Summary
在这里，我们提出了一个协议，从Descemet的膜（DM）分离角膜内皮细胞（CEC），使用一个镉：YAG（Nd：YAG）激光作为牛角病（BK）的外活体疾病模型。
Abstract
Nd：YAG激光器已经用于进行非侵入性的眼内手术，如眼内切除术几十年了。精辟效果依赖于激光对焦处的光学故障。产生声冲击波和气穴气泡，导致组织破裂。气泡尺寸和压力振幅随脉冲能量和焦点位置而变化。在这项研究中，被包裹的猪眼被放置在商业上可用的Nd：YAG激光器前。测试了角膜后焦点的不同位置的可变脉冲能量以及不同位置。由此产生的病变通过双光子显微镜和组织学进行评估，以确定角膜内皮细胞（CEC）唯一分离的最佳参数，并尽量减少附带损害。该方法的优点是CEC的精确消融，减少附带损害，最重要的是非接触式处理。
Introduction
角膜的透明度对于将光传输到视网膜及其光感受器1至关重要。在这方面，相对脱水状态对于保持角膜基质内的胶原纤维正确对齐至关重要。这种平衡由位于Descemet膜（DM）2上的角膜内皮细胞（CEC）维持。内皮是最内层角膜层。它有一个重要的屏障和泵功能，这是角膜透明度3的关键。与上皮相比，内皮不能自我更新4。因此，疾病或创伤造成的任何细胞损伤刺激剩余的内皮细胞扩大和迁移，覆盖由此产生的缺陷，并保持角膜功能5。然而，如果CEC密度低于临界阈值，内皮的解值会导致水肿，导致视力模糊和不适，甚至剧烈疼痛4。尽管有缓解症状的药物，目前这些病例中唯一的明确治疗方法是角膜移植，这种移植可以以全厚移植或角膜内皮移植的形式进行。后一个程序是作为Descemet的膜内皮角膜（DMEK）以及Descemet的剥离自动内皮角膜（DSAEK）6。6然而，保护剩余的CEC并增强其生存能力可能是一个替代目标，这需要一个适当的疾病模型来测试潜在的治疗药物。
目前的CEC损失病模型侧重于通过注射有毒物质（如氯化苯甲酸酯）或使用侵入性脱氨血症技术77、88的细胞机械磨损来破坏内皮。虽然这些模型已经确立，但存在一般炎症反应和不精确的附带损害等缺点。因此，这些模型更有可能代表疾病的最后阶段，当上述手术选择是不可避免的。
随着干细胞和基因治疗等细胞治疗策略的进步，这些细胞疗法的应用在CEC损失9的早期阶段可能很有用。随后，我们需要一个模型，更充分地代表疾病的这些早期阶段。在这方面，细胞培养模型在过去十年中有所改善，但其有效性仍然有限，因为体外细胞无法接近于复制角膜10内不同细胞类型之间发生的复杂相互作用。因此，活体和体内疾病模型仍然需求量大，改进现有的模式是十分感兴趣的。
非侵入性，眼内手术通过光干扰使用镉：YAG （Nd：YAG） 激光已成为世界各地的眼科医生的例行程序，因为它在20世纪70年代末推出11.光中断依赖于非线性光吸收，导致等离子体的形成，产生声冲击波，并产生气穴气泡，每当应用地点位于液体环境中12。一般来说，这些过程有助于精确组织切割的预期效果。然而，它们也可能成为不必要的附带损害的来源，限制了当地对激光手术的监禁。
通过对冲击波传播和气穴过程的表征，对由此产生的机械效应的预测有了显著改善。我们的目标是以尽可能少地破坏周围组织而达到CEC为目标，为CEC损失的早期阶段提供非侵入性激光辅助实验疾病模型。为此，有必要确定激光焦点的最佳脉冲能量和位置。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
所有涉及动物组织的程序都遵循当地动物护理和道德委员会的准则。
1. 器官培养和激光治疗的准备
- 从当地的屠宰场获得新鲜镶有的猪眼。在Dulbecco的改良鹰中（DMEM）中保持凉爽（4°C），高葡萄糖，辅以L-谷氨酰胺、丙酮钠、青霉素/链霉素（1%）和猪血清（10%），本文今后称为全中量。
- 用剪刀去除细胞外组织，将眼睛浸泡在5%povidone-碘眼科溶液中5分钟，然后放入消毒的磷酸缓冲盐水（PBS）中，直到使用为止。
- 屏幕眼睛的主要前段病理，如角膜疤痕，水肿，和其他不透明与光谱域光学相干断层扫描设备（材料表）。
- 将眼睛放在装有Nd：YAG激光（材料表）的狭缝灯单元前面，该激光表的波长为1，064nm，在空气中的焦点直径为10μm。
注：为了优化定位，使用了 3D 打印的保持装置，该装置旨在保持眼睛牢固，而不会给眼睛施加太大的压力（图1）。 - 使用 12 倍的放大倍数并偏转照明以可视化各个角膜图层。
- 设置脉冲能量（例如，1.6 mJ）和焦点（例如0.16毫米），以选择性消融内皮细胞。
- 在边缘附近放置一个清晰的角膜对羟基体，并注射粘弹性（材料表），以稳定前室。
- 使用 8 mm 的角膜去除激光处理的中央角膜。
- 将切除的角膜放在12孔板的孔中，内皮部位朝上，在37°C下以3 mL全介质孵育标本长达3天。
注：在此步骤中，可以将潜在的细胞保护剂添加到介质中。
2. 准备进行本体学
- 准备索伦森的缓冲器，pH为7.4，含有19.6 mL的133 mM KH2PO4和80.4 mL的133 mM Na2HPO4。
- 从含角膜的溶液中取出介质，在室温（RT）下用不含甲醇的甲醛（4%）固定组织20分钟在索伦森的缓冲区。
- 将组织在PBS中20%蔗糖中放入，直到组织下沉（1小时），然后在RT的PBS中过夜30%蔗糖。注意避免与气泡和气表面界面接触。将组织嵌入最佳切割温度 （OCT） 化合物中，并储存在 -80°C。
- 在 -27 °C 下使用低温器切割 10 μm 厚的部分。
注：骆驼毛刷有助于在刀刃上引导新兴部分。 - 通过在切割时1分钟内将切片接触到组织，以避免组织冻干，将部分转移到显微镜幻灯片上。将幻灯片存放在 -80°C。
3. 赫马托西林和欧辛（H&E）染色
- 空气干燥部分几分钟，以去除水分。
- 在50 mL管中用过滤0.1%的梅耶斯血氧林染色10分钟。
- 在 Coplin 罐子中，在运行的 ddH2O 中冲洗 5 分钟，浸入 0.5% eosin 10x。
- 浸入 ddH2O，直到 eosin 停止条纹，然后以 50% （10x） 和 70% （10x） EtOH 下降。
- 在 95% EtOH （30 s） 和 100% EtOH （60 s） 中进行平衡，然后多次浸入二甲苯中。
- 最后，在使用光学显微镜拍摄图像之前，先安装并盖上样品。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
使用此处介绍的程序，我们使用 Nd：YAG 激光治疗眼睛，评估不同的脉冲能量 （1.0±4.6 mJ） 和焦点的位置（与角膜后表面的距离：0.0±0.2 mm），以找到最佳参数。对激光参数的每个星座（12 x 21）计算了多个复制 （n = 3）。
除上述协议外，在固定和H&E染色之前，还使用双光子显微镜对试样进行了分析。双光子显微镜采用固态模式锁定的 80 MHz Ti：蓝宝石激光器，调谐范围为 690×1b040 nm，平均激光输出为 800 nm 时为 >900 mW。它将宽度约为 150 fs 的脉冲传送给样品。图像采用显微镜目标（20x/0.95），波长为730nm，激光功率为30mW。
两光子和光显微镜图像由3名审查员独立审查，他们对实验设置视而不见，不得不将图像分为三类：（1）无损伤，（2）损坏过多，或（3）损坏量适当（图2和图3）。根据他们的评估计算了热图（图4）。使用此热图，可以选择正确的激光参数星座，选择性地退去 CEC，同时对周围组织（绿色）的损害最小。结果表明，在测试的最低脉冲能量（1.0 mJ）时，激光的焦焦点必须至少比角膜内皮晚0.15毫米。对于高于 2.9 mJ 的脉冲能量，测试的最长焦距（0.2 mm）仍然过于接近内皮。
图 1：实验设置。（A） 眼睛固定在部分 3D 打印的保持装置中，从而能够精确对准激光束。（B） 激光治疗前，使用前段光学相干断层扫描装置对组织进行评估，以检查主要前段病理。焦激光点的位置标明为 0.0 mm（黑色星号）、0.1 毫米（红色星号）和 0.2 毫米（蓝色星号）。请点击此处查看此图形的较大版本。
图2：双光子显微镜。结果从无损伤（A）、广泛的附带损害（B）到内皮细胞选择性消融（C）不等。红色箭头显示 Descemet 膜破裂，绿色箭头表示 CEC 簇的选择性消融。比例尺 = 100 μm。请点击这里查看此图形的较大版本。
图3：本体学。赫马托西林和奥辛染色证实了损害范围从无损伤 （A），广泛的附带损害 （B） 到选择性消融内皮细胞 （C）.红色箭头显示 Descemet 膜破裂，绿色箭头表示 CEC 簇的选择性消融。比例尺 = 100 μm。请点击这里查看此图形的较大版本。
图 4：显示选择性 CEC 损坏概率的热图。在这方面，必须考虑到脉冲能量以及Nd：YAG激光焦距的位置。过度损坏以红色显示，所需损坏部分以绿色显示。请点击此处查看此图形的较大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
试验研究结果表明，在选择能量剂量和焦点位置的适当参数时，Nd：YAG激光器可用于选择性地退位角膜内皮细胞。
由于内皮功能对角膜透明度和角膜免受基质水肿影响十分重要，内皮功能障碍模型在抗水肿药物或外科手术的发展中起着重要作用。有几个既定的体外模型来模拟体内情况10，14，15，但众所周知，体外模型不能完全模仿酶和细胞因子的影响或细胞-细胞相互作用的影响。10,14,15与此相反，这种新开发的内皮细胞损失前活体模型提供了监测不同疾病状态和自然环境中角膜脱补偿的可能性。
由于我们模型中的角膜在激光手术后被除去，角膜的生理变化与体外情况相似，区域相互作用受到明显阻碍。然而，局部接口保持不变，尤其是与角膜内其他细胞的细胞通信仍然存在。我们的研究表明，在这种情况下，角膜在培养中保持其功能三天，这为观察和评估潜在的治疗药物提供了足够的时间。另一方面，长期愈合过程无法调查。
在我们的模型中，我们使用猪眼，因为大量的猪眼可以很容易地获得。此外，猪的眼睛模仿人的眼睛很好。与经常用于实验的兔子相比，猪的眼睛有鲍曼的膜。然而，猪眼的角膜厚度与人眼有很大不同。特别是，猪角质的厚度要厚得多，猪角膜的中央厚度和外周厚度没有区别。还必须认为，人类CEC没有任何愈合能力，而这种再生功能报告在一些动物，如猪和兔子17，18。17,我们的研究没有侧重于伤口愈合过程，但在翻译结果时应牢记这种差异。由于动物CEC的伤口愈合不超过四天，它仍然可能在我们的培养组织中观察到，即使它们只持续三天。
将我们的实验设置与以前的研究进行比较，应用的能量水平与19.评价了协调中心的不同位置，而不是只关注内皮。因此，我们设置到早期研究的主要区别是它的潜力，诱导特定的内皮损伤，而不会损害DM或基质组织。准确监测能量剂量和焦点位置，使选择性CEC消融，而不会对角膜的其他部位造成冲击波损伤。此外，我们还没有注意到基质或下皮水肿直接激光治疗20后。
先前的研究表明，温度+40°C可导致CEC损伤21。我们没有测量感应温度，但可能有兴趣进一步研究。此外，应评估不同类型的激光系统的效果。先前的研究表明，激光诱导限制CEC损伤与其他CEC损伤19、22,22不同。这也可能限制人体组织和疾病的可比性，因为激光引起的损伤似乎伴随着不同的疾病发展过程。有趣的是，激光应用后伤口愈合停止在烧伤DM在早期的研究19。如果 DM 保持不变，伤害源可能就不那么重要了。
更高的能量水平可以构成更高的长期伤害的风险22。我们的结果表明，使用更高的能量水平（<2.9 mJ）进行选择性CEC损伤需要更紧密的对焦范围。虽然对CEC的损害在以前的研究中被机械地应用17，但激光引起的损伤对病变有更精确的加量，并且可以很容易地在体内研究中使用。
应该指出，根据本议定书，只有少量的眼睛得到治疗和检查。如上所述，对激光治疗的反应可能存在个体间差异，不同动物物种的角膜差异。由于 CEC 损伤可以在不同的焦距位置产生，因此不应超过某些阈值以避免扩展损坏。
最后，本研究中产生的病变被放置在中心部分。早先对猪眼的研究表明，角膜边缘伤口愈合加速，这可能是因为它靠近边缘干细胞17，因为猪眼睛的角膜厚度在区域之间没有差异。在未来的研究中，在从角膜中心切换到外围时，是否应调整激光参数。
最后，我们的研究引入了一种非侵入性模型，用于进一步研究CEC功能障碍。在动物而不是人体组织的使用方面，活体或体内研究的限制仍然存在，在解释结果时必须考虑。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢克里斯蒂娜·奥伦和扬·阿·苏楚雷克在实验方法方面的帮助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BARRON VACUUM TREPHINE | Katena | K20-2058 | |
| Cryostat | Leica | CM 3050S | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose | PAA | E-15009 | |
| Eye holder | Self | N/A | |
| Inverted Microscope | Leica | DMI 6000 B | |
| KH2PO4 | Merck | 529568 | |
| Na2HPO4 | Merck | 1065860500 | |
| Nd:YAG laser | Zeiss Meditec | visuLAS YAG II plus | |
| OCT Tissue Tek | Sakura Finetechnical | 4583 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010056 | |
| Porcine serum | Sigma-Aldrich | 12736C | |
| Spectral-domain optical coherence tomograph | Heidelberg Engineering | Spectralis | |
| Tissue culture plate 12-well | Sarstedt | 833921 | |
| Two-Photon Microscope | JenLab | DermaInspect | |
| Viscoelastic | OmniVision | Methocel |
References
- DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract and Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
- Edelhauser, H. F. The balance between corneal transparency and edema: the Proctor Lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (5), 1754-1767 (2006).
- Tuft, S. J., Coster, D. J. The corneal endothelium. Eye. 4, London, England. Pt 3 389-424 (1990).
- Bourne, W. M. Biology of the corneal endothelium in health and disease. Eye. 17, 912-918 (2003).
- He, Z., et al. 3D map of the human corneal endothelial cell. Scientific Reports. 6, 29047 (2016).
- Gain, P., et al. Global Survey of Corneal Transplantation and Eye Banking. JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).
- Schwartzkopff, J., Bredow, L., Mahlenbrey, S., Boehringer, D., Reinhard, T. Regeneration of corneal endothelium following complete endothelial cell loss in rat keratoplasty. Molecular Vision. 16, 2368-2375 (2010).
- Bredow, L., Schwartzkopff, J., Reinhard, T. Regeneration of corneal endothelial cells following keratoplasty in rats with bullous keratopathy. Molecular Vision. 20, 683-690 (2014).
- Bartakova, A., Kunzevitzky, N. J., Goldberg, J. L. Regenerative Cell Therapy for Corneal Endothelium. Current Ophthalmology Reports. 2 (3), 81-90 (2014).
- Zhao, B., et al. Development of a three-dimensional organ culture model for corneal wound healing and corneal transplantation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (7), 2840-2846 (2006).
- Aron-Rosa, D., Aron, J. J., Griesemann, M., Thyzel, R. Use of the neodymium-YAG laser to open the posterior capsule after lens implant surgery: a preliminary report. Journal - American Intra-Ocular Implant Society. 6 (4), 352-354 (1980).
- Vogel, A., Hentschel, W., Holzfuss, J., Lauterborn, W. Cavitation bubble dynamics and acoustic transient generation in ocular surgery with pulsed neodymium: YAG lasers. Ophthalmology. 93 (10), 1259-1269 (1986).
- Vogel, A., Schweiger, P., Frieser, A., Asiyo, M. N., Birngruber, R. Intraocular Nd:YAG laser surgery: laser-tissue interaction, damage range, and reduction of collateral effects. IEEE Journal of Quantum Electronics. 26 (12), 2240-2260 (1990).
- Zhu, Q., Zhu, Y., Tighe, S., Liu, Y., Hu, M. Engineering of Human Corneal Endothelial Cells In Vitro. International Journal of Medical Sciences. 16 (4), 507-512 (2019).
- Li, Z., et al. Nicotinamide inhibits corneal endothelial mesenchymal transition and accelerates wound healing. Experimental Eye Research. 184, 227-233 (2019).
- Pescina, S., et al. Development of a convenient ex vivo model for the study of the transcorneal permeation of drugs: histological and permeability evaluation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (1), 63-71 (2015).
- Smeringaiova, I., et al. Endothelial Wound Repair of the Organ-Cultured Porcine Corneas. Current Eye Research. 43 (7), 856-865 (2018).
- Yamashita, K., et al. A Rabbit Corneal Endothelial Dysfunction Model Using Endothelial-Mesenchymal Transformed Cells. Scientific Reports. 8 (1), 16868 (2018).
- Schubert, H. D., Trokel, S. Endothelial repair following Nd:YAG laser injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (8), 971-976 (1984).
- Zhang, W., et al. Rabbit Model of Corneal Endothelial Injury Established Using the Nd: YAG Laser. Cornea. 36 (10), 1274-1281 (2017).
- McCally, R. L., Bonney-Ray, J., de la Cruz, Z., Green, W. R. Corneal endothelial injury thresholds for exposures to 1.54 micro m radiation. Health Physics. 92 (3), 205-211 (2007).
- Nash, J. P., Wickham, M. G., Binder, P. S. Corneal damage following focal laser intervention. Experimental Eye Research. 26 (6), 641-650 (1978).
