Summary
여기에서, 우리는 네오디뮴을 사용하여 Descemet의 막 (DM)에서 각막 내피 세포 (CEC)를 분리하는 프로토콜을 제시합니다:YAG (Nd:YAG) 레이저는 bullous 각화증 (BK)를 위한 전 생체 내병 모형으로.
Abstract
Nd:YAG 레이저는 지금 수십 년 동안 capsulotomy와 같은 비침범성 안구 수술을 수행하는 데 사용되었습니다. 절개 효과는 레이저 초점의 광학 고장에 의존합니다. 음향 충격파와 캐비테이션 버블이 발생하여 조직 파열을 일으킵니다. 기포 크기와 압력 진폭은 펄스 에너지와 초점 위치에 따라 달라집니다. 본 연구에서, 핵핵 돼지 눈은 시판되는 Nd:YAG 레이저 앞에 위치시켰다. 가변 펄스 에너지뿐만 아니라 각막에 대한 초점 반점 후방의 상이한 위치를 시험했다. 결과 병변은 최소한의 부수적 손상으로 각막 내피 세포 (CEC)의 독점적 인 분리를위한 최상의 매개 변수를 결정하기 위해 2 광자 현미경 검사법과 조직학에 의해 평가되었다. 이 방법의 장점은 CEC의 정밀한 절제, 감소된 부수적 손상, 그리고 무엇보다도 비접촉 식 치료입니다.
Introduction
각막의 투명성은 망막과 광수용체에 빛의 투과에 필수적이다1. 이와 관련하여, 탈수의 상대적인 상태는 각막 기질 내의 콜라겐 섬유를 정확하게 정렬시키는 데 중요합니다. 이 항상성은 Descemet의 막에 있는 각막 내피 세포 (CEC)에 의해 유지됩니다 (DM)2. 내피는 가장 안쪽 각막 층입니다. 그것은 각막 투명성에 중요한 장벽과 펌프 기능을 가지고3. 상피와는 달리, 내피는 자기 갱신 할 수 없습니다4. 따라서 질병 이나 외상으로 인한 임의의 세포 손상은 남은 내피 세포를 자극하여 확대 및 마이그레이션하고, 그로 인한 결함을 커버하고 각막 기능을 유지한다5. 그러나 CEC 밀도가 임계 값 이하로 떨어지면 내피의 부전이 발생하여 시력이 흐려지고 불편함이 생기거나 심한통증이 발생합니다 4. 증상을 완화하는 약물의 가용성에도 불구하고, 현재 이러한 경우 유일한 확실한 치료는 각막 이식이며, 이는 전체 두께 이식 또는 라멜라 내피 이식의 형태로 수행 될 수 있습니다. 후자의 절차는 Descemet의 막 내피 각막 각질 성형술 (DMEK)뿐만 아니라 Descemet의 스트리핑 자동화 된 내피 각막 성형술6(DSAEK)6으로 사용할 수 있습니다. 그러나, 남아 있는 CEC의 보호 및 그들의 생존을 강화하는 것은 잠재적인 치료 약을 시험하기 위하여 적당한 질병 모형을 필요로 하는 대체 표적이 될 수 있었습니다.
현재 CEC 손실 질환 모델은 침습적 데시메터헥시스 기술을 사용하여 전위 챔버 내로 또는 세포의 기계적 마모에 의한 독성 제제(예를 들어, 벤잘코늄 염화물)의 주입을 통한 내피의 파괴에 초점을 맞추고있다.,8 이 모형은 잘 설치되는 동안, 일반적인 선동적인 반응 및 부정확한 부수적인 손상과 같은 단점이 존재합니다. 따라서, 이 모형은 전술한 외과 선택권이 불가피할 때 질병의 마지막 단계를 나타낼 확률이 높습니다.
줄기 세포 및 유전자 치료와 같은 세포 치료 전략의 발전과 함께, 이러한 세포 치료법의 적용은 CEC 손실9의초기 단계에서 유용 할 수 있습니다. 그 후, 우리는 질병의 이 초기 단계를 더 적당하게 나타내는 모형이 필요합니다. 이와 관련하여, 세포 배양 모델은 지난 10년 동안 개선되었지만, 시험관내 세포가 각막내의상이한 세포 유형 사이에서 발생하는 복잡한 상호작용을 복제하는 데 근접할 수 없기 때문에 그들의 타당성은 여전히 제한적이다. 따라서, 생체내 및 생체내 질환 모델은 여전히 수요가 많고 기존 것들을 개선하는 것이 가장 큰 관심사이다.
네오디뮴을 사용하여 사진 파괴에 의한 비침습적, 안구 내 수술:YAG (Nd:YAG) 레이저는 1970년대 후반11에도입된 이래 전 세계 안과 의사를 위한 일상적인 절차가 되었습니다. 광파괴는 적용 부위가 액체 환경에 위치할 때마다 플라즈마의 형성, 음향 충격파의 생성 및 캐비테이션 기포의 생성으로 이어지는 비선형 광 흡수에 의존한다12. 일반적으로, 이러한 과정은 정확한 조직 절단의 의도 된 효과에 기여한다. 그러나, 이들은 또한 레이저수술(13)의국소 감금을 제한하는 불필요한 부수적 손상의 원인이 될 수 있다.
충격파 전파 및 캐비테이션 과정의 특성화를 통해 기계적 효과의 예측이 크게 향상되었습니다. CEC 손실의 초기 단계에 대한 비침습적, 레이저 보조 실험 적 질병 모델을 제공하기 위해 가능한 한 주변 조직에 대한 손상이 적은 CEC를 대상으로하는 것이 우리의 목표입니다. 이를 위해, 최적의 펄스 에너지와 레이저의 초점 반점의 위치를 결정할 필요가있다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
동물 조직과 관련된 모든 절차는 지역 동물 관리 및 윤리 위원회의 지침을 따릅니다.
1. 장기 배양 및 레이저 치료 준비
- 현지 아바토이르에서 갓 핵을 얻은 돼지 눈을 얻으실 수 있습니다. L-글루타민, 피루비테 나트륨, 페니실린/스트렙토마이신(1%), 돼지 혈청(10%)으로 보충된 높은 포도당으로 덜베코의 변형된 이글 배지(DMEM)에서 시원하게(4°C) 유지하고, 돼지 혈청(10%)을 이 기사에서 전체 배지로 지칭합니다.
- 가위로 세포 외 조직을 제거하고 사용할 때까지 멸균 된 인산 완충 식염수 (PBS)에 넣기 전에 5 분 동안 5 % 포비도 요오드 안과 용액에 눈을 담그십시오.
- 각막 흉터, 부종 및 스펙트럼 도메인 광학 일관성 단층 촬영 장치(재료표)와같은 주요 전방 세그먼트 병리에 대한 화면 눈.
- 1,064 nm의 파장과 10 μm의 초점 공대 직경을 가진 Nd:YAG 레이저(재료 표)가장착 된 슬릿 램프 장치 앞에 눈을 배치하십시오.
참고 : 최적의 위치 지정을 위해 3D 인쇄 된 홀딩 장치가 사용되며, 이는 너무 많은 압력을 가하지 않고 눈을 단단히 고정하도록 설계되었습니다(그림 1). - 12배배의 배율을 사용하고 조명을 편향하여 개별 각막 층을 시각화합니다.
- 내피 세포의 선택적 절제에 대한 펄스 에너지(예를 들어, 1.6 mJ) 및 초점 포인트(예를 들어, 0.16 mm)를 설정합니다.
- 사지에 가까운 명확한 각막 파라센티스를 배치하고 점탄성(재료의 표)를주입하여 전방 챔버를 안정화시다.
- 8mm 트레핀을 사용하여 레이저 처리 된 중앙 각막을 절제하십시오.
- 절제된 각막을 내피 부위가 위쪽을 향하는 12웰 플레이트의 우물에 놓고 37°C에서 37°C에서 3 mL의 시편을 최대 3일 동안 배양한다.
참고: 이 단계에서 잠재적인 세포 보호 제는 배지에 첨가될 수 있습니다.
2. 역학 준비
- 133 mM KH2PO4 및 133 mM Na2HPO4의80.4 mL의 19.6 mL를 포함하는 7.4의 pH로 소렌슨의 버퍼를 준비한다.
- 메탄올이 함유된 배지를 잘 함유하고 실온(RT)에서 20분 동안 조직을 고정하여 메탄올이 없는 파라포름알데히드(4%)를 사용한다. 소렌슨의 버퍼에 있습니다.
- 조직이 가라 앉을 때까지 PBS에서 20 % 자당에 조직을 놓고 (1 시간) 다음 RT에서 밤새 PBS에서 30 % 자당에. 기포와 공기 표면 인터페이스와의 접촉을 피하기 위해주의하십시오. 최적의 절삭 온도 (OCT) 화합물에 조직을 포함하고 -80 °C에서 저장합니다.
- -27°C에서 저온 중지를 사용하여 10 μm 두께의 절편을 절단합니다.
참고: 낙타 헤어브러시는 칼날 위로 새롭게 떠오르는 부분을 안내하는 데 유용합니다. - 슬라이드를 절단 한 후 1 분 이내에 조직에 슬라이드를 터치하여 현미경 슬라이드로 섹션을 옮겨 조직의 동결 건조를 피하십시오. 슬라이드를 -80°C에서 보관합니다.
3. 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색
- 수분을 제거하기 위해 몇 분 동안 공기 건조 섹션.
- 50 mL 튜브에서 10 분 동안 0.1 % 메이어 스 헤마톡클린을 걸러진 얼룩.
- 코플린 항아리에 시원한 달리기 ddH2O로 5분간 헹구고 0.5% 에오신 10배로 찍어 드세요.
- ddH2O에 찍어 서신이 줄무늬를 멈출 때까지 담근 다음 50% (10x) 및 70% (10x) EtOH에 담급니다.
- 자일렌에 여러 번 담그기 전에 95 % EtOH (30 s) 및 100 % EtOH (60 s)에서 평형화하십시오.
- 마지막으로 가벼운 현미경을 사용하여 이미지를 촬영하기 전에 시편을 장착하고 덮습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
여기에 제시된 절차를 사용하여, 우리는 Nd:YAG 레이저로 눈을 치료하고, 다른 펄스 에너지 (1.0-4.6 mJ)와 초점 의 위치 (각막의 후방 표면에서 의 거리 : 0.0-0.2 mm)를 평가하여 최적의 매개 변수를 찾습니다. 다중 복제(n=3)는 레이저 파라미터(12 x 21)의 각 별자리에 대해 평가되었다.
전술한 프로토콜 이외에, 시편은 고정 및 H&E 염색 전에 2광자 현미경으로 분석되었다. 2광자 현미경은 690-1b040 nm의 튜닝 범위와 800 nm에서 800 nm의 평균 레이저 출력을 가진 고체, 모드 잠금 80 MHz Ti: 사파이어 레이저를 사용했습니다. 그것은 샘플에 약 150 fs의 폭으로 펄스를 전달했다. 730 nm 및 30 mW의 레이저 전력파장에서 현미경 대물량(20x/0.95)으로 이미지를 촬영했습니다.
2 광자뿐만 아니라 가벼운 현미경 이미지는 실험 설정에 눈이 멀고 (1) 손상 없음, (2) 너무 많은 손상 또는 (3) 적당한 양의 손상의 세 가지 범주에 이미지를 할당해야했던 3 명의 검토자에 의해 독립적으로 검토되었습니다(그림 2 및 그림 3). 이들의 평가에 기초하여 히트맵을 계산하였다(도4). 이 히트맵을 사용하여 레이저 파라미터의 오른쪽 별자리를 선택하여 주변 조직(녹색)에 대한 손상을 최소화하면서 CEC를 선택적으로 절제할 수 있습니다. 결과는 레이저의 초점이 가장 낮은 펄스 에너지 (1.0 mJ) 테스트에 대한 각막 내피 뒤에 적어도 0.15 mm이어야한다는 것을 보여줍니다. 2.9 mJ보다 높은 펄스 에너지의 경우, 테스트된 가장 긴 초점 거리(0.2 mm)는 여전히 내피에 너무 가깝습니다.
그림 1: 실험 설정. (A)레이저 빔에 대하여 정밀한 정렬을 허용하는 부분적으로 3D 프린팅 된 홀딩 장치에 눈을 고정시켰다. (b)레이저 치료 전에, 조직을 전방 세그먼트 광학 일관성 단층 촬영 장치로 평가하여 주요 전방 분절 병리를 확인하였다. 초점 레이저 점의 위치는 0.0 mm (검은 색 별표), 0.1 mm (빨간색 별표) 및 0.2 mm (파란색 별표)에 대한 예시로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 2 광자 현미경 검사법. 결과는 전혀 손상없음(A),광범위한 부수적 손상(B)내피 세포의 선택적 절제(C)에이르기까지 다양합니다. 빨간색 화살촉은 파열된 Descemet의 멤브레인을 표시하고 녹색 화살촉은 CEC 클러스터의 선택적 절제를 나타냅니다. 배율 표시줄 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 학문. 헤마톡실린 및 에오신 염색은 내피 세포의 선택적 절제(C)에 이르기까지 전혀 손상되지 않음(A), 광범위한C부수적A손상(B)에서손상 범위를 확인하였다. 빨간색 화살촉은 파열된 Descemet의 멤브레인을 표시하고 녹색 화살촉은 CEC 클러스터의 선택적 절제를 나타냅니다. 배율 표시줄 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 선택적 CEC 손상 확률을 보여주는 히트맵입니다. 이와 관련하여, 펄스 에너지뿐만 아니라 Nd:YAG 레이저 초점의 위치를 고려해야 한다. 과도한 손상은 빨간색으로 표시되고 원하는 손상 부분은 녹색으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이 파일럿 연구의 결과는 Nd:YAG 레이저가 에너지 용량 및 초점 포인트 위치에 대한 적절한 매개 변수가 선택적으로 각막 내피 세포를 ablate하는 데 사용할 수 있음을 나타냅니다.
내피 기능은 각막 투명성과 기질 부종에서 각막을 보호하기 위해 중요하기 때문에, 내피 기능 장애의 모델은 항 부종 약물 이나 외과 적 절차의 개발에 중요한 역할을한다. 생체 내 상황10,,14,,15를모방하기 위한 몇 가지 확립된 시험관내 모델이 있지만, 일반적으로 공지된 바와 같이, 시험관내 모델은 효소 및 사이토카인의 영향 또는 세포-세포 상호작용의 효과를 완전히 모방할 수 없다. 대조적으로, 내피 세포 손실의 이 새로 개발된 생체 내 비보 모델은 자연 환경에서 질병의 상이한 상태 및 각막 하보상을 모니터링할 수 있는 가능성을 제공한다.
우리의 모형에 있는 각막은 레이저 절차 후에 trephine로 절제되기 때문에, 각막의 생리학 변경 및 시험관 내 상황과 유사하게, 지역 상호 작용은 현저하게 방해됩니다. 그러나, 로컬 인터페이스는 그대로 남아 있으며 특히 각막 내의 다른 세포에 대한 세포 통신이 지속됩니다. 우리의 연구 결과는 이 상황에서 각막이 잠재적인 치료에이전트를 관찰하고 평가하기 에 충분한 시간을 제공하는 문화에서 3 일 동안 그것의 기능을 유지한다는 것을 밝혔습니다. 다른 한편으로는, 오랜 치유 과정은 조사 될 수 없습니다.
우리의 모형에서는, 우리는 그(것)들의 더 많은 양이 쉽게 장악될 수 있기 때문에 돼지 눈을 이용했습니다. 게다가 돼지 눈은 인간의 눈을 아주 잘 모방합니다. 정기적으로 실험에 사용되는 토끼와는 달리 돼지 눈은 보우만의 막을 가지고 있습니다. 그럼에도 불구하고 돼지 눈의 각막 두께는 인간의 눈과 상당히 다릅니다. 특히, 돼지기질은 훨씬 두껍고돼지각막(16)에서중앙및 주변두께의 차이가 없다. 또한 돼지와토끼(17,,18)와같은 일부 동물에서 이러한 재생 기능이 보고되는 동안 인간 CEC는 어떠한 치유 능력도 갖지 않는 것으로 간주되어야 한다. 우리의 연구는 상처 치유 과정에 초점을 맞추지 않았다, 하지만이 차이 결과를 번역 할 때 염두에 두어야한다. 동물 CEC의 상처 치유가 4 일을 초과하지 않기 때문에, 3 일 동안만 지속되더라도 배양 조직에서 여전히 관찰 될 수 있습니다.
이전 연구와 우리의 실험 설정을 비교, 적용 된 에너지 레벨은유사했다 19. 내피에만 초점을 맞추는 대신, 초점 포인트의 다른 위치를 평가하였다. 따라서, 이전 연구에 우리의 설정의 주요 차이점은 DM 또는 기질 조직 중 하나를 손상 하지 않고 특정 내 피 손상을 유도 하는 그것의 잠재력. 에너지 용량과 초점 위치를 정확하게 모니터링하여 각막의 다른 부분에 충격파 손상을 일으키지 않으면서 선택적 CEC 절제를 가능하게 합니다. 또한, 우리는 레이저 치료 후 직접 기질 또는 상피 부종을 발견하지 않았습니다20.
이전 연구는 ~ 40 °C의 온도CEC 손상21로이어질 수 있음을 보여 주었다. 우리는 유도된 온도를 측정하지 않았습니다, 그러나 추가 연구 결과를 위한 관심있을지도 모릅니다. 또한, 레이저 시스템의 다른 유형의 효과를 평가해야한다. 이전 연구는 레이저 유도 CEC 손상 및 기타 CEC 부상 사이의 차이를 보였다19,,22. 이것은 또한 레이저 유도한 손상이 다른 질병 발달 프로세스에 선행되는 것처럼 보이기 때문에 인간 조직 및 질병에 비교성을 제한할 수 있습니다. 흥미롭게도, 레이저 응용 프로그램 후 상처 치유는 이전 연구에서 연소 된 DM에서 중지19. DM이 손상되지 않은 상태로 유지되면 부상의 원인이 덜 중요할 수 있습니다.
높은 에너지 레벨은 확장 된 부상의 높은 위험을 제기 할 수 있습니다22. 우리의 결과는 선택적 CEC 손상에 대해 더 높은 에너지 레벨 (<2.9 mJ)을 사용하려면 더 엄격한 초점 범위가 필요하다는 것을 보여줍니다. CEC에 대한 손상은 이전 연구17에서기계적으로 적용되었지만, 여기에 사용된 레이저 유도 손상은 병변의 보다 정밀한 투약을 가지며 생체 내 연구에서 쉽게 사용될 수 있다.
소수의 눈만이이 프로토콜에 따라 치료되고 검사되었음을 주목해야합니다. 위에서 언급 한 바와 같이, 레이저 치료에 대한 반응에 개인마다 차이뿐만 아니라 다른 동물 종의 각막 사이의 차이가있을 수 있습니다. CEC 손상은 서로 다른 초점 위치에서 생성될 수 있기 때문에 확장된 손상을 방지하기 위해 특정 임계값을 초과해서는 안 됩니다.
마지막으로, 본 연구에서 생성된 병변을 중앙 부에 위치. 돼지 눈의 이전 연구는 각막 눈의 각막 두께가 지역마다 다르지 않기 때문에 사지 줄기 세포(17)에 근접하기 때문일 수 있습니다 각막 주변에서 가속 상처 치유를 보여 주었다. 각막의 중심에서 주변으로 전환 할 때 레이저 매개 변수를 조정해야하는지 여부를 향후 연구에서 평가해야합니다.
결론적으로, 우리의 연구는 CEC 기능 장애에 대한 추가 조사를위한 비 침습적 인 모델을 소개합니다. 인간 조직 대신 동물의 사용 측면에서 생체 내 또는 생체 내 연구의 한계가 남아 있으며 결과를 해석 할 때 고려해야합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
실험적인 방법에 도움을 주신 크리스틴 외룬과 얀 A. M. 소추렉에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BARRON VACUUM TREPHINE | Katena | K20-2058 | |
| Cryostat | Leica | CM 3050S | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose | PAA | E-15009 | |
| Eye holder | Self | N/A | |
| Inverted Microscope | Leica | DMI 6000 B | |
| KH2PO4 | Merck | 529568 | |
| Na2HPO4 | Merck | 1065860500 | |
| Nd:YAG laser | Zeiss Meditec | visuLAS YAG II plus | |
| OCT Tissue Tek | Sakura Finetechnical | 4583 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010056 | |
| Porcine serum | Sigma-Aldrich | 12736C | |
| Spectral-domain optical coherence tomograph | Heidelberg Engineering | Spectralis | |
| Tissue culture plate 12-well | Sarstedt | 833921 | |
| Two-Photon Microscope | JenLab | DermaInspect | |
| Viscoelastic | OmniVision | Methocel |
References
- DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract and Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
- Edelhauser, H. F. The balance between corneal transparency and edema: the Proctor Lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (5), 1754-1767 (2006).
- Tuft, S. J., Coster, D. J. The corneal endothelium. Eye. 4, London, England. Pt 3 389-424 (1990).
- Bourne, W. M. Biology of the corneal endothelium in health and disease. Eye. 17, 912-918 (2003).
- He, Z., et al. 3D map of the human corneal endothelial cell. Scientific Reports. 6, 29047 (2016).
- Gain, P., et al. Global Survey of Corneal Transplantation and Eye Banking. JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).
- Schwartzkopff, J., Bredow, L., Mahlenbrey, S., Boehringer, D., Reinhard, T. Regeneration of corneal endothelium following complete endothelial cell loss in rat keratoplasty. Molecular Vision. 16, 2368-2375 (2010).
- Bredow, L., Schwartzkopff, J., Reinhard, T. Regeneration of corneal endothelial cells following keratoplasty in rats with bullous keratopathy. Molecular Vision. 20, 683-690 (2014).
- Bartakova, A., Kunzevitzky, N. J., Goldberg, J. L. Regenerative Cell Therapy for Corneal Endothelium. Current Ophthalmology Reports. 2 (3), 81-90 (2014).
- Zhao, B., et al. Development of a three-dimensional organ culture model for corneal wound healing and corneal transplantation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (7), 2840-2846 (2006).
- Aron-Rosa, D., Aron, J. J., Griesemann, M., Thyzel, R. Use of the neodymium-YAG laser to open the posterior capsule after lens implant surgery: a preliminary report. Journal - American Intra-Ocular Implant Society. 6 (4), 352-354 (1980).
- Vogel, A., Hentschel, W., Holzfuss, J., Lauterborn, W. Cavitation bubble dynamics and acoustic transient generation in ocular surgery with pulsed neodymium: YAG lasers. Ophthalmology. 93 (10), 1259-1269 (1986).
- Vogel, A., Schweiger, P., Frieser, A., Asiyo, M. N., Birngruber, R. Intraocular Nd:YAG laser surgery: laser-tissue interaction, damage range, and reduction of collateral effects. IEEE Journal of Quantum Electronics. 26 (12), 2240-2260 (1990).
- Zhu, Q., Zhu, Y., Tighe, S., Liu, Y., Hu, M. Engineering of Human Corneal Endothelial Cells In Vitro. International Journal of Medical Sciences. 16 (4), 507-512 (2019).
- Li, Z., et al. Nicotinamide inhibits corneal endothelial mesenchymal transition and accelerates wound healing. Experimental Eye Research. 184, 227-233 (2019).
- Pescina, S., et al. Development of a convenient ex vivo model for the study of the transcorneal permeation of drugs: histological and permeability evaluation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (1), 63-71 (2015).
- Smeringaiova, I., et al. Endothelial Wound Repair of the Organ-Cultured Porcine Corneas. Current Eye Research. 43 (7), 856-865 (2018).
- Yamashita, K., et al. A Rabbit Corneal Endothelial Dysfunction Model Using Endothelial-Mesenchymal Transformed Cells. Scientific Reports. 8 (1), 16868 (2018).
- Schubert, H. D., Trokel, S. Endothelial repair following Nd:YAG laser injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (8), 971-976 (1984).
- Zhang, W., et al. Rabbit Model of Corneal Endothelial Injury Established Using the Nd: YAG Laser. Cornea. 36 (10), 1274-1281 (2017).
- McCally, R. L., Bonney-Ray, J., de la Cruz, Z., Green, W. R. Corneal endothelial injury thresholds for exposures to 1.54 micro m radiation. Health Physics. 92 (3), 205-211 (2007).
- Nash, J. P., Wickham, M. G., Binder, P. S. Corneal damage following focal laser intervention. Experimental Eye Research. 26 (6), 641-650 (1978).
