Summary
Questo protocollo descrive la fabbricazione di liposomi e come questi possono essere immobilizzati su una superficie e immagine individualmente in modo parallelo massiccio utilizzando la microscopia a fluorescenza. Ciò consente la quantificazione delle dimensioni e dell'inomogeneità compositiva tra singoli liposomi della popolazione.
Abstract
La maggior parte delle ricerche che impiegano liposomi come sistemi modello di membrana o portatori di somministrazione di farmaci si basa su tecniche di lettura alla rinfusa e quindi presuppone intrinsecamente che tutti i liposomi dell'ensemble siano identici. Tuttavia, nuove piattaforme sperimentali in grado di osservare i liposomi a livello di particelle singole hanno permesso di eseguire studi altamente sofisticati e quantitativi sulle interazioni proteina-membrana o sulle proprietà dei portatori di farmaci sui singoli liposomi, evitando così gli errori dalla media dell'insieme. Qui presentiamo un protocollo per la preparazione, il rilevamento e l'analisi di singoli liposomi usando un analisi di microscopia basata sulla fluorescenza, facilitando tali misurazioni di particelle singole. L'impostazione consente di imaging singoli liposomi in modo massiccio parallelo e viene impiegato per rivelare le dimensioni intra-campione e le inomogeneità compositive. Inoltre, il protocollo descrive i vantaggi dello studio dei liposomi a livello singolo di liposoma, i limiti del saggio e le caratteristiche importanti da considerare quando lo si modifica per studiare altre domande di ricerca.
Introduction
I liposomi sono vescicole sferiche a base di fosforelipidi che sono fortemente utilizzati sia nella ricerca di base che in quella applicata. Funzionano come eccellenti sistemi di modelli di membrana, perché le loro proprietà fisiochimiche possono essere facilmente manipolate variando i componenti lipidici che compongono il liposoma1,2. Inoltre, i liposomi costituiscono il sistema di nanocarrier per la consegna di farmaci più utilizzato, offrendo una migliore farmacocinetica e farmacodinamica, nonché un'elevata biocompatibilità3.
Per molti anni, i liposomi sono stati studiati principalmente utilizzando tecniche sfuse, dando solo accesso ai valori medi di lettura dell'ensemble. Questo ha portato la maggior parte di questi studi ad assumere che tutti i liposomi nell'ensemble siano identici. Tuttavia, tali valori mediati nell'insieme sono corretti solo se il set di dati sottostante viene distribuito uniformemente intorno al valore medio, ma può rappresentare una conclusione falsa e distorta se il set di dati include più popolazioni indipendenti, ad esempio. Inoltre, supponendo che l'insieme significhi rappresentare l'intera popolazione può trascurare le informazioni contenute all'interno dell'omogeneità tra i liposomi. Solo di recente sono emersi saggi quantitativi che sono in grado di sondare singoli liposomi, rivelando grandi inomogeneità tra i singoli liposomi rispetto a importanti proprietà fisiologiche tra cui la dimensione liposomica4, la composizione dei lipidi5,6, e l'efficienza di incapsulamento7,evidenziando l'importanza di studiare i liposomi a livello singolo liposoma.
Un'area di ricerca in cui è stato dimostrato che l'insieme delle proprietà del liposoma è stato mostrato come bias sta studiando le interazioni liposomidi-proteina-membrana dipendenti dalle dimensioni8,9. Tradizionalmente, i ricercatori che studiano tali processi sono stati limitati alla preparazione di liposomi con diversi diametri medi di insieme per estrusione attraverso filtri con diverse dimensioni dei pori9. Tuttavia, l'estrazione del diametro dei singoli liposomi utilizzando singoli saggi liposomi ha rivelato grandi sovrapposizioni di popolazione, con liposomi estrusa utilizzando 100 nm e 200 nm che mostrano fino al 70% di sovrapposizione nella loro distribuzione di dimensioni4. Questo potrebbe pendizzare gravemente le misurazioni di massa delle interazioni liposomiche tra dimensioni e membranadipendenti da 10. Eseguendo gli studi di interazione membrana-proteina utilizzando il singolo saggio liposoma, i ricercatori hanno invece approfittato della dimensione-polidispersità all'interno del campione, permettendo loro di studiare una vasta gamma di diametri liposomici all'interno di ogni singolo esperimento, facilitando nuove scoperte di come la curvatura e la composizione possono influenzare il reclutamento di proteine alle membrane4,11,12. Un altro campo in cui l'applicazione di saggi a singolo liposomasi si è dimostrata strumentale è negli studi meccanicistici di fusione della membrana mediata da proteine13,14. Per tali misurazioni cinetiche, la capacità di studiare singoli eventi di fusione ha alleviato la necessità di sincronizzazione sperimentale del processo di fusione, consentendo nuove intuizioni meccanicistiche che altrimenti sarebbero andate perse nella media spaziotemporale effettuata nelle misurazioni di massa dell'ensemble. Inoltre, singoli liposomi sono stati utilizzati come scaffold a membrana, consentendo la misurazione di singole proteine e offrendo nuove conoscenze sulla dinamica strutturale delle proteine transmembrane15,16. Inoltre, tali configurazioni a base di proteoliposomi hanno permesso di studiare la funzione dei singoli trasportatori transmembrana17 e dei complessi proteici che formano i pori18, nonché il meccanismo dei peptidi bioattivi a membrana-permeabilizzante19. Liposomi singoli sono stati utilizzati anche come nanofluidica a materia morbida con liposomi singoli immobilizzati sulla superficie che servono come camere per reazioni enzimatiche in volumi di 10-19 L, aumentando la produttività e la complessità dei saggi di screening con un consumo minimo di prodotto20.
Recentemente, sono stati utilizzati saggi a singolo liposomale per caratterizzare i liposomi per la somministrazione di farmaci a un livello di dettaglio precedentemente senza precedenti. I ricercatori sono stati in grado di quantificare significative inomogeneità nella quantità di polimero attaccato alla superficie dei singoli liposomi21. I singoli saggi liposomi consentiti anche misure di liposomi di emissione di farmaci in supporti complessi, come il plasma sanguigno, rivelando come gli elementi ancorati alla superficie liposomica attraverso ancore lipidici possono essere suscettibili alla dissociazione quando i liposomi sono esposti a condizioni che imitano quelli sperimentati durante la circolazione in vivo22. Nel complesso, la versatilità e l'utilità dei saggi singoli liposomi sono corroborate dalla grande varietà di problemi che questi allestimenti sono stati impiegati per affrontare, e inviamo che la metodologia continuerà ad essere sviluppata e a fare uso in nuovi campi scientifici.
Qui descriviamo un saggio a singolo liposoma a base di microscopia a fluorescenza che consente di studiare i singoli liposomi in modo ad alto velocità effettiva (Figura 1). Per illustrare il metodo, lo usiamo per quantificare le dimensioni e l'inomogeneità compositiva tra i singoli liposomi all'interno di un ensemble. Il saggio utilizza l'imaging al microscopio a fluorescenza di singoli liposomi immobilizzati su una superficie di vetro passiva. Descriviamo innanzitutto i passaggi critici del processo di fabbricazione del liposoma che garantisce una corretta etichettatura e immobilizzazione fluorescente. Quindi, descriviamo la preparazione della superficie necessaria per facilitare l'immobilizzazione liposomale prima di delineare la procedura per garantire densità di superficie liposomiche appropriate. Discutiamo i parametri di microscopia importanti per l'acquisizione di immagini di alta qualità e delineamo come eseguire semplici analisi dei dati, consentendo l'estrazione delle dimensioni liposomiche e l'inomogeneità compositiva. Questo protocollo generico dovrebbe fornire una buona base per il ricercatore interessato per sviluppare ulteriormente il saggio per il suo specifico interesse per la ricerca.
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Protocol
1. Preparazione del liposoma
NOTA: In breve, la preparazione dei liposomi di solito comprende tre passaggi cruciali: 1) la preparazione di pellicole lipidiche secche della composizione lipidica desiderata; 2) reidratazione dei lipidi per la formazione di liposomi; e 3) controllando le dimensioni e la lamellarità della popolazione lipososo.
- Pesare i lipidi e scioglierli in tert-butanol:acqua (9:1) in fiale di vetro.
- Sciogliere POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine; MW da 760 g/mol) a 50 mM.
- Sciogliere il colesterolo (MW - 387 g/mol) a 25 mM.
- Sciogliere DOPE-Atto488 (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-Atto488; MW da 1.316 g/mol) a 0,1 mM.
- Sciogliere DOPE-Atto655 (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-Atto655; MW da 1.368 g/mol) a 0,1 mM.
- Scioglire DSPE-PEG2000-biotina (1,2-distearyl-sn-glycero-3-phosphateolamine-N-[biotinyl(polyethylene glicol)-2000]; MW da 3.017 g/mol) a 0,1 mM.
NOTA: Riscaldare i lipidi a 55 gradi centigradi e utilizzare l'agitazione magnetica per garantire la completa dissoluzione dei lipidi. In alternativa, utilizzare un bagno di sonicazione. Gli stock di lipidi inutilizzati possono essere immagazzinati a -20 gradi centigradi per diversi mesi.
- Mescolare i supporti di lipidi preparati nel passaggio 1.1 per un rapporto molare di POPC:colesterolo:DOPE-Atto488:DOPE-Atto655:DOPE-PEG-biotin 68.95:30:0.5:0.5:0.05, aggiungendo 138 l di POPC, 120 l di colesterolo, 500 l di ogni lipido fluorescente e 50 l di DSPE-PEG-biotina a una fiala di vetro fresco.
NOTA: L'esatta composizione liposoma può essere facilmente modificata per affrontare la specifica questione di interesse. Vedere la discussione per maggiori dettagli. - Allentare il coperchio della fiala di vetro e congelare la fiala in azoto liquido.
- Lyophilize la miscela di lipidi congelati durante la notte.
- Aggiungere 1 mL di buffer D-sorbitolo da 200 mM (tampone sorbitolo) ai lipidi secchi.
- Riscaldare il composto a 45 gradi centigradi ed esporre a agitazione magnetica per almeno 1 h.
NOTA: Il buffer deve riflettere la domanda specifica che viene affrontata (ad esempio, condizioni fisiologiche per studiare le interazioni membrana-proteina, o uno specifico buffer clinicamente approvato per studiare i liposomi di somministrazione di farmaci). Tuttavia, se per lo studio non è necessario un buffer specifico, è possibile applicare un buffer senza ioni per la reidratazione al fine di ridurre la multilamellarità dei liposomi. - Congelare la sospensione lipididale immergendo la fiala in azoto liquido e attendere che la sospensione sia completamente congelata.
- Immergere la sospensione congelata in un bagno di riscaldamento a 55 gradi centigradi fino a quando la miscela non viene completamente scongelata.
- Ripetere i passaggi 1.7 e 1.8 fino a quando la sospensione lipososo è stata esposta a un totale di 11 cicli di congelamento/scongelamento.
NOTA: Ripetuti cicli di congelamento/scongelamento hanno dimostrato di ridurre il multilamellarity liposoma23, che è fondamentale per la precisione del singolo saggio liposoma, in quanto i liposomi multilamellar inclinano l'intensità della fluorescenza rispetto al rapporto di dimensioni liposomi che dei liposomi. La multilamellarità è di solito intrinsecamente bassa quando include più di 0.5% Lipido PEGylated nella formulazione (come comunemente fatto in liposomi per la somministrazione di farmaci)24. - Estrudere la sospensione lipososo una volta attraverso un filtro in policarbonato da 800 nm utilizzando un kit di mini estrusione. Seguire le istruzioni del produttore per l'assemblaggio del kit di estrusione (vedere Tabella dei materiali).
- Conservare i liposomi a 4 gradi durante la notte.
2. Preparazione superficiale della camera di imaging
- Preparare l'albumina del siero bovino (BSA; 1 mg/mL), BSA-biotin (1 mg/mL) e la streptavidina (0,025 mg/mL) in 10 mHe HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesolonic acid) 95 mM NaCl buffer (HEPES buffer).
NOTA: Per evitare esplosioni di liposomia, il buffer sorbitolo utilizzato per la reidratazione e il buffer HEPES utilizzato per la preparazione della superficie devono essere isotoni. Si raccomanda quindi di controllare l'osmolarità dei buffer prima dell'esperimento. - Mescolare 1.200 l di BSA e 120 l di BSA-biotina e aggiungere 300 l della miscela in ogni pozzo in un 8 pozzetti per la microscopia.
NOTA: Qui usiamo un vetrino a 8 pozzetti con un fondo di vetro disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali),ma il protocollo può essere facilmente adattato alle camere personalizzate al microscopio. - Incubano lo scivolo per 20 min a temperatura ambiente (RT).
- Lavare la diapositiva 8x con 300 l di tampone HEPES.
NOTA: Fare attenzione a non lasciare i pozzi senza buffer per più di pochi secondi, come essiccazione della superficie lo danneggerà. Inoltre, fare attenzione a non graffiare la superficie con la punta pipetta in quanto questo danneggerà anche. Così, quando aspirare buffer da un pozzo, farlo dal bordo o angolo. - Aggiungere 250 - L di streptavidin e incubare per 10 min a RT.
- Ripetere gli 8 fusi vie di lavatoi descritti nel passaggio 2.4.
- Conservare il vetrino del microscopio con 300 gradi di tampone di sorbitolo in ogni pozzo a 4 gradi centigradi. L'evaporazione del solvente danneggerà la superficie, quindi mettere il vetrino del microscopio in una parabola Petri e sigillarlo con parafilm a meno che il vetrino preparato non venga utilizzato immediatamente.
3. Immobilizzazione liposoma
- Diluire la sospensione lipososo a circa 20 m di lipido totale nel tampone sorbitolo. La procedura nella sezione 1 produrrà una sospensione lipososo di circa 10 mM lipidico totale.
- Posizionare il vetrino sul microscopio e mettere a fuoco sulla superficie della camera utilizzando il segnale di riflessione laser aumentato dall'interfaccia vetro/buffer come guida.
- Lavare la camera 4x con 300 l di tampone HEPES fresco.
- Aggiungere 10 l di brodo liposomadio diluito (20 m lipidico totale) a un tubo di microcentrifuga.
- Estrarre 100 l di tampone dalla camera, aggiungere al tubo di microcentrifuga preparato al passo 3.4, mescolare correttamente, e mettere il 110 L di nuovo nella camera.
- Mettere l'esemplare al microscopio e utilizzare un'impostazione rudimentale al microscopio in grado di rilevare il segnale proveniente dal fluoroforo liposomano per osservare i liposomi immobilizzati sulla superficie.
- Puntare a una densità di superficie liposomica che sia contemporaneamente sufficientemente scarsa da identificare i singoli liposomi e abbastanza densi da facilitare le misurazioni ad alta velocità. In genere, utilizzando un campo visivo di 50 m x 50 m, è ottimale la qualità dei liposomi perfotogramma( Figura 2 ). Questo di solito può essere raggiunto entro 5:10 min.
NOTA: Se nel campo visivo vengono rilevate solo particelle fluorescenti in rapido movimento, la causa potrebbe essere un'assenza o un'eccessiva concentrazione di uno qualsiasi dei componenti critici per il processo di immobilizzazione (BSA-biotavidina, streptavidina, DOPE-PEG-biotin). Se non vengono rilevati liposomi, potrebbe essere correlato a una bassa concentrazione di liposomi, a impostazioni improprie per il rilevamento della fluorescenza o potenzialmente all'imaging con un piano focale non sulla superficie del vetro. - Una volta raggiunta una densità di superficie lipososoappropriata appropriata, lavare la camera 3x con 200 l di tampone HEPES.
NOTA: Essere consapevoli del fatto che la cinetica dell'immobilizzazione dipende anche da proprietà liposomiche come dimensioni e carica e dovrebbe quindi essere sempre ottimizzata per ogni formulazione liposoma.
4. Acquisizione di immagini
NOTA: Questa sezione dipenderà molto dal sistema di microscopio disponibile per il ricercatore che esegue l'esperimento. Pertanto, verranno descritte le linee guida generali su come eseguire l'imaging. Tuttavia, le impostazioni esatte e come applicarle variano tra le diverse configurazioni del microscopio. Ad esempio, alcuni sistemi consentono di scegliere qualsiasi combinazione di filtri di emissione desiderata, mentre altri microscopi sono dotati di specifici filtri preimpostati.
- Impostare il microscopio per l'imaging di singoli liposomi. Per garantire una qualità ottimale dell'immagine e la successiva analisi dei dati, utilizzare un'alta risoluzione in scala di grigi e uno schema di pixel che consente di sovracampionare i singoli liposomi. Si consiglia una profondità di bit di 16 e almeno 1.024 x 1.024 pixel per un'area di 50 m x 50 m. Se disponibile, la media lineare può essere applicata in modo positivo per ridurre il rumore (ad esempio, 3 scansioni per linea).
- Selezionare una potenza laser di eccitazione che assicura uno sbiancamento non significativo da fotogramma a telaio e un segnale abbastanza forte da discriminare chiaramente i singoli liposomi dallo sfondo. L'impostazione ottimale dipenderà dal microscopio specifico utilizzato e dalla combinazione di fluoroforo. Assicurarsi che i rivelatori non siano saturi, in quanto ciò spreficherà la quantificazione dell'intensità.
- L'imaging dei fluorofori DOPE-Atto488 e DOPE-Atto655 nei liposomi richiede l'imaging di più canali. Pertanto, assicurati che ogni canale sia imaged in sequenza per evitare l'eccitazione incrociata. Ad esempio, prima prendere un'immagine emozionante a 488 nm e la lettura emissione a 495-560 nm. Successivamente, scatta un'altra immagine emozionante a 633 nm ma leggendo l'emissione solo a 660-710 nm. Le specifiche dipenderanno dal sistema di microscopio (ad esempio, quale laser e filtri) disponibile.
- Assicurarsi di coprire diverse aree della superficie, acquisendo almeno 10 immagini del campione, creando così almeno 3.000 singoli liposomi. Se la densità della superficie è inferiore a 300 liposomi/fotogramma, acquisire più immagini. Assicurarsi di rifocalizzare il microscopio per ogni nuova immagine.
NOTA: per l'imaging a due canali, assicurarsi di assegnare un nome ai file di immagine in modo che le coppie di immagini con gli stessi liposomi in diversi canali di fluorescenza possano essere facilmente identificate durante l'analisi dei dati. - Per quantificare l'incertezza sperimentale relativa alla misurazione dell'inomogeneità compositiva, immaginare la stessa area dei liposomi prima e dopo la rimessa a fuoco (vedere la figura 3 e la descrizione nel testo).
- Esportare le immagini dal software al microscopio come file .tiff. Esportare singolarmente i due canali degli stessi liposomi.
5. Analisi dei dati
NOTA: le routine di montaggio 2D Gaussian autoprogettate appositamente sviluppate sono state precedentemente impiegate6,11,12. Tuttavia, per aumentare l'applicabilità del metodo viene descritto un processo di analisi dei dati che può essere facilmente implementato in tutti i laboratori.
- Caricare la corrispondente coppia di immagini .tiff di due diversi canali di fluorescenza nello stesso campo di imaging nel software FIJI (FIJI Is Just ImageJ).
- Nel menu Immagine scegliere Coloree utilizzare la funzione Unisci canale per creare una composizione dei due canali.
- Osservare se i liposomi immagine in due canali diversi mostrano una buona colocalizzazione o se si è verificata una deriva visibile.
NOTA: in caso di deriva tra i due canali di fluorescenza (riconosciuto come offset X-Y sistematico ed uguale tra il segnale nei due canali), uno dei fotogrammi può essere tradotto utilizzando la funzione Trasforma > Traduci nel menu Immagine di FIJI. Tuttavia, è necessario prestare attenzione con tale manipolazione dell'immagine. Si raccomanda quindi di evitare il più possibile la deriva quando si immaginano i liposomi. - Assicurati che il plugin ComDet (v.0.3.6.1 o versione successiva) sia installato, o fai questo nel menu Plugin.
- Aprite il plugin ComDet per rilevare le particelle accedendo al menu Plugin e scegliendo ComDet v.0.3.6.1 > Rileva particelle.
- In ComDet, assicurarsi di scegliere singolarmente la funzione Rileva particelle su entrambi i canali. Impostare la distanza massima tra macchie co-localizzate in modo simile alla dimensione particella approssimative. Di solito, 4 pixel è appropriato per le impostazioni descritte qui.
- Il rapporto segnale-rumore dovrebbe consentire il rilevamento di particelle anche dim con una bassa quantità di fluorescenza. In ComDet, impostare questo rapporto su 3 impostando la sensibilità del rilevamento in entrambi i canali su Particelle molto dim (SNR n. 3).
NOTA: Anche se questo valore SNR è di solito appropriato, potrebbe essere necessario impostarlo più in alto (ad esempio, se c'è molto rumore dell'immagine che può essere identificato come liposomi e portare a falsi positivi). - Assicurarsi che le caselle con Calcola co-localizzazione e Stampa particelle rilevate in entrambi i canali siano selezionate, prima di premere OK.
- Dopo aver eseguito l'analisi, verranno visualizzate due finestre popup con Risultati e Riepilogo. Esportare la tabella dati Risultati contenenti i dati di co-localizzazione (coordinate delle particelle e intensità integrata di ogni particella rilevata) in un software di gestione dei dati di scelta salvando la tabella come file .txt e importandola nel software.
- Assicurarsi che ogni liposoma sia incluso una sola volta nel set di dati e non sia il rapporto channel1/channel2 che il rapporto channel2/channel1. In questo modo, filtrare i dati in modo che solo Abs_frame 1 venga tracciato nel passaggio 5.11.
NOTA: scegliendo Colocalizzato 1, i falsi positivi provenienti dal rumore nelle immagini possono essere rimossi dall'analisi. Tuttavia, qualsiasi liposomaconsina con uno solo dei due componenti fluorescenti presenti sarà esclusa dall'analisi, rimuovendo così potenzialmente importanti punti dati dall'analisi. - Tracciare un istogramma della colonna con i dati contenenti il rapporto di intensità per ogni liposoma rilevato.
- Il grado di inomogeneità compositiva per il sistema liposomico studiato è rappresentato dalla larghezza della distribuzione del rapporto di intensità. Per quantificare l'omogeneità, inserire l'istogramma del rapporto di intensità con una funzione gaussiana ed estrarre la media (sima) e la deviazione standard (sigma). Vedere la sezione Risultati rappresentativi.
- Un valore per il grado di inomogeneità (DI) può ora essere calcolato utilizzando il coefficiente di variazione definito come DI : sigma / sigma .
6. Calibrazione delle dimensioni del liposoma
- Estrarre parte del brodo lipososo ed estromettere 21x attraverso un filtro in policarbonato da 50 nm, come descritto nel passaggio 1.10.
- Diluire i liposomi aggiungendo 10 l della sospensione lipososo a 800 l di tampone sorbitolo in un tubo di microcentrifuga.
- Trasferire il campione liposomadio diluito in una cuvette monouso in polipropilene.
- Misurare le dimensioni utilizzando la dispersione dinamica della luce (DLS). Eseguire almeno tre piste indipendenti per misurare le dimensioni e la polidisità della sospensione liposoma.
NOTA: Se necessario, utilizzare una sospensione liposomica più concentrata per la misurazione. Per misurare le dimensioni dei liposomi è possibile applicare anche alternative alle DLL (ad esempio, l'analisi del tracciamento delle nanoparticelle). Una descrizione di come eseguire tale determinazione delle dimensioni delle particelle esula dall'ambito di questo protocollo. - Immagine dei liposomi di calibrazione sul microscopio utilizzando esattamente le stesse impostazioni sperimentali definite nei passaggi 4.1 e 4.2.
- Estrarre l'intensità integrata per ogni liposoma di calibrazione nelle immagini di calibrazione: estrarre il foglio dei risultati filtrati contenente intensità di fluorescenza liposomica, come descritto nei passaggi 5.1.5.10. Dalla tabella dei risultati, estrarre la colonna "IntegratedInt".
- Poiché l'intensità totale integrata di un liposoma etichettato nella sua membrana è proporzionale alla superficie del liposoma ed è quindi proporzionale al quadrato del suo diametro, tracciare un istogramma di intensità radice quadrata dell'intensità di fluorescenza del liposomi di calibrazione.
- Montare l'istogramma di intensità integrato prodotto al punto 6.7 con una distribuzione normale del tronco ed estrarre l'intensità media di fluorescenza dei liposomi di calibrazione.
- Per determinare la relazione tra l'intensità della radice quadrata (IntSqrt) e la dimensione del liposoma, calcolare il fattore di correzione (C) utilizzando il diametro liposomamedio medio (Dia) pesato in base al numero ottenuto dalle misure DLS: Dia x C x IntSqrt è equivalente a C - Dia / IntSqrt.
- Calcola i valori IntSqrt per i liposomi nell'esperimento di inomogeneità compositiva e convertili in diametri moltiplicandolo con il fattore di correzione.
- Tracciare il valore del rapporto di intensità in funzione del diametro per i liposomi di inomogeneità compositiva, ottenendo così l'inomogeneità in funzione delle dimensioni liposomiche per una popolazione di liposomi che vanno da circa 50 nm-800 nm.
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Representative Results
Seguendo il protocollo descritto è possibile l'immagine di singoli liposomi in modo parallelo massiccio (Figura 1). Il successo dell'immobilizzazione superficiale dei liposomi dovrebbe essere immediatamente evidente dopo l'aggiunta della soluzione liposomica alla camera (passaggio 3.6 nel protocollo) come diffrazione punti di intensità limitata dovrebbero apparire nell'immagine (Figura 1B e Figura 1C).
Al fine di ottenere buone statistiche e sfruttare le capacità ad alta produttività del saggio, diverse migliaia di liposomi dovrebbero essere immagine. Per fare questo in un numero ragionevole di immagini, si consiglia di immobilizzare abbastanza liposomi per ottenere una densità di 30-400 liposomi per fotogramma, in quanto questo porterà il numero di immagini per campione a 10 dollari, limitando così il numero di immagini che devono essere acquisite e analizzate. Una densità inferiore renderà l'analisi dei dati più dispendiosa in termini di tempo, mentre una densità più elevata può rendere difficile per il software di analisi delle immagini distinguere i singoli liposomi. Per avere un'idea visiva dell'aspetto dei liposomi 300-400, vedere Figura 2A. Va notato, tuttavia, che per alcune applicazioni (ad esempio, interazioni membrana-proteina con una proteina che tende a suscitare un forte legame di fondo alla superficie BSA) si raccomanda di utilizzare una densità leggermente inferiore, come nella Figura 2A in alto a destra.
Occasionalmente, quando si acquisiscono immagini è difficile ottenere l'intero campo visivo in stato attivo corretto, come illustrato nella Figura 2B. Tali problemi potrebbero indicare che la piastra campione è inclinata, che può derivare dal fatto che la piastra non viene posizionata correttamente sul supporto del campione al microscopio. Inoltre, se i liposomi sembrano grandi e sfocati, il buffer nella camera potrebbe essere evaporato e la superficie si è asciugata. È particolarmente importante tenere presente questo problema quando si esegue l'imaging per lunghi periodi di tempo o quando si eseguono misurazioni a temperature superiori a RT. Per illustrare la differenza tra liposomi correttamente conservati ed essiccati, un'immagine dello stesso campione prima e dopo l'essiccazione della camera è mostrata nella Figura 2C.
Dopo aver garantito una qualità ottimale dell'immagine, l'intensità integrata per ogni liposoma nei due canali di imaging può essere estratta seguendo i passaggi nella sezione 5 di questo protocollo. Facendo questo creerà un elenco di valori di intensità unici, che ci permette di calcolare il rapporto di intensità per ogni singolo liposoma. L'omogeneità compositiva viene valutata in base agli istogrammi del rapporto di intensità, rivelando in genere una distribuzione gaussiana intorno a un valore del rapporto medio (Figura 3A). Si noti che se si osservano forti deviazioni da una distribuzione gaussiana (Figura 3B), indica un problema di sensibilità di rilevamento per almeno uno dei canali di imaging, suggerendo che è stato escluso un sottoinsieme di liposomi che mostrano un segnale più debole. Ciò potrebbe essere dovuto sia al limite di rilevamento del sistema di imaging, sia all'esclusione dei liposomi nell'analisi dei dati (ad esempio, quando si applica una determinata soglia minima; vedere il passaggio 5.7).
Il calcolo del valore DI come descritto nei passaggi 5.11-5.13 nel protocollo fornirà una misura quantitativa dell'inomogeneità compositiva tra i singoli liposomi della preparazione. Per il sistema liposomico studiato qui, DI - 0,23 - 0,01 (Figura 3C). Questo valore può essere utilizzato per confrontare sistematicamente come le diverse proprietà o metodi di preparazione influenzano l'omogeneità compositiva. Per concettualizzare il significato del valore DI, ci riferiamo alla distribuzione normale visualizzata dall'istogramma del rapporto di intensità, il che significa che obbediranno alla regola empirica 68-95-99.7. Questa regola descrive la percentuale di una popolazione che rientra in una, due e tre deviazioni standard intorno al valore medio. Per il valore DI di 0,23 x 0,01 trovato qui, significa che il 32% dei liposomi nella popolazione avrà un rapporto di intensità che differisce di oltre il 23% dal rapporto molare medio dell'ensemble (Figura 3D).
Per l'esperimento di controllo immaginare gli stessi liposomi prima e dopo la rifocalizzazione (sezione 4.6), viene eseguita la stessa analisi dei dati e la stessa tracciatura dei risultati dell'esperimento vero e proprio. In questo modo si fa la quantificazione dell'incertezza sperimentale del valore DI, che è risultato esserel'incertezza DI , 0,10 , 0,01 (Figura 3E). Anche se il valoredell'incertezza DI dipenderà dal sistema di imaging impiegato, si è scoperto che le configurazioni del microscopio confocale danno costantemente origine a valori diincertezza DI di circa 0,105,6. Il valore DI di DI 0,23 x 0,01 trovato per il sistema liposomico qui è più del doppio dell'incertezza sperimentale, il che suggerisce la presenza di una significativa inomogeneità compositiva tra i singoli liposomi della preparazione.
L'esecuzione dell'esperimento di calibrazione delle dimensioni descritto nella sezione 6 consentirà di trasformare i valori di intensità liposomici arbitrari da trasformare in diametri fisici in nanometri. Il metodo è stato convalidato rispetto ad altre tecniche di imaging25 come la microscopia elettronica criogenica, che ha la capacità di risolvere otticamente i liposomi delle dimensioni di nanometri, anche se con una velocità effettiva molto inferiore. Immaginando il campione di controllo utilizzando le stesse impostazioni del microscopio utilizzate per gli esperimenti reali, è ora possibile correlare l'intensità liposoma media al diametro liposomico medio determinato da DLS (Figura 4A). Il passo successivo è quello di rappresentare la distribuzione di intensità liposomica, che in base ai vincoli fisici contro la creazione di liposomi estremamente piccoli, in genere visualizzerà una distribuzione normale del log (Figura 4B). Se la distribuzione non è ben descritta da una distribuzione normale del tronco (il più delle volte a causa di liposomi mancanti con valori di bassa intensità) significa che una parte della popolazione liposomana è stata esclusa a causa di bassa sensibilità al rilevamento del microscopio o parametri eccessivamente rigorosi durante l'analisi dei dati (Figura 4C). È importante rilevare e affrontare tali questioni per garantire un'interpretazione imparziale dei dati. Successivamente, i valori di intensità per ogni singolo liposoma nella Figura 4B possono essere convertiti in diametri effettivi utilizzando il fattore di correzione determinato nella Figura 4A (Figura 4D). Dopo aver determinato le dimensioni di ogni liposoma, la DI in funzione del diametro può ora essere studiata tracciando il rapporto di intensità rispetto al diametro per ogni singolo liposoma (Figura 4E). Questa struttura di dati simile a un'imbuto conferma i risultati precedenti che il valore DI aumenta quando la dimensione del liposoma diminuisce6. È importante sottolineare che l'aumento simmetrico della diffusione dei rapporti di intensità intorno a un valore medio suggerisce che non esiste una variazione sistematica dipendente dalle dimensioni nella composizione media dei liposomi.
Figura 1: Il singolo saggio di liposo. (A) I liposomi sono formulati con un contenuto equimolare dei lipidi fluorescenti DOPE-Atto488 e DOPE-Atto655 e immobilizzati su una superficie BSA utilizzando un collegamento biotina/streptavidin. (B) I liposomi immobilizzati sono immagine con un microscopio confocale, che consente di rilevare le intensità di fluorescenza dai singoli liposomi. Barre di scala - 8 m. (C) Ingrandimento dell'area verde in (B) raffigurato come grafico dell'intensità della superficie per due liposomi adiacenti che mostrano un segnale fluorescente invertito tra i due canali, illustrando il concetto di omogeneità compositiva. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Ottimizzazione e insidie. (A) In alto a sinistra mostra 29 liposomi immobilizzati in un telaio di 50 m x 50 m. Questi sono troppo pochi liposomi per fotogramma per sfruttare la possibilità di indagine ad alta produttività dell'inomogeneità liposoma. In alto a destra mostra 123 liposomi per fotogramma. Si tratta di una densità non ottimale, ma può essere utilizzato se vengono acquisite molte immagini. In basso a sinistra mostra 30-400 liposomi per fotogramma. Questo è ottimale per il protocollo descritto qui. In basso a destra mostra più di 1.500 liposomi per fotogramma, che è troppo molti per distinguere i singoli liposomi. C'è un alto rischio che un singolo punto sia in realtà due liposomi immobilizzati all'interno dello stesso punto limitato di diffrazione. (B) Se la camera non è posizionata correttamente nel supporto del campione, sarà impossibile ottenere l'intero campo visivo in posizione corretta. Nella micrografia sinistra la piastra si inclina intorno all'asse trasversale, dando origine all'angolo inferiore sinistro fuori fuoco. Nella micrografia destra la piastra si inclina intorno all'asse longitudinale, dando origine a un'inclinazione più pesante. Sia l'angolo inferiore sinistro che quello superiore destro sono fuori fuoco. (C) Se si fa la ricerca per lunghi periodi di tempo o a temperature elevate, il tampone potrebbe evaporare, provocando l'essiccazione dalla camera. Abbiamo illustrato questo scenario con l'imaging di liposomi prima e dopo che la camera è stata lasciata asciugare per 3 minuti, e poi riterrosa aggiungendo tampone fresco alla camera. I liposomi risultanti sono più grandi, sfocati, hanno una minore intensità di fluorescenza e sembrano essere sparsi sulla piastra. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Istogrammi del rapporto di intensità per quantificare l'inomogeneità compositiva liposoma. (A) Il rapporto di intensità della fluorescenza DOPE-Atto488 e DOPE-Atto655 per ogni singolo plottaggio liposomatizzato come istogramma. (B) Una distribuzione gaussiana troncata che illustra un potenziale problema di sensibilità, durante l'imaging o nella fase di trattamento dei dati. (C) Montaggio dell'istogramma di intensità con una funzione gaussiana permette di estrarre la media e la deviazione standard utilizzate per calcolare il valore DI. (D) Un valore DI di 0,23 può essere tradotto in un valore superiore al 22% della popolazione superiore al 23% dal rapporto molare medio dell'ensemble. (E) Controllare l'esperimento di imaging degli stessi liposomi prima e dopo la rifocalizzazione e quindi l'esecuzione della stessa procedura di trattamento dei dati dell'esperimento vero e proprio. Ciò consente di determinare l'errore sperimentale per la quantificazione DI. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Conversione dell'intensità lipososoma in diametro fisico in nm. (A) Istogramma di intensità dei liposomi di calibrazione estruso di 50 nm rispetto ai dati DLS per determinare il fattore di calibrazione. (B) Un istogramma del valore IntSqrt dai liposomi sperimentali produce in genere una distribuzione log-normale a causa dei vincoli fisici contro la creazione di liposomi molto piccoli. (C) Un istogramma di valore IntSqrt non log-normale indica problemi con sensibilità di rilevamento o che piccoli liposomi sono stati esclusi durante il trattamento dei dati. (D) Le intensità liposomiche in (B) vengono convertite in diametri liposomireali effettivi utilizzando il fattore di correzione. (E) Il rapporto di intensità di ogni liposoma tracciato in funzione del diametro liposomale può ora essere visualizzato consentendo l'indagine dell'inomogeneità compositiva in funzione delle dimensioni liposomiche. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
È importante notare che mentre descriviamo in dettaglio come il singolo assaggio di liposomi può essere utilizzato per studiare l'inomogeneità compositiva tra i singoli liposomi, la piattaforma è molto versatile. Come precedentemente mostrato e discusso nell'introduzione, il protocollo può essere facilmente adattato per studiare gli aspetti della fusione membrana-membrana, delle interazioni proteina-membrana o della caratterizzazione del vettore di farmaci liposomici. Per qualsiasi problema scientifico affrontato, il potere dell'unico saggio liposoma sta nella capacità di rilevare i singoli componenti dell'ensemble e quindi di avere una lettura quantitativa, non distorta dagli effetti medi dell'insieme.
L'analisi liposoma unica è adatta in modo ottimale per le modalità di imaging superficiale come la riflessione interna totale o il microscopio confocale, in cui la sezione della direzione z può eliminare la fluorescenza di fondo indesiderata dalla soluzione sopra lo strato liposoma. Tuttavia, questo aspetto è più importante per gli studi in cui composti fluorescenti etichettati, come peptidi, proteine o altri liposomi vengono aggiunti alla soluzione e rimangono lì durante l'imaging. Ad esempio, se il saggio viene utilizzato nel formato descritto in dettaglio qui, dove i coloranti fluorescenti sono limitati ai liposomi immobilizzati, il saggio potrebbe in linea di principio essere eseguito utilizzando microscopi widefield più ampiamente disponibili, fornendo il rilevamento sistema è abbastanza sensibile.
A priori non ci sono limitazioni rispetto al metodo utilizzato per preparare i liposomi utilizzati nel saggio. Qui descriviamo in dettaglio l'uso di una tecnica di liofilazione. Tuttavia, in precedenza la reidratazione dei lipidi a base di cloroformio o le tecniche a base di iniezione di etanolo sono state impiegate per fabbricare liposomi utilizzati nel saggio5,6. Un parametro critico è l'inclusione di una frazione di piccoli inidimi biotinylati nella miscela lipidica per garantire l'immobilizzazione (0,05 mol consigliati). Un altro elemento necessario è quello di includere una piccola quantità di lipidico fluorescente. Nel complesso, la quantità di lipidico-dye aggiunto dovrebbe essere mantenuta il più bassa possibile sia per evitare effetti di spegnimento e per evitare che il lipidico-dye di alterare significativamente le proprietà fisico del liposoma. Il limite inferiore della quantità di coloranti lipidici è fissato dalla concentrazione, dove la variazione stocastica nel numero di singole tine lipidi che per liposoma diventa significativa rispetto alla quantità media di lipidi (vedi Larsen et al.6 per una discussione approfondita). Scendendo al di sotto di questo limite si introdurranno grandi incertezze nelle intensità estratte. Infine, la quantità di colorante lipidico deve essere sufficientemente elevata per il rilevamento accurato dei singoli liposomi con un buon rapporto segnale-rumore. Anche se questo criterio ovviamente dipende fortemente dal sistema di imaging, abbiamo scoperto che le concentrazioni di tinture lipidiche tra lo 0,05 e lo 0,5 mol% funzionano bene nella stragrande maggioranza dei casi.
Per scegliere quale tinto lipidico includere nel liposoma, il primo prerequisito è che le proprietà di eccitazione e emissione corrispondano alle capacità di illuminazione e rilevamento del sistema di imaging. In secondo luogo, per aumentare la sensibilità e la precisione del metodo si consiglia di utilizzare coloranti con elevate rese quantiche e fotostabilità, e in precedenza abbiamo utilizzato con successo coloranti con diverse lunghezze d'onda di eccitazione6,11. Occorre prestare attenzione nella scelta di ancore lipidiche con proprietà fisico simili per garantire che il partizionamento dei lipidi non porti ad un'inomogeneità artificialmente elevata. Ad esempio, per questo protocollo, abbiamo ancorato entrambi i fluorofori usando DOPE, mentre avere un fluoroforo su DOPE e un altro su DPPE potrebbe portare a eterogeneie di distribuzione di fluorofori non correlati all'infruttuosità intrinseca nella popolazione liposomica. Soprattutto per l'imaging a doppio colore è importante scegliere coloranti con spettri di eccitazione ed emissione stretti e la più piccola sovrapposizione spettrale possibile per evitare significativi emorragie, discorsi incrociati e trasferimento di energia di risonanza a fluorescenza (FRET) tra coloranti e canali. Per evitare artefatti legati alla variazione nell'ambiente fluoroforo preferiamo lavorare con coloranti, che sono stati dimostrati sperimentalmente per mostrare una propensione di interazione della membrana estremamente bassa come determinato da Hughes et al.26. Infine, se una specifica composizione liposomidica non è un requisito difficile per il progetto sperimentale, può essere utile includere fino a 10 mol% di lipidi caricati negativamente per garantire che i singoli liposomi si respingano a vicenda e siano immobilizzati in modo efficiente come singoli liposomi12.
Un vantaggio del singolo saggio di liposoma è il piccolo volume sperimentale, che può ridurre notevolmente la quantità di composti costosi o rari utilizzati per esperimento. Qui descriviamo l'uso di camere standard e disponibili in commercio con un volume sperimentale compreso tra 150 e 300 gradi l. Tuttavia, possono essere utilizzate camere al microscopio su misura che possono ridurre il volume a un intervallo di 50-80 gradi. Inoltre, il consumo di liposomi è molto basso, con una concentrazione finale di circa 2 lipidi totali M.
Uno svantaggio del singolo saggio liposomaè è che è difficile controllare la concentrazione lipidica nella camera a causa delle variazioni nelle tendenze di immobilizzazione sopra descritte. Inoltre, per quanto riguarda l'applicazione del saggio per lo studio delle interazioni membrana-proteina, è difficile determinare la concentrazione o il numero di proteine legate direttamente dall'intensità della fluorescenza.
Quando si utilizzano i liposomi nel saggio come sistemi di modelli a membrana (ad esempio, per studiare l'interazione della membrana di composti fluorescenti, peptidi o proteine) è importante garantire un basso legame non specifico ai componenti proteici che Immobilizzazione. In caso contrario, è possibile rilevare un segnale di fondo elevato che potrebbe impedire il rilevamento dell'associazione specifica ai liposomi. Se viene rilevato un elevato sfondo non specifico, in precedenza abbiamo ridotto con successo lo sfondo passando dallo streptavidin a Neutravidin o all'avidin.
L'esecuzione di un singolo rilevamento liposomano utilizzando altre tecniche come la citometria di flusso potrebbe potenzialmente offrire una maggiore velocità effettiva di rilevamento rispetto al saggio basato sul microscopio. Tuttavia, dato che i ciclimetri di flusso sono ottimizzati per studiare campioni molto più grandi e luminosi come le cellule, il sistema di rilevamento della maggior parte non è abbastanza sensibile da rilevare la fluorescenza relativamente debole da un singolo liposoma. Così, mentre si sta sviluppando una nuova e più sensibile citometria di flusso, il test a base di microscopio offre la soluzione migliore per chiarire le inomogeneità dei liposomi quando viene eseguita in modo efficiente e il monitoraggio di migliaia di liposomi per esperimento.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dal Consiglio danese per la ricerca indipendente [numero di sovvenzione 5054-00165B].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-well microscopy slides (µ slides) | Ibidi | 80827 | Microscopy slides with glass bottom |
| Avanti Mini Extrusion kit | Avanti Polar Lipids | 610000 | Consumables (Whatman filters) can be aquired from GE Healthcare |
| BSA | Sigma | A9418 | |
| BSA-Biotin | Sigma | A8549 | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700000 | Traded trough Sigma |
| Computer with FIJI (Fiji Is Just ImageJ) | ComDet plugin must be installed. Also, a data handling software (Excel, MatLab, OpenOffice, GraphPad Prism etc.) able to load .txt files will be needed to plot the data | ||
| DOPE-Atto488 | Atto-Tech | AD488-165 | |
| DOPE-Atto655 | Atto-Tech | AD655-165 | |
| DOPE-PEG-Biotin | Avanti Polar Lipids | 880129 | Traded trough Sigma |
| D-Sorbitol | Sigma | S-6021 | |
| Freeze-dryer | e.g. ScanVac Coolsafe from Labogene | ||
| Glass vials | Brown Chromatography | 150903 | Glass vials that can resist snap-freezing in liquid nitrogen. The 8 mL version of the vials has a size that also fits with the syringes of the extrusion kit |
| HCl | Honeywell Fluka | 258148 | |
| Heating bath | Capable of heating to minimum 65 °C | ||
| Heating plate with Magnet stirring | Capable of heating to minimum 65 °C | ||
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Liquid nitrogen | Including container for storage, e.g. Rubber-bath | ||
| Magnetic stirring bars | VWR | 442-4520 (EU) | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030 120.086 (EU) | |
| Microscope | For the images in this protocol a Leica SP5 confocal microscope has been used | ||
| Na HEPES | Sigma | H7006 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| NaOH | Honeywell Fluka | 71686 | |
| POPC | Avanti Polar Lipids | 850457 | Traded trough Sigma |
| Streptavidin | Sigma | S4762 | |
| tert-Butanol (2-methyl-2-propanol) | Honeywell Riedel-de Haën | 24127 | |
| Ultrapure water | e.g. MilliQ |
References
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