Liposom ytdensiteter. Vi diskuterar mikroskopi parametrar viktigt för att förvärva högkvalitativa bilder och avgränsa hur man utför enkel dataanalys, vilket gör utvinning av Liposom storlek och kompositionella inhomogenitet. Detta generiska protokoll bör ge en god grund för den intresserade forskaren att utveckla analysen ytterligare för hans eller hennes specifika forskningsintresse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Liposom förberedelse

Anmärkning: kortfattat, beredning av liposomer innehåller vanligtvis tre viktiga steg: 1) beredning av torra lipidfilmer av önskad lipidsammansättning; 2) rehydrering av lipider för bildandet av liposomer; och 3) kontrollera storleken och lamellariteten hos Liposom populationen.

  1. Väg ut lipiderna och lös upp dem i tert-butanol: vatten (9:1) i injektionsflaskor av glas.
    1. Lös POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-fosfokolin; MW = 760 g/mol) till 50 mM.
    2. Lös upp kolesterol (MW = 387 g/mol) till 25 mM.
    3. Lös upp DOPE-Atto488 (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoetanolamin-Atto488; MW = 1 316 g/mol) till 0,1 mM.
    4. Lös upp DOPE-Atto655 (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoetanolamin-Atto655; MW = 1 368 g/mol) till 0,1 mM.
    5. Lös DSPE-PEG2000-biotin (1,2-distearyl-sn-glycero-3-phosphatetanolamin-N-[biotinyl (polyetylenglykol)-2000]; MW = 3 017 g/mol) till 0,1 mM.
      Anmärkning: Värmelipider till 55 ° c och Använd magnetisk omrörning för att säkerställa fullständig upplösning av lipider. Alternativt, Använd en ultraljudsbehandling bad. Oanvända lipidbestånd kan förvaras vid-20 ° c i flera månader.
  2. Blanda lipidlagren bereds i steg 1,1 till en molar förhållandet mellan POPC: kolesterol: DOPE-Atto488: DOPE-Atto655: DOPE-PEG-biotin 68.95:30:0.5:0.5:0.05, genom att lägga till 138 μL av POPC, 120 μL av kolesterol, 500 μL av varje Fluorescent märkt lipid, och 50 μL av DSPE-PEG-biotin till en fräsch injektionsflaska av glas.
    Obs: den exakta Liposom sammansättningen kan lätt ändras för att ta itu med den specifika frågan av intresse. Mer information finns i diskussionen.
  3. Lossa locket på injektionsflaskan med glas och Snap-frys injektionsflaskan i flytande kväve.
  4. Frystorkade den frysta lipidblandningen över natten.
  5. Tillsätt 1 mL 200 mM D-sorbitol buffert (sorbitol buffert) till de torra lipider.
  6. Värm blandningen till 45 ° c och utsätt den för magnetisk omrörning i minst 1 h.
    Anmärkning: bufferten bör återspegla den specifika fråga som behandlas (t. ex. fysiologiska förhållanden för att studera membran-proteininteraktioner, eller en specifik kliniskt godkänd buffert för att studera läkemedelsinducerad liposomer). Emellertid, om en specifik buffert inte krävs för studien, en buffert utan joner kan appliceras för rehydrering för att minska multilamellariteten av liposomer.
  7. Frys fett suspensionen genom att doppa injektionsflaskan i flytande kväve och vänta tills suspensionen är helt fryst.
  8. Doppa den frysta suspensionen i ett värmebad vid 55 ° c tills blandningen är helt tinade.
  9. Upprepa steg 1,7 och 1,8 tills den Liposom suspensionen har exponerats för totalt 11 frys/Tina cykler.
    Obs: upprepad frysning/Tina cykler har visat sig minska Liposom multilamellaritet23, vilket är av största vikt för riktigheten av den enda Liposom analysen, som multilamellära liposomer kommer att skeva fluorescensintensiteten kontra Liposom storleksförhållande av liposomer. Den multilamellariteten är oftast till sin natur låg när de omfattar mer än 0,5% pegylerad lipid i formuleringen (såsom vanligen gjort i liposomer för läkemedelsleverans)24.
  10. Extrudera den Liposom suspensionen en gång genom en 800 nm polykarbonat filter med en mini extrudering kit. Följ tillverkarens anvisningar för montering av extrudering Kit (se tabell över material).
  11. Förvara liposomerna vid 4 ° c över natten.

2. ytbehandling av bild kammaren

  1. Förbered bovint serum albumin (BSA; 1 mg/ml), BSA-biotin (1 mg/ml) och konjugerat (0,025 mg/ml) i 10 mm Hepes (4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineetanesulfonic acid) 95 mm NaCl buffert (Hepes buffert).
    Anmärkning: för att förhindra liposomalt burst, bör den sorbitol buffert som används för rehydrering och HEPES buffert som används för ytbehandling vara isotonisk. Det rekommenderas därför att kontrollera osmolaritet av buffertar före experimentet.
  2. Blanda 1 200 μL BSA och 120 μL av BSA-biotin och tillsätt 300 μL av blandningen till varje brunn i en 8 väl bild för mikroskopi.
    Obs: här använder vi en kommersiellt tillgänglig 8 väl Mikroskop glida med en glasbotten (se tabell över material), men protokollet kan lätt anpassas till anpassade Mikroskop kammare.
  3. Inkubera bilden i 20 minuter vid rumstemperatur (RT).
  4. Tvätta bilden 8x med 300 μL HEPES buffert.
    Obs: var noga med att inte lämna brunnar utan buffert i mer än ett par sekunder, som torkar ut ytan kommer att skada den. Dessutom, var noga med att inte repa ytan med pipettspetsen eftersom detta också kommer att skada den. Sålunda, när aspirera buffert från en brunn, gör den från Egg eller hörn.
  5. Tillsätt 250 μl konjugerat och inkubera i 10 minuter vid RT.
  6. Upprepa de 8 tvättningar som beskrivs i steg 2,4.
  7. Förvara Mikroskop glaset med 300 μL sorbitol buffert i varje brunn vid 4 ° c. Avdunstning av lösningsmedlet kommer att skada ytan, så Lägg Mikroskopbilden i en petriskål och försegla den med parafilm om inte den förberedda bilden används omedelbart.

3. Liposom immobilisering

  1. Späd Liposom suspensionen till ca 20 μM total lipid i sorbitol buffert. Förfarandet i avsnitt 1 kommer att ge en Liposom suspension av cirka 10 mM total lipid.
  2. Placera bilden på mikroskopet och fokusera på ytan av kammaren med hjälp av den ökade laser reflektions signalen från glaset/buffertgränssnittet som en guide.
  3. Tvätta kammaren 4x med 300 μL färsk HEPES buffert.
  4. Tillsätt 10 μL utspädd Liposom lager (20 μM total lipid) till ett microcentrifugerör.
  5. Ta ut 100 μL buffert från kammaren, tillsätt microcentrifugeröret som bereds i steg 3,4, blanda ordentligt och sätt tillbaka 110 μL i kammaren.
  6. Sätt preparatet under mikroskopet, och använda en rudimental Mikroskop inställning kan upptäcka signalen från Liposom fluorophore (s) att observera liposomer immobiliseras på ytan.
  7. Sikta på en Liposom ytdensitet som är samtidigt glest nog att identifiera enskilda liposomer och täta nog att det underlättar hög genomströmning mätningar. Typiskt med ett 50 μm x 50 μm synfält är 300 − 400 liposomer per bildruta optimalt (figur 2). Detta kan vanligtvis uppnås inom 5 − 10 min.
    Anmärkning: om endast snabbt rörliga fluorescerande partiklar upptäcks inom synfältet kan en frånvaro eller för låg koncentration av någon av komponenterna som är kritisk för immobiliseringsprocessen (BSA-biotin, streptavidin, DOPE-PEG-biotin) vara orsaken. Om inga liposomer upptäcks kan det antingen vara relaterat till en låg koncentration av liposomer, olämpliga inställningar för fluorescensdetektion, eller potentiellt avbildning med ett fokalplan inte på glasytan.
  8. När en lämplig Liposom ytdensitet uppnås, tvätta kammaren 3x med 200 μL av HEPES buffert.
    Obs: Tänk på att immobilisering kinetik också bero på Liposom egenskaper såsom storlek och laddning och bör därför alltid vara optimerad för varje Liposom formulering.

4. bild förvärv

Obs: detta avsnitt kommer att bero mycket på Mikroskop systemet tillgängliga för forskaren utför experimentet. Övergripande riktlinjer för hur avbildning ska utföras beskrivs därför. De exakta inställningarna och hur de ska appliceras varierar dock mellan olika Mikroskop inställningar. Vissa system tillåter till exempel att välja vilken kombination av utsläpps filter som önskas, medan andra Mikroskop är utrustade med specifika, förinställda filter.

  1. Ställ in mikroskopet för avbildning enstaka liposomer. För att säkerställa optimal bildkvalitet och efterföljande dataanalys Använd en hög gråskala upplösning och en pixel schema som gör det möjligt för översampling enskilda liposomer. Ett bitdjup på 16 och minst 1 024 x 1 024 pixlar för ett område på 50 μm x 50 μm rekommenderas. Om det är tillgängligt kan linje medelvärdet användas för att minska brus (t. ex. 3 skanningar per linje).
  2. Välj en excitation lasereffekt som både garanterar icke-signifikanta ram-till-Frame blekning och stark nog signal att tydligt diskriminera enskilda liposomer från bakgrunden. Den optimala inställningen beror på det specifika Mikroskop som används samt fluorophore-kombinationen. Kontrollera att detektorerna inte är mättade eftersom detta kommer att kvantifiera bias intensitet.
  3. Imaging både DOPE-Atto488 och DOPE-Atto655 fluorophores i liposomer kräver Imaging flera kanaler. Således, se till att varje kanal är avbildad sekventiellt för att undvika Cross-excitation. Till exempel, först ta en bild av spännande på 488 nm och avläsning utsläpp vid 495 − 560 nm. Därefter, ta en annan bild av spännande på 633 nm men avläsning utsläpp endast vid 660 − 710 nm. Detaljerna kommer att bero på Mikroskop systemet (t. ex., vilka lasrar och filter) tillgängliga.
  4. Se till att täcka olika delar av ytan, förvärva minst 10 bilder av provet, alltså avbildning minst 3 000 individuella liposomer. Om ytdensiteten är lägre än 300 liposomer/ram, få fler bilder. Se till att omfokusera mikroskopet för varje ny bild.
    Obs: för två-kanals avbildning, se till att namnge bildfiler så att par av bilder med samma liposomer i olika fluorescenskanaler kan lätt identifieras under dataanalys.
  5. För att kvantifiera den experimentella osäkerheten i samband med mätningen av inhomogeniteten hos kompositionernas sammansättning, bild samma område av liposomer före och efter omfokusering (se figur 3 och beskrivning i texten).
  6. Exportera bilderna från Mikroskop programvaran som. TIFF-filer. Exportera de två kanalerna i samma liposomer individuellt.

5. analys av data

Observera: specialutvecklade automatiserade 2D Gaussiska monterings rutiner har tidigare använts6,11,12. Men för att öka tillämpligheten av metoden beskrivs en dataanalys process som enkelt kan implementeras i alla laboratorier.

  1. Ladda motsvarande par. TIFF-bilder av två olika fluorescenskanaler i samma bild fält i FIJI (FIJI är bara ImageJ) programvara.
  2. I bild -menyn väljer du färgoch använder funktionen sammanfoga kanal för att skapa en sammansatt av de två kanalerna.
  3. Observera om liposomerna avbildas i två olika kanaler visar god colocalization eller om synlig drift inträffade.
    Anmärkning: vid drift mellan de två fluorescenskanalerna (erkänd som en systematisk och lika X-Y-förskjutning mellan signalen i de två kanalerna) kan en av ramarna översättas med funktionen omvandla ≫ Översätt i Fijis bild meny. Dock bör försiktighet iakttas med sådan bildmanipulering. Det rekommenderas därför att istället undvika drift så mycket som möjligt vid avbildning av liposomer.
  4. Se till att ComDet plugin (v. 0.3.6.1 eller nyare) är installerad, eller gör detta i plugins menyn.
  5. Öppna ComDet plugin för att upptäcka partiklar genom att gå till plugins menyn och välja comDet v. 0.3.6.1 > upptäcka partiklar.
  6. I ComDet, se till att välja detektera partiklar på båda kanalerna individuellt funktion. Ställ in Max avståndet mellan Co-lokaliserade fläckar som liknar den ungefärliga partiklar storlek. Vanligtvis är 4 pixlar lämpligt för de inställningar som beskrivs här.
  7. Signal-brus-förhållandet bör möjliggöra detektering av även dim partiklar med en låg mängd fluorescens. I ComDet, ställa in detta förhållande till 3 genom att ställa in känsligheten för detektering i båda kanalerna till mycket dim partiklar (SNR = 3).
    Obs: även om detta SNR värde är vanligtvis lämpligt, kan det vara nödvändigt att ställa in den högre (t. ex. om det finns en hel del bild brus som kan identifieras som liposomer och leda till falska positiva).
  8. Se till att rutorna med Beräkna colocalization och Plot upptäckta partiklar i båda kanalerna kontrolleras, innan du trycker på OK.
  9. Efter att ha kört analysen kommer två popup-fönster med resultat och Sammanfattning att visas. Exportera datatabellens resultat som innehåller colocalization-data (partikel koordinater och integrerad intensitet för varje partikel som upptäcks) till ett val av datahanteringsprogram genom att spara tabellen som en. txt-fil och importera den till programvaran.
  10. Se till att varje Liposom endast ingår en gång i datauppsättningen och inte både channel1/channel2 samt channel2/channel1 ratio. Därför filtrera data så att endast Abs_frame = 1 ritas i steg 5,11.
    ANMÄRKNINGAR: genom att välja Colokaliserade = 1, falska positiva från brus i bilderna kan tas bort från analysen. Men alla liposomer med endast en av de två fluorescerande komponenterna som finns kommer också att uteslutas från analysen och därmed potentiellt ta bort viktiga datapunkter från analysen.
  11. Rita ett histogram av kolumnen med data som innehåller intensiteten förhållandet för varje detekterad Liposom.
  12. Graden av sammansättning inhomogenitet för den studerade liposomalt system representeras av bredden av intensiteten förhållandet fördelning. För att kvantifiera inhomogeniteten, montera intensitetsförhållandet histogram med en Gaussisk funktion och extrahera medelvärdet (μ) och standardavvikelse (Sigma). Se avsnittet representativa resultat.
  13. Ett värde för graden av inhomogenitet (DI) kan nu beräknas med hjälp av koefficienten för variation definierad som DI = Sigma/μ.

6. Liposom storlek kalibrering

  1. Ta ut en del av Liposom beståndet, och extrudera 21x genom ett 50 nm polykarbonatfilter som beskrivs i steg 1,10.
  2. Späd liposomerna genom att tillsätta 10 μL av den Liposom suspensionen till 800 μL av sorbitol-bufferten i ett microcentrifugerör.
  3. Överför den utspädda Liposom provet till en polypropylen engångsanvändning Cuvette.
  4. Mät storleken med dynamisk ljusspridning (DLS). Utföra minst tre oberoende körningar för att mäta storlek och polydispersitet av Liposom suspensionen.
    Obs: om nödvändigt, Använd en mer koncentrerad Liposom suspension för mätningen. Alternativ till DLS (t. ex. nanopartikel spårningsanalys) kan också användas för att mäta storleken på liposomerna. En beskrivning av hur man utför en sådan bestämning av partikelstorlek ligger utanför tillämpningsområdet för detta protokoll.
  5. Bild kalibrerings liposomer på mikroskopet med exakt samma experimentella inställningar som definieras i steg 4,1 och 4,2.
  6. Extrahera den integrerade intensiteten för varje kalibrerings Liposom i kalibrerings bilderna: extrahera det filtrerade resultat bladet som innehåller Liposom fluorescens-intensiteter enligt beskrivningen i steg 5.1 − 5.10. Extrahera kolumnen "IntegratedInt" från resultattabellen.
  7. Eftersom den totala integrerade intensiteten av en Liposom är märkt i dess membran är proportionell mot ytan av Liposom och är därmed proportionell mot kvadraten på dess diameter, rita en kvadrat rotintensitet histogram av fluorescensintensitet av kalibrerings liposomer.
  8. Passa in den integrerade intensiteten histogram som produceras i steg 6,7 med en logg normalfördelning och extrahera den genomsnittliga fluorescensintensiteten av kalibrerings liposomer.
  9. För att bestämma förhållandet mellan kvadratroten intensitet (intsqrt) och Liposom storlek, Beräkna korrektionsfaktorn (C) med hjälp av den genomsnittliga Liposom diameter (dia) vägs av det antal som erhålls från DLS mätningar: dia = c x intsqrt motsvarar C = dia/intsqrt.
  10. Beräkna intsqrt värden för liposomer i sammansättningen inhomogenitet experiment och omvandla dessa till diametrar genom att multiplicera med korrektionsfaktorn.
  11. Plotta intensitetsförhållandet som en funktion av diametern för kompositionernas inhomogenitetliposomer, och därmed uppnå inhomogeniteten som en funktion av Liposom storlek för en population av liposomer som spänner från cirka 50 nm − 800 nm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Efter det beskrivna protokollet gör det möjligt att avbilda enstaka liposomer på ett massivt parallellt sätt (figur 1). Den framgångsrika ytan immobilisering av liposomer bör omedelbart framgå vid tillsats av Liposom lösning till kammaren (steg 3,6 i protokollet) som diffraktion begränsad intensitet fläckar bör visas i bilden (figur 1B och figur 1C).

För att uppnå bra statistik och utnyttja den höga genomströmningen förmågor av analysen, flera tusen liposomer bör avbildas. För att göra detta i ett rimligt antal bilder, det rekommenderas att immobilisera tillräckligt liposomer för att uppnå en densitet på 300 − 400 liposomer per ram, eftersom detta kommer att föra antalet bilder per prov ner till ~ 10, vilket begränsar antalet bilder som måste förvärvas och analyseras. En lägre densitet kommer att göra dataanalysen mer tidskrävande, medan en högre densitet kan göra det utmanande för bildanalysprogram vara för att skilja enskilda liposomer. För att få ett visuellt intryck av hur 300 − 400 liposomer ser ut, se figur 2a. Det bör dock noteras att för vissa tillämpningar (t. ex. membran-proteininteraktioner med ett protein som tenderar att framkalla stark bakgrunds bindning till BSA yta) rekommenderas att använda en något lägre densitet, såsom i figur 2a längst upp till höger.

Ibland, när du skaffar bilder är det svårt att få hela synfält i rätt fokus, som illustreras i figur 2B. Sådana problem kan tyda på att prov plattan lutar, vilket kan uppstå om plattan inte placeras ordentligt på preparathållaren på mikroskopet. Också, om liposomerna verkar stora och suddiga, kan bufferten i kammaren ha avdunrat och ytan torkat ut. Det är särskilt viktigt att ha denna fråga i åtanke vid bildtagning under långa tidsperioder eller vid mätningar vid högre temperaturer än RT. För att illustrera skillnaden mellan korrekt lagrade och torkade liposomer visas en bild av samma prov före och efter torkning av kammaren i figur 2C.

Efter att ha säkerställt optimal bildkvalitet kan den integrerade intensiteten för varje Liposom i de två bild kanalerna extraheras enligt stegen i avsnitt 5 i detta protokoll. Att göra detta kommer att skapa en lista med unika intensitetsvärden, så att vi kan beräkna intensiteten förhållandet för varje enskild Liposom. Sammansättningen inhomogenitet utvärderas från intensitet förhållandet histogram, typiskt avslöjar en Gaussisk fördelning runt ett medelvärde värde (figur 3a). Observera att om starka avvikelser från en Gaussisk fördelning observeras (figur 3B), indikerar det en detektions känslighets fråga för minst en av bild kanalerna, vilket tyder på att en delmängd av liposomer som uppvisar en svagare signal har exkluderats. Detta kan bero på både detektionsgränsen för avbildnings systemet, eller exklusive liposomer i dataanalysen (t. ex. vid tillämpning av ett visst minimitröskelvärde, se steg 5,7).

Beräkning av DI-värdet enligt beskrivningen i steg 5.11 − 5.13 i protokollet kommer att ge ett kvantitativt mått på sammansättningen av inhomogeniteten mellan preparatets individuella liposomer. För det liposomala systemet studeras här, DI = 0,23 ± 0,01 (figur 3C). Detta värde kan användas för att systematiskt jämföra hur varierande Liposom egenskaper eller beredningsmetoder påverkar sammansättningen inhomogenitet. För att konceptualisera innebörden av DI-värdet, hänvisar vi till den normala fördelningen visas av intensitet förhållandet histogram, vilket innebär att de kommer att lyda den empiriska 68 -95-99,7 regeln. Den här regeln beskriver procentandelen av en population som ligger inom en, två och tre standardavvikelser runt medelvärdet. För DI-värdet på 0,23 ± 0,01 som finns här, betyder det att 32% av liposomerna i populationen kommer att ha ett intensitetsförhållande som avviker med mer än 23% från den genomsnittliga molar kvoten av ensemblen (figur 3D).

För kontroll experimentet avbildning samma liposomer före och efter omfokusering (avsnitt 4,6), samma dataanalys och resultat plottning som för själva experimentet utförs. Detta gör det möjligt att kvantifiera den experimentella osäkerheten i DI-värdet, som konstaterades vara DI-osäkerhet = 0,10 ± 0,01 (figur 3E). Även om disosäkerhets värde kommer att bero på det använda avbildnings systemet konstaterades det att konfokala Mikroskop uppställningar konsekvent ger upphov till di-osäkerhets värden på cirka 0,105,6. DI-värdet av DI = 0,23 ± 0,01 hittades för liposomalt system här är mer än dubbelt så experimentell osäkerhet, vilket tyder på närvaron av betydande sammansättning ohomogenitet mellan de enskilda liposomer preparatet.

Genom att utföra storleks kalibrerings experimentet som beskrivs i avsnitt 6 kan de godtyckliga Liposom intensitetsvärdena omvandlas till fysiska diametrar i nanometrar. Metoden har validerats mot andra avbildningstekniker25 såsom kryogen elektronmikroskopi, som har en förmåga att optiskt lösa nanometer-sized liposomer, men med mycket lägre genomströmning. Avbildning av kontrollprovet med exakt samma Mikroskop inställningar som används för de faktiska experimenten är det nu möjligt att korrelera medelvärdet för Liposom intensitet till den genomsnittliga Liposom-diametern som bestäms av DLS (figur 4a). Nästa steg är att skildra Liposom intensitet fördelning, som bygger på de fysiska begränsningarna mot att skapa extremt små liposomer, typiskt kommer att visa en logg normalfördelning (figur 4B). Om distributionen inte är väl beskrivna av en logg normalfördelning (oftast på grund av saknade liposomer med låg intensitet värden) det innebär att en del av Liposom populationen exkluderades antingen på grund av låg Mikroskop detektionskänslighet eller alltför strikta parametrar under dataanalys (figur 4C). Det är viktigt att fånga upp och ta itu med dessa frågor för att säkerställa opartisk data tolkning. Därefter kan intensitetsvärdena för varje enskild Liposom i figur 4B konverteras till faktiska diametrar med hjälp av korrektionsfaktorn som bestäms i figur 4a (figur 4D). Efter bestämning av storleken på varje Liposom, DI som en funktion av diametern kan nu undersökas genom plottning intensiteten förhållandet kontra diameter för varje enskild Liposom (figur 4E). Denna tratt-liknande datastruktur bekräftar tidigare fynd att DI-värdet ökar när Liposom storlek minskar6. Det är viktigt att den symmetriska ökningen av spridningen av intensitetskvoterna runt ett medelvärde tyder på att det inte finns någon systematisk storleksberoende variation i den genomsnittliga sammansättningen av liposomer.

Figure 1
Figur 1: den enda Liposom analysen. (A) liposomer är formulerade med en ekvimolära halt av fluorescerande märkta lipider Dope-Atto488 och Dope-Atto655 och immobiliseras på en BSA yta med hjälp av en biotin/streptavidin länkage. (B) de immobiliserade liposomerna avbildas med hjälp av ett konfokalmikroskop, vilket möjliggör detektion av fluorescensintensiteterna från de enskilda liposomerna. Skalstreck = 8 μm. (C) zoom av det gröna området i (B) avbildad som ytintensitet för två angränsande liposomer som visar inverterad fluorescerande signal mellan de två kanalerna, vilket illustrerar begreppet kompositions inhomogenitet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: optimering och fallgropar. (A) den övre vänstra visar 29 liposomer immobiliserade i en 50 μm x 50 μm ram. Dessa är för få liposomer per ram för att utnyttja möjligheten för hög genomströmning utredning av liposominhomogenitet. Uppe till höger visas 123 liposomer per ram. Detta är en suboptimala densitet men kan användas om många bilder förvärvas. Längst ner till vänster visas 300 − 400 liposomer per ram. Detta är optimalt för det protokoll som beskrivs här. Den nedre högra visar mer än 1 500 liposomer per ram, som är för många för att skilja enskilda liposomer. Det finns en hög risk att en enda plats faktiskt kommer att vara två liposomer immobiliserade inom samma diffraktion begränsad plats. Bom kammaren inte placeras ordentligt i preparathållaren, är det omöjligt att få hela synfältet i rätt fokus. I den vänstra Mikrograf plattan lutar runt Traverse axeln, vilket ger upphov till det nedre vänstra hörnet är ur fokus. I den högra mikrografen lutar plattan runt den längsgående axeln, vilket ger upphov till en tyngre lutning. Både nedre vänstra och övre högra hörnet är ur fokus. C) om avbildning för långa tidsperioder eller vid förhöjda temperaturer kan bufferten avdunstning, vilket leder till uttorkning ur kammaren. Vi illustrerade detta scenario här genom att avbilda liposomer före och efter kammaren lämnades att torka i 3 min, och sedan rewetted genom att tillsätta färsk buffert till kammaren. De resulterande liposomerna är större, suddiga, har lägre fluorescens intensitet, och verkar vara utspridda på plattan. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: intensitetsförhållandet histogram för kvantifiering av Liposom kompositions inhomogenitet. (A) intensitetsförhållandet mellan Dope-Atto488 och Dope-Atto655 fluorescens för varje enskild Liposom plottas som ett histogram. Ben trunkerad Gaussisk fördelning som illustrerar en potentiell känslighets fråga, antingen under avbildning eller i databehandlings steget. (C) om du monterar intensiteten histogram med en Gaussisk funktion gör det möjligt att extrahera medelvärdet och standardavvikelsen som används för att beräkna di-värdet. Dett di-värde på 0,23 kan översättas till 32% av befolkningen som avviker med mer än 23% från den genomsnittliga molar kvoten för ensemblen. (E) kontroll experiment avbildning samma liposomer före och efter omfokusering och sedan utföra samma databehandlingsförfarande som för själva experimentet. Detta gör det möjligt att fastställa försöks felet för DI-kvantifieringen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: omvandla Liposom intensitet till fysisk diameter i nm. Aintensitet histogram över 50 nm extruderad kalibrerings liposomer jämfört med DLS data för att bestämma kalibreringsfaktorn. (B) ett histogram av intsqrt värde från den experimentella liposomer ger vanligtvis en log-normalfördelning på grund av de fysiska begränsningarna mot att skapa mycket små liposomer. (C) ett icke-log-normalt intsqrt -värde histogram indikerar antingen problem med detektionskänslighet eller att små liposomer exkluderades under databehandling. D) Liposom intensitet iBomvandlas till faktiska fett diametrar med hjälp av korrektionsfaktorn. (E) intensiteten för varje Liposom plottas som en funktion av Liposom diameter kan nu visas så att utredningen av sammansättningen inhomogenitet som en funktion av Liposom storlek. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det är viktigt att notera att medan vi beskriver i detalj hur den enda liposomer analysen kan användas för att studera sammansättningen inhomogenitet mellan enskilda liposomer, plattformen är mycket mångsidig. Som tidigare visats och diskuterats i inledningen, kan protokollet lätt anpassas för att studera aspekter av membran-membran fusion, protein-membran interaktioner, eller liposomalt drog bärare karakterisering. För alla vetenskapliga frågor som tas upp, kraften i den enda Liposom analysen ligger i förmågan att upptäcka de enskilda komponenterna i ensemblen och därmed ha en kvantitativ avläsning, inte partisk av Ensemble medelvärdes effekter.

Den enda Liposom analysen är optimalt lämpad för ytan Imaging modaliteter såsom total inre reflektion eller konfokal Mikroskop, där Z-riktning snittning kan eliminera oönskade bakgrundsfluorescens från lösningen ovanför Liposom skiktet. Emellertid, denna aspekt är viktigast för studier där överföras märkta föreningar, såsom peptider, proteiner, eller andra liposomer läggs till lösningen och förbli där under Imaging. Till exempel, om analysen används i det format som beskrivs i detalj här, där fluorescerande färgämnen är begränsade till immobiliserade liposomer, kan analysen i princip utföras med hjälp av mer allmänt tillgängliga widefield Mikroskop, vilket ger detektion systemet är tillräckligt känsligt.

A priori finns det inga begränsningar med avseende på den metod som används för att bereda de liposomer som används i analysen. Här beskriver vi i detalj användningen av en frystorkning teknik. Men tidigare kloroform-baserade lipidrehydrering eller etanol injektion-baserade tekniker har använts för att fabricera liposomer som används i analysen5,6. En kritisk parameter är införandet av en minut fraktion av biotinylerade lipider i lipidblandningen för att säkerställa immobilisering (0,05 mol% rekommenderas). En annan nödvändig faktor är att inkludera en liten mängd överföras märkta lipid. Sammantaget bör mängden lipidfärg som tillsätts hållas så låg som möjligt för att både undvika kylnings effekter och för att undvika att lipidfärgen avsevärt förändrar de fysikalisk-kemiska egenskaperna hos Liposomen. Den nedre gränsen för mängden lipidfärg anges av koncentrationen, där den stokastiska variationen i antalet enskilda lipidfärgämnen per Liposom blir betydande jämfört med den genomsnittliga mängden lipidfärger (se Larsen et al.6 för en djupgående diskussion). Att gå under denna gräns kommer att introducera stora osäkerhetsfaktorer i de extraherade intensiteterna. Slutligen, mängden lipidfärg måste vara tillräckligt hög för noggrann detektion av den enda liposomer med en bra signal-brus-förhållande. Även om detta kriterium naturligtvis starkt beror på avbildnings systemet, fann vi att lipidfärgningskoncentrationer mellan 0,05 och 0,5 mol% fungerar bra i de allra flesta fall.

För att välja vilken lipidfärg att inkludera i Liposom, är den första förutsättningen att excitation och utsläpp egenskaper matchar belysningen och detekteringsförmåga av avbildnings systemet. För det andra, för att öka känsligheten och noggrannheten av den metod vi rekommenderar att använda färgämnen med både hög Quantum avkastning och foto stabilitet, och vi har tidigare framgångsrikt använt färgämnen med olika excitation våglängder6,11. Försiktighet bör iakttas vid val av lipid ankare med liknande fysikalisk-kemiska egenskaper för att säkerställa att lipid partitionering inte leder till artificiellt hög ohomogenitet. Till exempel, för detta protokoll, vi har förankrat både fluoroforer med hjälp av knark, samtidigt som en fluorophore på knark och en annan på DPPE kan leda till fluorophore distribution heterogeniteter som inte är relaterade till den inneboende ohomogenitet i Liposom befolkningen. Speciellt för Dual Color Imaging är det viktigt att välja färgämnen med smala excitation och emissions spektra och den minsta spektrala överlappningen som möjligt för att undvika betydande utfallande, Cross Talk, och fluorescens resonans energiöverföring (FRET) mellan färgämnen och kanaler. För att undvika artefakter relaterade till variation i fluorophore miljön vi föredrar att arbeta med färgämnen, som har bevisats experimentellt att Visa extremt låg membran interaktion benägenhet som bestäms av Hughes et al.26. Slutligen, om en specifik Liposom lipid sammansättning är inte ett svårt krav för experimentell design, det kan vara fördelaktigt att inkludera upp till 10 mol% av negativt laddade lipider att se till att enskilda liposomer avvärja varandra och är effektivt immobiliseras som enda liposomer12.

En fördel med den enda Liposom analysen är den lilla experimentella volymen, som kraftigt kan minska mängden dyra eller sällsynta föreningar som används per experiment. Här beskriver vi användningen av standard och kommersiellt tillgängliga kammare med en experimentell volym mellan 150 – 300 μL. Skräddarsydda Mikroskop kammare som kan reducera volymen till en räckvidd på 50 – 80 μL kan dock användas. Också, den Liposom konsumtionen är mycket låg, med en slutlig koncentration runt 2 μM total lipid.

En nackdel med den enda Liposom analysen är att det är svårt att kontrollera lipidkoncentrationen i kammaren på grund av variationer i immobilisering tendenser som beskrivs ovan. Dessutom, när det gäller tillämpningen av analysen för att studera membran-proteininteraktioner, är det svårt att bestämma koncentrationen eller antalet bundna proteiner direkt från fluorescensintensiteten.

Vid användning av liposomer i analysen som membran modellsystem (t. ex. för att studera membran interaktionen mellan fluorescerande föreningar, peptider eller proteiner) är det viktigt att säkerställa låg icke-specifik bindning till de proteinkomponenter som underlättar Immobilisering. Om så inte är fallet, kan hög bakgrunds signal upptäckas som kan förhindra detektion av den specifika bindningen till liposomer. Om hög icke-specifik bakgrund upptäcks har vi tidigare framgångsrikt minskat bakgrunden genom att ändra från konjugerat till neutravidin eller avidin.

Utföra enda Liposom detektering med hjälp av andra tekniker som flödescytometri potentiellt kan erbjuda en ökad detekterings genomströmning jämfört med Mikroskop-baserade analysen. Men med tanke på att flödescytometrar är optimerade för att studera mycket större och ljusare prover som celler, detekterings systemet hos de flesta är inte tillräckligt känslig för att upptäcka den relativt svaga fluorescens från en individuell Liposom. Så medan nya och känsligare flödescytometri utvecklas Mikroskop-baserade analysen erbjuder den bästa lösningen för att belysa liposominhomogeneities när de utförs effektivt och övervakning tusentals liposomer per experiment.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar ingen intressekonflikt.

Acknowledgments

Detta arbete finansierades av det danska rådet för självständig forskning [Grant Number 5054-00165B].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
8-well microscopy slides (µ slides) Ibidi 80827 Microscopy slides with glass bottom
Avanti Mini Extrusion kit Avanti Polar Lipids 610000 Consumables (Whatman filters) can be aquired from GE Healthcare
BSA Sigma A9418
BSA-Biotin Sigma A8549
Cholesterol Avanti Polar Lipids 700000 Traded trough Sigma
Computer with FIJI (Fiji Is Just ImageJ) ComDet plugin must be installed. Also, a data handling software (Excel, MatLab, OpenOffice, GraphPad Prism etc.) able to load .txt files will be needed to plot the data
DOPE-Atto488 Atto-Tech AD488-165
DOPE-Atto655 Atto-Tech AD655-165
DOPE-PEG-Biotin Avanti Polar Lipids 880129 Traded trough Sigma
D-Sorbitol Sigma S-6021
Freeze-dryer e.g. ScanVac Coolsafe from Labogene
Glass vials Brown Chromatography 150903 Glass vials that can resist snap-freezing in liquid nitrogen. The 8 mL version of the vials has a size that also fits with the syringes of the extrusion kit
HCl Honeywell Fluka 258148
Heating bath Capable of heating to minimum 65 °C
Heating plate with Magnet stirring Capable of heating to minimum 65 °C
HEPES Sigma H3375
Liquid nitrogen Including container for storage, e.g. Rubber-bath
Magnetic stirring bars VWR 442-4520 (EU)
Microcentrifuge tubes 1.5 mL Eppendorf 0030 120.086 (EU)
Microscope For the images in this protocol a Leica SP5 confocal microscope has been used
Na HEPES Sigma H7006
NaCl Sigma S9888
NaOH Honeywell Fluka 71686
POPC Avanti Polar Lipids 850457 Traded trough Sigma
Streptavidin Sigma S4762
tert-Butanol (2-methyl-2-propanol) Honeywell Riedel-de Haën 24127
Ultrapure water e.g. MilliQ

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chan, Y. H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
  2. Veatch, S. L., Keller, S. L. Seeing spots: Complex phase behavior in simple membranes. Biochimica Et Biophysica Acta-Molecular Cell Research. 1746 (3), 172-185 (2005).
  3. Sercombe, L., et al. Advances and Challenges of Liposome Assisted Drug Delivery. Frontiers in Pharmacology. 6, 13 (2015).
  4. Hatzakis, N. S., et al. How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs. Nature Chemical Biology. 5 (11), 835-841 (2009).
  5. Elizondo, E., et al. Influence of the Preparation Route on the Supramolecular Organization of Lipids in a Vesicular System. Journal of the American Chemical Society. 134 (4), 1918-1921 (2012).
  6. Larsen, J., Hatzakis, N. S., Stamou, D. Observation of Inhomogeneity in the Lipid Composition of Individual Nanoscale Liposomes. Journal of the American Chemical Society. 133 (28), 10685-10687 (2011).
  7. Lohse, B., Bolinger, P. Y., Stamou, D. Encapsulation Efficiency Measured on Single Small Unilamellar Vesicles. Journal of the American Chemical Society. 130 (44), 14372 (2008).
  8. Iversen, L., Mathiasen, S., Larsen, J. B., Stamou, D. Membrane curvature bends the laws of physics and chemistry. Nature Chemical Biology. 11 (11), 822-825 (2015).
  9. Bhatia, V. K., Hatzakis, N. S., Stamou, D. A unifying mechanism accounts for sensing of membrane curvature by BAR domains, amphipathic helices and membrane-anchored proteins. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (4), 381-390 (2010).
  10. Bhatia, V. K., et al. Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing. EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).
  11. Larsen, J. B., et al. Membrane curvature enables N-Ras lipid anchor sorting to liquid-ordered membrane phases. Nature Chemical Biology. 11 (3), 192 (2015).
  12. Larsen, J. B., et al. Membrane Curvature and Lipid Composition Synergize To Regulate N-Ras Anchor Recruitment. Biophysical Journal. 113 (6), 1269-1279 (2017).
  13. Yoon, T. Y., Okumus, B., Zhang, F., Shin, Y. K., Ha, T. Multiple intermediates in SNARE-induced membrane fusion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (52), 19731-19736 (2006).
  14. Fix, M., et al. Imaging single membrane fusion events mediated by SNARE proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (19), 7311-7316 (2004).
  15. Hatzakis, N. S., et al. Single Enzyme Studies Reveal the Existence of Discrete Functional States for Monomeric Enzymes and How They Are "Selected" upon Allosteric Regulation. Journal of the American Chemical Society. 134 (22), 9296-9302 (2012).
  16. Mathiasen, S., et al. Nanoscale high-content analysis using compositional heterogeneities of single proteoliposomes. Nature Methods. 11 (9), 931-934 (2014).
  17. Veshaguri, S., et al. Direct observation of proton pumping by a eukaryotic P-type ATPase. Science. 351 (6280), 1469-1473 (2016).
  18. Tonnesen, A., Christensen, S. M., Tkach, V., Stamou, D. Geometrical Membrane Curvature as an Allosteric Regulator of Membrane Protein Structure and Function. Biophysical Journal. 106 (1), 201-209 (2014).
  19. Kristensen, K., Ehrlich, N., Henriksen, J. R., Andresen, T. L. Single-Vesicle Detection and Analysis of Peptide-Induced Membrane Permeabilization. Langmuir. 31 (8), 2472-2483 (2015).
  20. Christensen, S. M., Bolinger, P. Y., Hatzakis, N. S., Mortensen, M. W., Stamou, D. Mixing subattolitre volumes in a quantitative and highly parallel manner with soft matter nanofluidics. Nature Nanotechnology. 7 (1), 51-55 (2012).
  21. Eliasen, R., Andresen, T. L., Larsen, J. B. PEG-Lipid Post Insertion into Drug Delivery Liposomes Quantified at the Single Liposome Level. Advanced Materials Interfaces. 6 (9), 1801807 (2019).
  22. Münter, R., et al. Dissociation of fluorescently labeled lipids from liposomes in biological environments challenges the interpretation of uptake studies. Nanoscale. 10 (48), 22720-22724 (2018).
  23. Traikia, M., Warschawski, D. E., Recouvreur, M., Cartaud, J., Devaux, P. F. Formation of unilamellar vesicles by repetitive freeze-thaw cycles: characterization by electron microscope and P-31-nuclear magnetic resonance. European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 29 (3), 184-195 (2000).
  24. Nele, V., et al. Effect of Formulation Method, Lipid Composition, and PEGylation on Vesicle Lamellarity: A Small-Angle Neutron Scattering Study. Langmuir. 35 (18), 6064-6074 (2019).
  25. Kunding, A. H., Mortensen, M. W., Christensen, S. M., Stamou, D. A fluorescence-based technique to construct size distributions from single-object measurements: Application to the extrusion of lipid vesicles. Biophysical Journal. 95 (3), 1176-1188 (2008).
  26. Hughes, L. D., Rawle, R. J., Boxer, S. G. Choose Your Label Wisely: Water-Soluble Fluorophores Often Interact with Lipid Bilayers. PLoS One. 9 (2), e87649 (2014).

Tags

Bioteknik singelliposomer fluorescens mikroskopi sammansättning inhomogenitet Liposom karakterisering membran-proteininteraktioner konfokal mikroskopi
En kvantitativ fluorescensmikroskopi-baserad Singelliposomanalys för att detektera sammansättningen av Inhomogeniteten mellan enskilda Lipoer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Münter, R., Andresen, T. L.,… More

Münter, R., Andresen, T. L., Larsen, J. B. A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes. J. Vis. Exp. (154), e60538, doi:10.3791/60538 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter