Summary
Her presenterer vi en protokoll for å løsne hornhinne endotelceller (CEC) fra Descemets membran (DM) ved hjelp av en neodymium:YAG (Nd:YAG) laser som en ex vivo sykdommodell for bullous keratopathy (BK).
Abstract
Nd: YAG lasere har blitt brukt til å utføre ikke-invasiv intraokulær kirurgi, som capsulotomy i flere tiår nå. Den incisive effekten er avhengig av den optiske nedbrytningen ved laserfokus. Akustiske sjokkbølger og kavitasjonsbobler genereres, noe som forårsaker vevsbrudd. Boblestørrelser og trykkamplituder varierer med pulsenergi og fokuspunkt. I denne studien ble enucleated svineøyne plassert foran en kommersielt tilgjengelig Nd:YAG laser. Variabel pulsenergier samt ulike posisjoner av brennplassene posterior til hornhinnen ble testet. Resulterende lesjoner ble evaluert av tofotonmikroskopi og histologi for å bestemme de beste parametrene for en eksklusiv løsrivelse av hornhinneendotelceller (CEC) med minimal sikkerhetsskade. Fordelene med denne metoden er nøyaktig ablasjon av CEC, redusert sikkerhet skade, og fremfor alt, ikke-kontakt behandling.
Introduction
Gjennomsiktighet av hornhinnen er avgjørende for overføring av lys til netthinnen og dens fotoreseptorer1. I denne forbindelse er en relativ tilstand av dehydrering avgjørende for å holde kollagenfibrene i hornhinnen stroma riktig justert. Denne homeostase opprettholdes av hornhinnen endotelceller (CEC) som ligger på Descemets membran (DM)2. Endotelet er det innerste hornhinnenlaget. Den har en viktig barriere og pumpefunksjon, som er avgjørende for hornhinnens gjennomsiktighet3. I motsetning til epitelet er epitelet ikke i stand til å fornye4. Derfor stimulerer enhver celleskade forårsaket av sykdom eller traumer de gjenværende endotelcellene til å forstørre og migrere, for å dekke resulterende defekter og for å opprettholde hornhinnefunksjonalitet5. Men hvis CEC tetthet faller under en kritisk terskel, dekompensasjon av endotelet fører til et ødem, noe som resulterer i tåkesyn og ubehag eller til og med alvorlig smerte4. Til tross for tilgjengeligheten av legemidler for å lindre symptomer, er for tiden den eneste definitive behandlingen i disse tilfellene hornhinnetransplantasjon, som kan utføres i form av en fulltykkelsestransplantat eller en lamellær endoteltransplantasjon. Sistnevnte prosedyre er tilgjengelig som Descemets membran endotelkeratoplastikk (DMEK) samt Descemets stripping automatisert endotelkeratoplasty (DSAEK)6. Men, beskyttelse av gjenværende CEC og forbedre deres overlevelse kan være et alternativt mål, som trenger en tilstrekkelig sykdommodell for å teste potensielle terapeutiske legemidler.
Nåværende CEC tap sykdom modeller fokus på ødeleggelse av endotelet gjennom injeksjon av giftige midler (f.eks benzalkonium klorid) inn i fremre kammeret eller ved mekanisk slitasje av cellene ved hjelp av en invasiv descemetorhexis teknikk7,8. Mens disse modellene er godt etablert, finnes ulemper som generell inflammatorisk respons og upresis sivile skader. Derfor er disse modellene mer sannsynlig å representere sluttstadier av sykdommen, når de ovennevnte kirurgiske alternativene er uunngåelige.
Med fremskritt i cellulære behandlingsstrategier som stamceller og genterapi, kan anvendelsen av disse cellulære terapiene være nyttig i tidlige stadier av CEC-tap9. Deretter trenger vi en modell som representerer disse tidligere stadiene av sykdommen mer tilstrekkelig. I denne forbindelse har cellekulturmodeller forbedret seg i løpet av det siste tiåret, men er fortsatt begrenset i deres gyldighet, da celler in vitro ikke kan komme i nærheten av å replikere de komplekse interaksjonene som oppstår mellom de forskjellige celletypene i hornhinnen10. Derfor er ex vivo og in vivo sykdomsmodeller fortsatt i høy etterspørsel og forbedrer de eksisterende er av største interesse.
Ikke-invasiv, intraokulær kirurgi ved fotoavbrudd ved hjelp av en neodym: YAG (Nd:YAG) laser har blitt en rutinemessig prosedyre for øyeleger over hele verden siden introduksjonen på slutten av 1970-tallet11. Photodisruption er avhengig av ikke-lineær lysabsorpsjon som fører til dannelse av plasma, generering av akustiske sjokkbølger og opprettelse av kavitasjonsbobler, når applikasjonsstedet ligger i et flytende miljø12. Generelt bidrar disse prosessene til den tiltenkte effekten av presis vevsskjæring. Men, de kan også være kilden til unødvendigsikkerhet skade begrense den lokale innesperring av laser kirurgi13.
Prediksjonen av resulterende mekaniske effekter har betydelig forbedret seg gjennom karakterisering av sjokkbølgeforplantningog kavitasjonskurs. Det er vårt mål å målrette CEC med så lite skade på omkringliggende vev som mulig for å gi en ikke-invasiv, laserassistert eksperimentell sykdomsmodell for de tidlige stadiene av CEC-tap. For dette formålet er det nødvendig å bestemme optimalpulsenergier og posisjoner av brennviddene på laseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer som involverer dyrevev følger retningslinjene til den lokale dyreomsorgs- og etikkkomiteen.
1. Tilberedning av organkultur og laserbehandling
- Få nyenucleated svineøyne fra den lokale slakterien. Hold dem kjølige (4 °C) i Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) med høyt glukose, supplert med L-glutamin, natriumpyruvat, penicillin/streptomycin (1%), og svineserum (10%), heretter referert til i denne artikkelen som fullt medium.
- Fjern ekstracellulære vev med saks og bløtlegg øynene i 5% povidon-jod oftalmisk oppløsning i 5 min før du plasserer dem i sterilisert fosfatbufret saltvann (PBS) til bruk.
- Skjermbildeøyne for store fremre segmentpatologier, som hornhinnearrdannelse, ødem og andre opacities med en spektral-domene optisk sammenheng tomografi enhet (Table of Materials).
- Plasser øynene foran en slitlampeenhet utstyrt med en Nd:YAG laser (Table of Materials), som har en bølgelengde på 1064 nm og en brennvidde diameter på 10 μm i luft.
MERK: For optimal posisjonering brukes et 3D-trykt holdingapparat, som ble designet for å holde øyet fast, uten å legge for mye press på det (Figur 1). - Bruk en forstørrelse på 12x og avlede belysningen for å visualisere de enkelte hornhinnene.
- Still inn pulsenergien (f.eks. 1,6 mJ) og fokuspunkt (f.eks. 0,16 mm) for selektiv ablasjon av endotelceller.
- Plasser en klar hornhinneparacenteis nær limbus og injiser viscoelastic (Table of Materials) for å stabilisere fremre kammer.
- Avgift ser den laserbehandlede sentrale hornhinnen med en 8 mm enphine.
- Plasser den utskårne hornhinnen i en brønn på en 12-brønnplate med endotelstedet vendt oppover og inkuber prøven i 3 ml fullt medium ved 37 °C i opptil 3 dager.
MERK: Potensielle cytobeskyttende midler kan legges til mediet i løpet av dette trinnet.
2. Forberedelse til histologi
- Forbered Sorensens buffer med en pH på 7,4 som inneholder 19,6 ml 133 mM KH2PO4 og 80,4 ml 133 mM Na2HPO4.
- Fjern mediet fra hornhinnen som inneholder brønnen og fikser vevet i 20 minutter ved romtemperatur (RT) ved hjelp av metanolfri paraformaldehyd (4%) i Sorensens buffer.
- Plasser vev i 20% sukrose i PBS til vevet synker (1 h) og deretter i 30% sukrose i PBS over natten på RT. Pass på at du unngår kontakt med bobler og luftoverflategrensesnittet. Bygg inn vev i optimal skjæretemperatur (OCT) sammensatte og lagre på -80 °C.
- Klipp pkt. 10 μm tykke med kryostat ved -27 °C.
MERK: En kamelhårbørste er nyttig for å hjelpe til med å lede den nye delen over knivbladet. - Overfør delen til et mikroskoplysbilde ved å berøre lysbildet til vevet innen 1 min etter å ha kuttet den for å unngå frysetørking av vevet. Oppbevar lysbildene ved -80 °C.
3. Hematoksylin og eosin (H&E) farging
- Lufttørre seksjoner i flere minutter for å fjerne fuktighet.
- Flekk med filtrert 0,1% Mayers hematoksyslin i 10 min i et 50 ml rør.
- I en Coplin krukke, skyll i kjølig kjører ddH2O for 5 min og dypp i 0,5% eosin 10x.
- Dypp i ddH2O til eosin slutter å streke og deretter dyppe i 50% (10x) samt 70% (10x) EtOH.
- Likevekt i 95 % EtOH (30 s) og 100 % EtOH (60 s) før du dypper i xylen flere ganger.
- Monter og dekkslip prøven før du tar bilder med et lett mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av prosedyren som presenteres her, behandlet vi øynene med en Nd:YAG laser, evaluere ulike pulsenergier (1,0-4,6 mJ) og posisjoner av kontaktpunkter (avstand fra den bakre overflaten av hornhinnen: 0,0-0,2 mm) for å finne de optimale parametrene. Flere replikater (n = 3) ble evaluert for hver konstellasjon av laserparametrene (12 x 21).
I tillegg til den ovennevnte protokollen ble prøven analysert med et tofotnmikroskop før fiksering og H&E-farging. Tofotonmikroskopet brukte en ssssst, moduslåst 80 MHz Ti:sapphire laser med en tuning rekkevidde på 690-1b040 nm og en gjennomsnittlig laserutgang på > 900 mW på 800 nm som lyskilde. Den leverte pulser med en bredde på ca. 150 fs til prøven. Bilder ble tatt med et mikroskop mål (20x/0.95) med en bølgelengde på 730 nm og 30 mW laserkraft.
Tofoton samt lette mikroskopibilder ble uavhengig gjennomgått av 3 anmeldere, som ble blindet til eksperimentelle innstillinger og måtte tildele bildene til tre kategorier: (1) ingen skade, (2) for mye skade, eller (3) riktig mengde skade (Figur 2 og figur 3). Basert på evalueringen ble det beregnet et varmekart (figur 4). Ved hjelp av dette varmekartet er det mulig å velge riktig konstellasjon av laserparametere for å selektivt ablate CEC med minimal skade på omkringliggende vev (grønn). Resultatene viser at laserens fokuspunkt må være minst 0,15 mm bak hornhinnens endotel for den laveste pulsenergien (1,0 mJ) som testes. For pulsenergier høyere enn 2,9 mJ er den lengste brennvidden som er testet (0,2 mm) fortsatt for nær endotelet.
Figur 1: Eksperimentelt oppsett. (A) Øynene ble festet i et delvis 3D-trykt holdingapparat, noe som tillot presis justering med hensyn til laserstrålen. (B) Før laserbehandling ble vevet evaluert med en fremre segment optisk sammenheng tomografi enhet for å se etter store fremre segment patologier. Posisjoner av brennlaserpunkter er indikert med eksemplarisk for 0,0 mm (svart stjerne), 0,1 mm (rød stjerne) og 0,2 mm (blå stjerne). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Tofotonmikroskopi. Resultatene varierte fra ingen skade i det hele tatt (A), omfattende sikkerhetsskader (B) til selektiv ablasjon av endotelceller (C). Det røde pilhodet viser en sprukket Descemets membran, og grønne pilspisser indikerer selektiv ablasjon av CEC-klynger. Skala bar = 100 μm. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Histologi. Hematoksylin og eosinfarging bekreftet skadeområdet fra ingen skade i det hele tatt (A), omfattende sikkerhetsskade (B) til selektiv ablasjon av endotelceller (C). Det røde pilhodet viser en sprukket Descemets membran, og grønne pilspisser indikerer selektiv ablasjon av CEC-klynger. Skala bar = 100 μm. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Et varmekart som viser sannsynligheten for selektiv CEC-skade. I denne forbindelse må pulsenergien samt posisjonen til Nd:YAG laserfokuspunkt tas i betraktning. Overdreven skade er vist i rødt, og ønsket del av skaden er vist i grønt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Resultatene av denne pilotstudien indikerer at en Nd:YAG laser kan brukes til å selektivt ablate hornhinne endotelceller når passende parametere for energidose og fokuspunktposisjon velges.
Siden endotelfunksjonen er viktig for hornhinnens gjennomsiktighet og sikring av hornhinnen mot stromal ødem, spiller modeller av endoteldysfunksjon en viktig rolle i utviklingen av anti-edematøse legemidler eller kirurgiske prosedyrer. Det er flere etablerte in vitro modeller for å etterligne in vivo situasjon10,14,15, men som generelt kjent, in vitro modeller kan ikke helt etterligne påvirkninger av enzymer og cytokiner eller effekten av celle-celle-interaksjon. I motsetning gir denne nyutviklede ex vivo-modellen av endotelcelletap muligheten til å overvåke ulike tilstander av sykdommen og hornhinnendekompensasjon i det naturlige miljøet.
Som hornhinnen i vår modell er skåret ut med en enfinetter laserprosedyren, endres hornhinnens fysiologi og ligner in vitro-situasjonen, er regionale interaksjoner betydelig hemmet. Imidlertid forblir det lokale grensesnittet intakt og spesielt mobilkommunikasjonen til andre celler i hornhinnen vedvarer. Vår studie viste at under disse omstendighetene opprettholder hornhinnen sin funksjon i tre dager i kultur, noe som gir tilstrekkelig tid til å observere og evaluere potensielle terapeutiske midler. På den annen side kan langvarige helbredende prosesser ikke undersøkes.
I vår modell brukte vi svineøyne som større mengder av disse lett kan oppnås. Videre svine øyne etterligne menneskelige øyne veldig bra. I motsetning til kaniner som regelmessig brukes til eksperiment, har svineøyne en Bowmans membran. Likevel er hornhinnens tykkelse av svineøyet betydelig forskjellig fra det menneskelige øye. Spesielt er svinestroma mye tykkere, og det er ingen forskjell mellom sentral og perifer tykkelse i svinehornhinnen16. Det må også vurderes at menneskelig CEC ikke har noen helbredende evne mens denne regenerative funksjonen er rapportert hos noen dyr, for eksempel griser og kaniner17,18. Vår studie fokuserte ikke på sårhelingsprosesser, men denne forskjellen bør holdes i bakhodet når vi oversetter resultater. Siden sårtilhelingen av dyr CEC ikke overstiger fire dager, kan det fortsatt observeres i vårt kultiverte vev selv om de bare varer i tre dager.
Sammenlignet med vårt eksperimentelle oppsett med tidligere studier, var de anvendte energinivåene tilsvarende19. I stedet for å fokusere bare på endotelet, ble ulike steder av kontaktpunkter evaluert. Derfor er hovedforskjellen i vårt oppsett til tidligere studier dens potensial til å indusere spesifikk endotelskade uten å skade verken DM eller stromalvev. Nøyaktig overvåking av energidose og fokusposisjon muliggjør selektiv CEC-ablasjon uten å forårsake støtbølgeskade på andre deler av hornhinnen. Vi har heller ikke lagt merke til stromal eller subepithelial ødem rett etter laserbehandling20.
En tidligere studie viste at temperaturer på ~ 40 °C kan føre til CEC skade21. Vi målte ikke den induserte temperaturen, men det kan være av interesse for videre studier. Videre bør effekten av ulike typer lasersystemer evalueres. Tidligere studier viste en forskjell mellom laserindusert omskrevet CEC skade og andre CEC skader19,22. Dette kan også begrense sammenlignbarheten med menneskelig vev og sykdommer fordi laserindusert skade synes å bli etterfulgt av ulike sykdomsutviklingsprosesser. Interessant, sårheling etter laser søknad stoppet på brent DM i tidligere studier19. Skadekilden kan være mindre viktig hvis DM forblir intakt.
Høyere energinivå kan utgjøre en høyere risiko for forlenget skade22. Resultatene våre viser at bruk av høyere energinivå (<2,9 mJ) for selektiv CEC-skade krever et strammere fokusområde. Mens skaden på CEC ble mekanisk brukt i tidligere studier17, laser-indusert skade som brukes her har en mer presis dosering av lesjonen og kan lett brukes i in vivo studier.
Det bør bemerkes at bare et lite antall øyne har blitt behandlet og undersøkt i henhold til denne protokollen. Som nevnt ovenfor kan det være interindividuelle forskjeller i responsen på laserbehandlingen, samt forskjeller mellom hornhinnene til forskjellige dyrearter. Siden CEC-skader kan produseres i forskjellige brennvidder, bør visse terskler ikke overskrides for å unngå langvarig skade.
Til slutt ble lesjonene som ble generert i denne studien plassert i den sentrale delen. En tidligere studie av svineøyne viste akselerert sårheling i hornhinnen periferien, som kan skyldes sin nærhet til limbal stamceller17 som hornhinnen tykkelse i svineøyne ikke varierer mellom regioner. Det bør vurderes i fremtidige studier om laserparametere bør justeres når du bytter fra midten av hornhinnen til periferien.
Til slutt introduserer vår studie en ikke-invasiv modell for videre undersøkelser på CEC dysfunksjon. Begrensninger av ex vivo eller in vivo studier i form av bruk av dyr i stedet for menneskelig vev forblir og må vurderes når du tolker resultatene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Christine Örün og Jan A. M. Sochurek for deres hjelp med eksperimentelle metoder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BARRON VACUUM TREPHINE | Katena | K20-2058 | |
| Cryostat | Leica | CM 3050S | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose | PAA | E-15009 | |
| Eye holder | Self | N/A | |
| Inverted Microscope | Leica | DMI 6000 B | |
| KH2PO4 | Merck | 529568 | |
| Na2HPO4 | Merck | 1065860500 | |
| Nd:YAG laser | Zeiss Meditec | visuLAS YAG II plus | |
| OCT Tissue Tek | Sakura Finetechnical | 4583 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010056 | |
| Porcine serum | Sigma-Aldrich | 12736C | |
| Spectral-domain optical coherence tomograph | Heidelberg Engineering | Spectralis | |
| Tissue culture plate 12-well | Sarstedt | 833921 | |
| Two-Photon Microscope | JenLab | DermaInspect | |
| Viscoelastic | OmniVision | Methocel |
References
- DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract and Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
- Edelhauser, H. F. The balance between corneal transparency and edema: the Proctor Lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (5), 1754-1767 (2006).
- Tuft, S. J., Coster, D. J. The corneal endothelium. Eye. 4, London, England. Pt 3 389-424 (1990).
- Bourne, W. M. Biology of the corneal endothelium in health and disease. Eye. 17, 912-918 (2003).
- He, Z., et al. 3D map of the human corneal endothelial cell. Scientific Reports. 6, 29047 (2016).
- Gain, P., et al. Global Survey of Corneal Transplantation and Eye Banking. JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).
- Schwartzkopff, J., Bredow, L., Mahlenbrey, S., Boehringer, D., Reinhard, T. Regeneration of corneal endothelium following complete endothelial cell loss in rat keratoplasty. Molecular Vision. 16, 2368-2375 (2010).
- Bredow, L., Schwartzkopff, J., Reinhard, T. Regeneration of corneal endothelial cells following keratoplasty in rats with bullous keratopathy. Molecular Vision. 20, 683-690 (2014).
- Bartakova, A., Kunzevitzky, N. J., Goldberg, J. L. Regenerative Cell Therapy for Corneal Endothelium. Current Ophthalmology Reports. 2 (3), 81-90 (2014).
- Zhao, B., et al. Development of a three-dimensional organ culture model for corneal wound healing and corneal transplantation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (7), 2840-2846 (2006).
- Aron-Rosa, D., Aron, J. J., Griesemann, M., Thyzel, R. Use of the neodymium-YAG laser to open the posterior capsule after lens implant surgery: a preliminary report. Journal - American Intra-Ocular Implant Society. 6 (4), 352-354 (1980).
- Vogel, A., Hentschel, W., Holzfuss, J., Lauterborn, W. Cavitation bubble dynamics and acoustic transient generation in ocular surgery with pulsed neodymium: YAG lasers. Ophthalmology. 93 (10), 1259-1269 (1986).
- Vogel, A., Schweiger, P., Frieser, A., Asiyo, M. N., Birngruber, R. Intraocular Nd:YAG laser surgery: laser-tissue interaction, damage range, and reduction of collateral effects. IEEE Journal of Quantum Electronics. 26 (12), 2240-2260 (1990).
- Zhu, Q., Zhu, Y., Tighe, S., Liu, Y., Hu, M. Engineering of Human Corneal Endothelial Cells In Vitro. International Journal of Medical Sciences. 16 (4), 507-512 (2019).
- Li, Z., et al. Nicotinamide inhibits corneal endothelial mesenchymal transition and accelerates wound healing. Experimental Eye Research. 184, 227-233 (2019).
- Pescina, S., et al. Development of a convenient ex vivo model for the study of the transcorneal permeation of drugs: histological and permeability evaluation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (1), 63-71 (2015).
- Smeringaiova, I., et al. Endothelial Wound Repair of the Organ-Cultured Porcine Corneas. Current Eye Research. 43 (7), 856-865 (2018).
- Yamashita, K., et al. A Rabbit Corneal Endothelial Dysfunction Model Using Endothelial-Mesenchymal Transformed Cells. Scientific Reports. 8 (1), 16868 (2018).
- Schubert, H. D., Trokel, S. Endothelial repair following Nd:YAG laser injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (8), 971-976 (1984).
- Zhang, W., et al. Rabbit Model of Corneal Endothelial Injury Established Using the Nd: YAG Laser. Cornea. 36 (10), 1274-1281 (2017).
- McCally, R. L., Bonney-Ray, J., de la Cruz, Z., Green, W. R. Corneal endothelial injury thresholds for exposures to 1.54 micro m radiation. Health Physics. 92 (3), 205-211 (2007).
- Nash, J. P., Wickham, M. G., Binder, P. S. Corneal damage following focal laser intervention. Experimental Eye Research. 26 (6), 641-650 (1978).
