Summary
यहां, हम एक नियोडिमियम का उपयोग करके डेसेमेट की झिल्ली (डीएम) से कॉर्नियल एंडोथेलियल कोशिकाओं (सीईसी) को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं: याग (एनडी: वाईएजी) लेजर को बुलस केराटोपैथी (बीके) के लिए एक पूर्व वीवो रोग मॉडल के रूप में।
Abstract
Nd: YAG लेजर इस तरह के कई दशकों के लिए capsulotomy के रूप में noninvasive इंट्राओकुलर सर्जरी, प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है अब । तीक्ष्ण प्रभाव लेजर फोकस पर ऑप्टिकल टूटने पर निर्भर करता है। ध्वनिक सदमे तरंगों और कैविटेशन बुलबुले उत्पन्न होते हैं, जिससे ऊतक टूटना होता है। बबल आकार और दबाव आयाम नाड़ी ऊर्जा और केंद्र बिंदु की स्थिति के साथ भिन्न होते हैं। इस अध्ययन में, enucleated पोर्सिन आंखें एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध Nd:YAG लेजर के सामने तैनात थे । चर पल्स ऊर्जा के साथ-साथ कॉर्निया के पीछे फोकल स्पॉट की विभिन्न स्थितियों का परीक्षण किया गया। परिणामस्वरूप घावों का मूल्यांकन न्यूनतम संपाश्र्वक क्षति के साथ कॉर्नियल एंडोथेलियल कोशिकाओं (सीईसी) की अनन्य टुकड़ी के लिए सर्वोत्तम मापदंडों को निर्धारित करने के लिए दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी और हिस्टोलॉजी द्वारा किया गया था। इस विधि के फायदे सीईसी का सटीक एब्लेशन, कम जमानत क्षति, और सबसे बढ़कर, गैर-संपर्क उपचार हैं।
Introduction
रेटिना और उसके फोटोरिसेप्टर्स1के प्रकाश के संचरण के लिए कॉर्निया की पारदर्शिता आवश्यक है । इस संबंध में, कोलेजन फाइबर को कॉर्नियल स्ट्रोमा के भीतर सही ढंग से गठबंधन रखने के लिए निर्जलीकरण की एक सापेक्ष स्थिति महत्वपूर्ण है। इस होमोस्टोसिस को डेसेमेट की झिल्ली (डीएम)2पर स्थित कॉर्नियल एंडोथेलियल कोशिकाओं (सीईसी) द्वारा बनाए रखा जाता है। एंडोथेलियम अंतरतम कॉर्नियल लेयर है। इसमें एक महत्वपूर्ण बाधा और पंप फ़ंक्शन है, जो कॉर्नियल पारदर्शिता3के लिए महत्वपूर्ण है। एपिथेलियम के विपरीत, एंडोथेलियम4को आत्म-नवीनीकृत करने में सक्षम नहीं है। इसलिए, रोग या आघात के कारण होने वाली कोई भी कोशिका क्षति शेष एंडोथेलियल कोशिकाओं को विस्तार ित करने और माइग्रेट करने, परिणामस्वरूप दोषों को कवर करने और कॉर्नियल कार्यक्षमता बनाए रखने के लिएउत्तेजितकरती है। हालांकि, यदि सीईसी घनत्व एक महत्वपूर्ण सीमा से नीचे गिर जाता है, तो एंडोथेलियम का प्रतिपूर्ति एक एडीमा की ओर ले जाता है, जिसके परिणामस्वरूप धुंधली दृष्टि और असुविधा या यहां तक कि गंभीर दर्द4होता है। लक्षणों को दूर करने के लिए दवाओं की उपलब्धता के बावजूद, वर्तमान में इन मामलों में एकमात्र निश्चित उपचार कॉर्नियल प्रत्यारोपण है, जिसे पूर्ण मोटाई भ्रष्टाचार या लैमेलर एंडोथेलियल प्रत्यारोपण के रूप में किया जा सकता है। उत्तरार्द्ध प्रक्रिया डेसमेट की झिल्ली एंडोथेलियल केराटोप्लास्टी (DMEK) के साथ-साथ डेसमेट की स्ट्रिपिंग स्वचालित एंडोथेलियल केराटोप्लास्टी (डीएसएईके)6के रूप में उपलब्ध है। हालांकि, शेष सीईसी की सुरक्षा और उनके अस्तित्व को बढ़ाने के लिए एक वैकल्पिक लक्ष्य है, जो एक पर्याप्त रोग मॉडल की जरूरत है संभावित चिकित्सीय दवाओं का परीक्षण हो सकता है ।
वर्तमान सीईसी हानि रोग मॉडल पूर्वकाल कक्ष में विषाक्त एजेंटों (जैसे, बेंजलकोनियम क्लोराइड) के इंजेक्शन के माध्यम से एंडोथेलियम के विनाश पर ध्यान केंद्रित करते हैं या एक आक्रामक डेसेमेटोरेक्सिस तकनीक7,,8का उपयोग करके कोशिकाओं के यांत्रिक घर्षण द्वारा। हालांकि ये मॉडल अच्छी तरह से स्थापित हैं, सामान्य भड़काऊ प्रतिक्रिया और गलत संपाश्र्वक क्षति जैसे नुकसान मौजूद हैं। इसलिए, इन मॉडलों को बीमारी के अंतिम चरणों का प्रतिनिधित्व करने की अधिक संभावना होती है, जब उपर्युक्त सर्जिकल विकल्प अपरिहार्य होते हैं।
स्टेम सेल और जीन थेरेपी जैसे सेलुलर उपचार रणनीतियों में प्रगति के साथ, इन सेलुलर उपचारों का अनुप्रयोग सीईसी हानि9के प्रारंभिक चरणों में उपयोगी हो सकता है। बाद में, हमें एक ऐसे मॉडल की आवश्यकता है जो रोग के इन पहले के चरणों का अधिक पर्याप्त रूप से प्रतिनिधित्व करता है । इस संबंध में, सेल संस्कृति मॉडल पिछले दशक में सुधार हुआ है, लेकिन अभी भी उनकी वैधता में सीमित हैं, क्योंकि विट्रो में कोशिकाएं कॉर्निया10के भीतर विभिन्न सेल प्रकारों के बीच होने वाली जटिल बातचीत को दोहराने के करीब नहीं आ सकतीहैं। इसलिए, पूर्व वीवो और वीवो रोग मॉडल में अभी भी उच्च मांग में हैं और मौजूदा लोगों में सुधार अत्यंत रुचि है।
एक नियोडिमियम का उपयोग करके फोटोव्यवधान द्वारा Noninvasive, इंट्राओकुलर सर्जरी: YAG (Nd:YAG) लेजर 1970 के दशक के अंतमें 11में अपनी शुरुआत के बाद से दुनिया भर में नेत्र रोग विशेषज्ञों के लिए एक नियमित प्रक्रिया बन गया है । फोटोव्यवधान nonlinear प्रकाश अवशोषण पर निर्भर करता है जिससे प्लाज्मा का गठन, ध्वनिक सदमे तरंगों की पीढ़ी, और कैविटेशन बुलबुले का निर्माण होता है, जब भी आवेदन साइट तरल वातावरण12में स्थित होती है। सामान्य तौर पर, ये प्रक्रियाएं सटीक ऊतक काटने के अभीष्ट प्रभाव में योगदान देती हैं। हालांकि, वे लेजर सर्जरी13के स्थानीय कारावास को सीमित करने वाले अनावश्यक जमानत क्षति का स्रोत भी हो सकते हैं।
परिणामस्वरूप यांत्रिक प्रभावों की भविष्यवाणी में शॉक वेव प्रचार और कैविशन कोर्स के लक्षण वर्णन के माध्यम से काफी सुधार हुआ है। सीईसी हानि के प्रारंभिक चरणों के लिए एक गैर-आक्रामक, लेजर-सहायता प्राप्त प्रयोगात्मक रोग मॉडल प्रदान करने के लिए संभव के रूप में आसपास के ऊतकों को कम नुकसान के साथ सीईसी को लक्षित करना हमारा लक्ष्य है। इस उद्देश्य के लिए, लेजर के फोकल स्पॉट की इष्टतम नाड़ी ऊर्जा और स्थितियों को निर्धारित करना आवश्यक है।
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Protocol
पशु ऊतक ों से जुड़ी सभी प्रक्रियाएं स्थानीय पशु देखभाल और नैतिकता समिति के दिशा-निर्देशों का पालन करती हैं ।
1. अंग संस्कृति और लेजर उपचार की तैयारी
- स्थानीय बूचड़खाने से हौसले से एन्यूक्लिट पोर्सिन आंखें प्राप्त करें। उन्हें शांत रखें (4 डिग्री सेल्सियस) उच्च ग्लूकोज के साथ Dulbecco संशोधित ईगल माध्यम (DMEM) में, एल ग्लूटामाइन, सोडियम पायरुवेट, पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन (1%), और पोर्सिन सीरम (10%), अब से इस लेख में पूर्ण माध्यम के रूप में संदर्भित के साथ पूरक ।
- कैंची के साथ बाह्य ऊतकों को हटा दें और उपयोग तक उन्हें निष्फल फॉस्फेट-बफरलव (पीबीएस) में रखने से पहले 5 मिन के लिए 5% पोविडोन-आयोडीन नेत्र समाधान में आंखों को भिगो दें।
- प्रमुख पूर्वकाल खंड विकृतियों के लिए स्क्रीन आंखें, जैसे कॉर्नियल स्काररिंग, एडीमा, और अन्य अस्पष्टता एक स्पेक्ट्रल-डोमेन ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी डिवाइस(सामग्री की तालिका) केसाथ।
- एक भट्ठा लैंप एक Nd: YAG लेजर(सामग्री की मेज),जो १,०६४ एनएम की तरंगदैर्ध्य और हवा में 10 μm के एक फोकल स्पॉट व्यास है के साथ सुसज्जित इकाई के सामने आंखों की स्थिति ।
नोट: इष्टतम स्थिति के लिए एक 3 डी मुद्रित होल्डिंग उपकरण का उपयोग किया जाता है, जो आंख फर्म पकड़ करने के लिए डिज़ाइन किया गया था, उस पर बहुत अधिक दबाव डालने के बिना(चित्रा 1)। - 12x के आवर्धन का उपयोग करें और व्यक्तिगत कॉर्नियल परतों की कल्पना करने के लिए रोशनी को मोड़ना।
- एंडोथेलियल कोशिकाओं के चयनात्मक एब्लेशन के लिए पल्स एनर्जी (जैसे, 1.6 एमजे) और फोकस पॉइंट (जैसे, 0.16 मिमी) सेट करें।
- लिम्बस के करीब एक स्पष्ट कॉर्निया पैरासेंटेसिस रखें और पूर्वकाल कक्ष को स्थिर करने के लिए चिपचिपा(सामग्री की तालिका)इंजेक्ट करें।
- एक्साइज लेजर का इलाज सेंट्रल कॉर्निया एक 8 मिमी ट्रेफिन का उपयोग कर ।
- एक्साइज्ड कॉर्निया को 12-वेल प्लेट के कुएं में रखें, जिसमें एंडोथेलियल साइट ऊपर की ओर सामना कर रही है और 3 दिनों तक 37 डिग्री सेल्सियस पर पूर्ण माध्यम के 3 mL में नमूना इनक्यूबेट करें।
नोट: इस चरण के दौरान संभावित साइटोप्रोटेक्टिव एजेंटों को माध्यम में जोड़ा जा सकता है।
2. हिटोलॉजी के लिए तैयारी
- 7.4 के पीएच के साथ सोरेनसेन के बफर को तैयार करें जिसमें 133 एम एम एच2पीओ4 का 19.6 मीटर और 133 एमएम एनए2एचपीओ4का 80.4 एमएल शामिल है।
- कॉर्निया युक्त अच्छी तरह से से माध्यम निकालें और मेथनॉल मुक्त पैराफॉर्मलडिहाइड (4%) सोरेनसेन के बफर में।
- पीबीएस में 20% सुक्रोज में ऊतक रखें जब तक ऊतक डूब (1 एच) और फिर पीबीएस में 30% सुक्रोज में रातोंरात आरटी में। बुलबुले और हवा की सतह इंटरफेस के साथ संपर्क से बचने के लिए ध्यान रखें। इष्टतम काटने के तापमान (OCT) यौगिक में ऊतक एम्बेड करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- -27 डिग्री सेल्सियस पर क्रायोस्टेट का उपयोग करके 10 माइक्रोन मोटी धाराओं में कटौती करें।
नोट: एक ऊंट हेयरब्रश चाकू ब्लेड पर उभरते अनुभाग मार्गदर्शन में मदद करने के लिए उपयोगी है। - ऊतक को फ्रीज-सुखाने से बचने के लिए इसे काटने के 1 मिनट के भीतर ऊतक को स्लाइड को छूकर अनुभाग को माइक्रोस्कोप स्लाइड में स्थानांतरित करें। स्लाइड्स में -80 डिग्री सेल्सियस स्टोर करें।
3. हेमातक्सीलिन और इओसिन (एच एंड ई) धुंधला
- नमी को दूर करने के लिए कई मिनट तक हवा शुष्क होती है।
- 50 मीटर ट्यूब में 10 मिन के लिए फ़िल्टर किए गए 0.1% मेयरहेटॉक्सीलिन के साथ दाग।
- एक Coplin जार में, 5 मिन के लिए शांत चल ddH2O में कुल्ला और 0.5% eosin 10x में डुबकी।
- डीडीएच2ओ में डुबकी जब तक eosin लकीर बंद हो जाता है और फिर 50% (10x) के साथ ही 70% (10x) EtOH में डुबकी.
- जाइलीन में कई बार सूई से पहले 95% EtOH (30 s) और 100% EtOH (60 s) में इक्विब्रेट करें।
- अंत में माउंट और एक हल्के माइक्रोस्कोप का उपयोग कर छवियों को लेने से पहले नमूना कवर।
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Representative Results
यहां प्रस्तुत प्रक्रिया का उपयोग करते हुए, हमने एनडी: वाईएजी लेजर के साथ आंखों का इलाज किया, विभिन्न पल्स ऊर्जा (1.0−4.6 एमजे) और फोकल पॉइंट्स (कॉर्निया की पीछे की सतह से दूरी) की स्थिति का मूल्यांकन किया ताकि इष्टतम मापदंडों को ढूंढा जा सके। लेजर मापदंडों (12 x 21) के प्रत्येक नक्षत्र के लिए कई प्रतिकृतियों (एन = 3) का मूल्यांकन किया गया था।
उपर्युक्त प्रोटोकॉल के अलावा, निर्धारण और एच एंड ई धुंधला होने से पहले दो फोटॉन माइक्रोस्कोप के साथ नमूना का विश्लेषण किया गया था। दो फोटॉन माइक्रोस्कोप ने एक ठोस-राज्य, मोड-लॉक किए गए 80 मेगाहर्ट्ज टीआई: नीलम लेजर का उपयोग 690−1b040 एनएम की ट्यूनिंग रेंज के साथ और प्रकाश स्रोत के रूप में 800 एनएम पर >900 मेगावाट का एक मतलब लेजर आउटपुट किया। इसने नमूने में लगभग 150 एफएस की चौड़ाई के साथ दालें वितरित कीं। छवियों को एक माइक्रोस्कोप उद्देश्य (20x/0.95) के साथ ७३० एनएम और लेजर पावर के 30 मीटर की तरंगदैर्ध्य पर लिया गया ।
दो फोटॉन के साथ-साथ प्रकाश माइक्रोस्कोपी छवियों की स्वतंत्र रूप से 3 समीक्षकों द्वारा समीक्षा की गई थी, जिन्हें प्रायोगिक सेटिंग्स से अंधा कर दिया गया था और छवियों को तीन श्रेणियों में आवंटित करना था: (1) कोई नुकसान नहीं, (2) बहुत अधिक क्षति, या (3) क्षति की सही मात्रा(चित्रा 2 और चित्रा 3)। उनके मूल्यांकन के आधार पर एक हीटमैप की गणना की गई थी(चित्रा 4)। इस हीटमैप का उपयोग करके लेजर मापदंडों के सही नक्षत्र का चयन कर के लिए चुनिंदा आसपास के ऊतकों (हरे) को ंयूनतम क्षति के साथ सीईसी त्याग संभव है । परिणाम बताते हैं कि लेजर का केंद्र बिंदु सबसे कम पल्स ऊर्जा (1.0 एमजे) परीक्षण के लिए कॉर्नियल एंडोथेलियम के पीछे कम से कम 0.15 मिमी होना चाहिए। 2.9 एमजे से अधिक पल्स ऊर्जा के लिए, सबसे लंबी फोकल दूरी का परीक्षण (0.2 मिमी) अभी भी एंडोथेलियम के बहुत करीब है।
चित्रा 1: प्रायोगिक सेटअप। (A)आंखें आंशिक रूप से 3 डी-मुद्रित होल्डिंग उपकरण में तय की गई थीं, जिसने लेजर बीम के संबंध में सटीक संरेखण की अनुमति दी थी। (ख)लेजर उपचार से पहले, ऊतक का मूल्यांकन एक पूर्वकाल खंड ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी डिवाइस के साथ किया गया था ताकि प्रमुख पूर्वकाल खंड विकृतियों की जांच की जा सके । फोकल लेजर पॉइंट्स की स्थिति 0.0 मिमी (ब्लैक तारक), 0.1 मिमी (लाल तारक), और 0.2 मिमी (ब्लू तारक) के लिए अनुकरणीय के साथ इंगित की जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: दो फोटॉन माइक्रोस्कोपी। परिणाम एंडोथेलियल कोशिकाओंA(सी)के चयनात्मक एब्लेशन तक कोई नुकसान नहींCपहुंचा । लाल तीर सिर एक उठी Descemet झिल्ली से पता चलता है, और हरे तीर सीईसी-समूहों के चयनात्मक एब्लेशन का संकेत मिलता है । स्केल बार = 100 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: हिटोलॉजी। हेमैटोक्सिलिन और इओसिन धुंधला ने एंडोथेलियल कोशिकाओं(सी)के चयनात्मक एब्लेशन तक नुकसानकीपुष्टि की।C लाल तीर सिर एक उठी Descemet झिल्ली से पता चलता है, और हरे तीर सीईसी-समूहों के चयनात्मक एब्लेशन का संकेत मिलता है । स्केल बार = 100 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: एक हीटमैप जिसमें चयनात्मक सीईसी क्षति की संभावना दिखाई गई है। इस संबंध में, नाड़ी ऊर्जा के साथ-साथ एनडीएजी लेजर फोकल प्वाइंट की स्थिति को ध्यान में रखा जाना चाहिए। अत्यधिक क्षति लाल रंग में दिखाई जाती है, और नुकसान का वांछित हिस्सा हरे रंग में दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
इस प्रायोगिक अध्ययन के परिणामों से संकेत मिलता है कि एक Nd: YAG लेजर चुनिंदा कॉर्नियल एंडोथेलियल कोशिकाओं को त्यागने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जब ऊर्जा की खुराक और फोकस बिंदु की स्थिति के लिए उपयुक्त मापदंडों को चुना जाता है ।
चूंकि एंडोथेलियल फ़ंक्शन कॉर्नियल पारदर्शिता और स्ट्रोमल एडीमा से कॉर्निया की सुरक्षा के लिए महत्वपूर्ण है, इसलिए एंडोथेलियल डिसफंक्शन के मॉडल एंटी-एडेमेटस दवाओं या सर्जिकल प्रक्रियाओं के विकास में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। वीवो स्थिति10,,14,,15में नकल करने के लिए कई स्थापित विट्रो मॉडल हैं, लेकिन जैसा कि आम तौर पर जाना जाता है, इन विट्रो मॉडल एंजाइमों और साइटोकिन्स के प्रभावों या सेल-सेल-इंटरैक्शन के प्रभाव की पूरी तरह से अनुकरण नहीं कर सकते हैं। इसके विपरीत, एंडोथेलियल सेल हानि का यह नव विकसित पूर्व वीवो मॉडल प्राकृतिक पर्यावरण में रोग के विभिन्न राज्यों और कॉर्नियल डिकॉम्पेसेशन की निगरानी करने की संभावना प्रदान करता है।
के रूप में हमारे मॉडल में कॉर्निया लेजर प्रक्रिया के बाद एक ट्रेफिन के साथ excised है, कॉर्निया परिवर्तन के शरीर विज्ञान और इन विट्रो स्थिति के समान, क्षेत्रीय बातचीत काफी बाधित कर रहे हैं । हालांकि, स्थानीय इंटरफ़ेस बरकरार रहता है और विशेष रूप से कॉर्निया के भीतर अन्य कोशिकाओं के लिए सेलुलर संचार बनी रहती है। हमारे अध्ययन से पता चला है कि इन परिस्थितियों में कॉर्निया संस्कृति में तीन दिनों के लिए अपने कार्य को बनाए रखता है, जो संभावित चिकित्सीय एजेंटों का निरीक्षण और मूल्यांकन करने के लिए पर्याप्त समय प्रदान करता है । दूसरी ओर, पुराने चिकित्सा प्रक्रियाओं की जांच नहीं की जा सकती है।
हमारे मॉडल में, हम उन की बड़ी मात्रा के रूप में पोर्सिन आंखों का इस्तेमाल आसानी से प्राप्त किया जा सकता है । इसके अलावा, पोर्सिन आंखें मानव आंखों की बहुत अच्छी तरह से नकल करते हैं। प्रयोग के लिए नियमित रूप से उपयोग किए जाने वाले खरगोशों के विपरीत, पोर्सिन आंखों में बोमन की झिल्ली होती है। फिर भी, पोर्सिन आंख की कॉर्नियल मोटाई मानव आंख से काफी अलग है। विशेष रूप से, पोर्सिन स्ट्रोमा बहुत मोटा है और पोर्सिन कॉर्निया16में केंद्रीय और परिधीय मोटाई में कोई अंतर नहीं है। यह भी विचार किया जाना चाहिए कि मानव सीईसी में कोई चिकित्सा क्षमता नहीं है जबकि इस पुनर्योजी सुविधा कुछ जानवरों में सूचित की जाती है, जैसे सूअर और खरगोश17,,18। हमारे अध्ययन घाव चिकित्सा प्रक्रियाओं पर ध्यान केंद्रित नहीं किया था, लेकिन इस अंतर को ध्यान में रखा जाना चाहिए जब परिणाम अनुवाद । चूंकि पशु सीईसी का घाव उपचार चार दिनों से अधिक नहीं है, इसलिए इसे अभी भी हमारे सुसंस्कृत ऊतकों में देखा जा सकता है, भले ही वे केवल तीन दिनों तक चलें।
पिछले अध्ययनों के साथ हमारे प्रयोगात्मक सेटअप की तुलना, लागू ऊर्जा का स्तरसमान 19थे । केवल एंडोथेलियम पर फोकस करने के बजाय फोकल प्वाइंट्स के अलग-अलग स्थानों का मूल्यांकन किया गया। इसलिए, पहले के अध्ययनों के लिए हमारे सेटअप का मुख्य अंतर डीएम या स्ट्रोमल ऊतक को नुकसान पहुंचाए बिना विशिष्ट एंडोथेलियल क्षति को प्रेरित करने की क्षमता है। ऊर्जा खुराक और फोकस स्थिति की सटीक निगरानी कॉर्निया के अन्य हिस्सों को सदमे तरंग क्षति के कारण बिना चयनात्मक सीईसी एब्लेशन को सक्षम बनाती है। इसके अलावा, हमने लेजर उपचार20के बाद सीधे स्ट्रोमल या सबेपिथेलियल एडीमा पर ध्यान नहीं दिया है।
पिछले अध्ययन से पता चला है कि ~ 40 डिग्री सेल्सियस के तापमान से सीईसी को नुकसान हो सकता है21. हमने प्रेरित तापमान को मापनहीं किया, लेकिन यह आगे की पढ़ाई के लिए रुचि का हो सकता है । इसके अलावा, विभिन्न प्रकार के लेजर सिस्टम के प्रभाव का मूल्यांकन किया जाना चाहिए। इससे पहले के अध्ययनों से पता चला है कि लेजर प्रेरित सिरखती सीईसी क्षति और अन्य सीईसी चोटों19,22के बीच अंतर है । यह मानव ऊतक और रोगों की तुलना को भी सीमित कर सकता है क्योंकि लेजर प्रेरित क्षति विभिन्न रोग विकास प्रक्रियाओं द्वारा अपनाई जाती है। दिलचस्प बात यह है कि लेजर आवेदन के बाद घाव भरने पहले अध्ययन19में जला डीएम पर बंद कर दिया । अगर डीएम बरकरार रहते हैं तो चोट का स्रोत कम महत्वपूर्ण हो सकता है ।
उच्च ऊर्जा का स्तर विस्तारित चोट22का खतरा अधिक पैदा कर सकता है । हमारे परिणाम बताते हैं कि चयनात्मक सीईसी क्षति के लिए उच्च ऊर्जा स्तर (<2.9 mJ) का उपयोग करने के लिए एक सख्त फोकस रेंज की आवश्यकता होती है। जबकि सीईसी को नुकसान यांत्रिक रूप से पिछले अध्ययनों में लागू किया गया था17,लेजर प्रेरित नुकसान यहां इस्तेमाल किया घाव की एक और अधिक सटीक खुराक है और आसानी से वीवो अध्ययन में इस्तेमाल किया जा सकता है ।
यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इस प्रोटोकॉल के अनुसार केवल कम संख्या में आंखों का इलाज और जांच की गई है। जैसा कि ऊपर बताया गया है, लेजर उपचार के जवाब में अंतरगत अंतर के साथ-साथ विभिन्न पशु प्रजातियों के कॉर्निया के बीच मतभेद हो सकते हैं। चूंकि सीईसी क्षति को विभिन्न केंद्र पदों पर उत्पादित किया जा सकता है, इसलिए विस्तारित क्षति से बचने के लिए कुछ थ्रेसहोल्ड को पार नहीं किया जाना चाहिए।
अंत में, इस अध्ययन में उत्पन्न घावों को मध्य भाग में रखा गया था। पोर्सिन आंखों के एक पूर्व अध्ययन कॉर्नियल परिधि में त्वरित घाव उपचार दिखाया, जो लिंबल स्टेम सेल17 के लिए अपनी निकटता के कारण हो सकता है के रूप में पोर्सिन आंखों में कॉर्नियल मोटाई क्षेत्रों के बीच अलग नहीं है । भविष्य के अध्ययनों में इसका मूल्यांकन किया जाना चाहिए कि क्या कॉर्निया के केंद्र से परिधि में स्विच करते समय लेजर मापदंडों को समायोजित किया जाना चाहिए।
निष्कर्ष में, हमारा अध्ययन सीईसी शिथिलता पर आगे की जांच के लिए एक noninvasive मॉडल का परिचय देता है । मानव ऊतक के बजाय पशु के उपयोग के मामले में पूर्व वीवो या वीवो अध्ययनों की सीमाएं बनी हुई हैं और परिणामों की व्याख्या करते समय इस पर विचार किया जाना चाहिए।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
हम प्रयोगात्मक तरीकों के साथ उनकी मदद के लिए क्रिस्टीन Örün और जन ए एम Sochurek शुक्रिया अदा करते हैं ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BARRON VACUUM TREPHINE | Katena | K20-2058 | |
| Cryostat | Leica | CM 3050S | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose | PAA | E-15009 | |
| Eye holder | Self | N/A | |
| Inverted Microscope | Leica | DMI 6000 B | |
| KH2PO4 | Merck | 529568 | |
| Na2HPO4 | Merck | 1065860500 | |
| Nd:YAG laser | Zeiss Meditec | visuLAS YAG II plus | |
| OCT Tissue Tek | Sakura Finetechnical | 4583 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010056 | |
| Porcine serum | Sigma-Aldrich | 12736C | |
| Spectral-domain optical coherence tomograph | Heidelberg Engineering | Spectralis | |
| Tissue culture plate 12-well | Sarstedt | 833921 | |
| Two-Photon Microscope | JenLab | DermaInspect | |
| Viscoelastic | OmniVision | Methocel |
References
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