Summary
Здесь мы представляем протокол для отстыковки пенотелировых клеток (CEC) от мембраны Десцемета (DM) с помощью неодимия:YAG (Nd:YAG) лазер в качестве модели ex vivo болезни для булловой кератопатии (BK).
Abstract
Nd: YAG лазеры были использованы для выполнения неинвазивных внутриглазной хирургии, такие как капсулотомия в течение нескольких десятилетий. Резкий эффект зависит от оптической поломки при лазерном фокусе. Создаются акустические ударные волны и кавитационные пузыри, что приводит к разрыву тканей. Размеры пузырьков и амплитуды давления варьируются в зависимости от импульсной энергии и положения координационного центра. В этом исследовании, энуклеированные свиные глаза были расположены перед коммерчески доступным nd:YAG лазера. Были протестированы переменные импульсные энергии, а также различные положения очаговых пятен, задних к роговице. Полученные поражения оценивались двухфотонической микроскопией и гистологией для определения наилучших параметров для эксклюзивного отделения эндотелиальных клеток роговицы (CEC) с минимальным сопутствующим ущербом. Преимуществами этого метода являются точная абляция ЦИК, снижение сопутствующего ущерба и, прежде всего, бесконтактное лечение.
Introduction
Прозрачность роговицы необходима для передачи света на сетчатку и ее фоторецепторов1. В связи с этим, относительное состояние обезвоживания имеет решающее значение для поддержания коллагеновых волокон в роговицы стромы правильно выровнены. Этот гомеостаз поддерживается эндотелиальных клеток роговицы (CEC), расположенных на мембране Descemet (DM)2. Эндотелий является самым внутренним слоем роговицы. Он имеет важный барьер и насос функции, которая имеет решающее значение для прозрачности роговицы3. В отличие от эпителия, эндотелий не способен самостоятельно обновить4. Таким образом, любое повреждение клеток, вызванных болезнью или травмой стимулирует оставшиеся эндотелиальные клетки, чтобы увеличить и мигрировать, для покрытия результирующих дефектов и для поддержания функциональности роговицы5. Однако, если плотность ЦИК падает ниже критического порога, декомпенсация эндотелия приводит к отеку, что приводит к затуманенное зрение и дискомфорт или даже сильная боль4. Несмотря на наличие препаратов для облегчения симптомов, в настоящее время единственным окончательным лечением в этих случаях является трансплантация роговицы, которая может быть выполнена в виде полной толщины трансплантата или ламеллярной эндотелиальной трансплантации. Последняя процедура доступна как мембранная эндотелиальная кератопластика Десцемета (DMEK), а также зачистка Десемета автоматизированной эндотелиальной кератопластики (DSAEK)6. Однако защита оставшихся ЦИК и повышение их выживания могут быть альтернативной мишенью, которая нуждается в адекватной модели заболевания для тестирования потенциальных терапевтических препаратов.
Текущие модели болезни потери ЦИК сосредоточиться на разрушении эндотелия путем инъекции токсичных агентов (например, хлорид бензалкония) в переднюю камеру или механической ссадении клеток с использованием инвазивной техники descemetorhexis7,8. Хотя эти модели хорошо зарекомендовали себя, существуют такие недостатки, как общая воспалительная реакция и неточный сопутствующий ущерб. Таким образом, эти модели, скорее всего, представляют собой заключительные стадии заболевания, когда вышеупомянутые хирургические варианты неизбежны.
С достижениями в клеточных стратегий лечения, таких как стволовые клетки и генной терапии, применение этих клеточных методов лечения может быть полезным на ранних стадиях потери ЦИК9. Впоследствии нам нужна модель, которая представляет эти ранние стадии заболевания более адекватно. В этой связи, модели клеточной культуры улучшились за последнее десятилетие, но все еще ограничены в своей действительности, так как клетки in vitro не могут приблизиться к репликации сложных взаимодействий, которые происходят между различными типами клеток в роговице10. Таким образом, модели ex vivo и in vivo по-прежнему пользуется большим спросом, и улучшение существующих представляет наибольший интерес.
Неинвазивная, внутриглазная хирургия с помощью лазера neodymium:YAG (Nd:YAG) стала обычной процедурой для офтальмологов во всем мире с момента его введения в конце1970-х годов 11. Фотонарушение зависит от нелинейного поглощения света, что приводит к образованию плазмы, генерации акустических ударных волн и созданию кавитационных пузырей, всякий раз, когда сайт приложения находится в жидкой среде12. В целом, эти процессы способствуют предполагаемому эффекту точной резки тканей. Тем не менее, они также могут быть источником ненужного сопутствующего ущерба, ограничивающего местное заключение лазерной хирургии13.
Прогнозирование полученных механических эффектов значительно улучшилось за счет характеристики курса распространения ударной волны и кавитации. Наша цель – нацелиться на ТО, чтобы ЦИК нацелился на как можно меньше ею, чтобы обеспечить неинвазивную модель экспериментального заболевания с лазерной помощью на ранних стадиях потери ЦИК. Для этого необходимо определить оптимальные импульсные энергии и положение фокусных пятен лазера.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры, связанные с тканью животных, следуют рекомендациям местного комитета по уходу за животными и этике.
1. Подготовка культуры органов и лазерное лечение
- Получить свежеэнкулеционированные свиные глаза из местной скотобойни. Держите их в прохладном (4 кС) в модифицированной среде Орел Dulbecco (DMEM) с высоким содержанием глюкозы, дополненный L-глютамина, пируват натрия, пенициллин / стрептомицин (1%), и свиная сыворотка (10%), отныне упоминается в этой статье в качестве полной среде.
- Удалить внеклеточные ткани с ножницами и замочить глаза в 5% повид-йод офтальмологический раствор в течение 5 минут, прежде чем поместить их в стерилизованных фосфат-буферных солей (PBS) до использования.
- Экран ные глаза для основных патологий переднего сегмента, таких как рубцы роговицы, отеки и другие непрозрачности с спектральной домен оптической компиральной томографии устройства (Таблица материалов).
- Расположите глаза перед разрезом лампы, оснащенной лазером Nd:YAG(Таблица материалов),который имеет длину волны 1064 нм и диаметр фокусного пятна 10 мкм в воздухе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для оптимального позиционирования используется 3D-печатный холдинговой аппарат, который был разработан, чтобы держать глаз фирмы, не оказывая слишком много давления на него (Рисунок 1). - Используйте увеличение 12x и отвлечь освещение, чтобы визуализировать отдельные слои роговицы.
- Установите импульсную энергию (например, 1,6 мДж) и точку фокусировки (например, 0,16 мм) для селективной абляции эндотелиальных клеток.
- Поместите четкий парасентез роговицы близко к лимбу и вводить вязкоупругий (Таблица материалов) для стабилизации передней камеры.
- Акциз лазерной обработки центральной роговицы с помощью 8 мм трефина.
- Поместите вырезанную роговицу в колодец из 12-колодца пластины с эндотелиальным участком, обращенным вверх, и инкубировать образец в 3 мл полной среды при 37 градусах Цельсия в течение 3 дней.
ПРИМЕЧАНИЕ: Потенциальные цитопротекторные агенты могут быть добавлены к среде во время этого шага.
2. Подготовка к гистологии
- Подготовьте буфер Соренсена с рН 7,4, содержащий 19,6 мл 133 мМ KH2PO4 и 80,4 мл 133 мМ Na2HPO4.
- Удалить среду из роговицы, содержащей хорошо и зафиксировать ткани в течение 20 минут при комнатной температуре (RT) с помощью метанола без параформальдегида (4%) в буфере Соренсена.
- Поместите ткани в 20% сахарозы в PBS до погружения ткани (1 ч), а затем в 30% сахарозы в PBS ночь на RT. Позаботьтесь, чтобы избежать контакта с пузырьками и интерфейсом поверхности воздуха. Встраивай ткань в оптимальную температуру резки (OCT) и храните при температуре -80 градусов по Цельсию.
- Вырезать разделы 10 мкм толщиной с помощью криостата при -27 градусах Цельсия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Верблюжья расческа полезна, чтобы помочь возникающим раздел над лезвием ножа. - Перенесите секцию на слайд микроскопа, коснувшись слайда в ткани в течение 1 мин резки его, чтобы избежать замораживания сушки ткани. Храните слайды при -80 градусах По Цельсию.
3. Гематоксилин и эозин (Н И Э) окрашивание
- Воздух сухие разделы в течение нескольких минут, чтобы удалить влагу.
- Пятно с фильтрованным 0,1% Майерс гематоксилин в течение 10 мин в 50 мл трубки.
- В банку Коплин, промыть в прохладном работает ddH2O в течение 5 мин и окунуться в 0,5% эозин 10x.
- Dip в ddH2O до тех пор, пока эозин останавливается полос, а затем окунуться в 50% (10x), а также 70% (10x) EtOH.
- Равновесие в 95% EtOH (30 s) и 100% EtOH (60 s) перед погружением в ксилен несколько раз.
- Наконец смонтировать и coverslip образца, прежде чем принимать изображения с помощью светового микроскопа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Используя представленную здесь процедуру, мы обработали глаза лазером Nd:YAG, оценивая различные импульсные энергии (1,0–4,6 мДж) и положения фокусных точек (расстояние от задней поверхности роговицы: 0,0–0,2 мм), чтобы найти оптимальные параметры. Для каждого созвездия параметров лазера (12 x 21) было оценено несколько репликатов (n no 3).
В дополнение к вышеупомянутому протоколу, образец был проанализирован с помощью двухфотонного микроскопа перед фиксацией и окрашиванием Н И Е. Двухфотонный микроскоп использовал твердотельный, запертый в режиме 80 МГц Ti:sapphire с диапазоном тюнинга 690-1b040 нм и средним лазерным выходом в размере 900 МВт при 800 Нм в качестве источника света. Он доставил импульсы шириной около 150 fs к образцу. Снимки были сделаны с помощью микроскопа (20x/0.95) при длине волны 730 нм и 30 мВт лазерной мощности.
Двухфотонные, а также световые микроскопии изображения были независимо рассмотрены 3 рецензентов, которые были ослеплены экспериментальных параметров и должны были назначить изображения в трех категориях: (1) без ущерба, (2) слишком большой ущерб, или (3) правое количество ущерба (Рисунок 2 и Рисунок 3). На основе их оценки была рассчитана тепловая карта(рисунок 4). С помощью этой тепловой карты можно выбрать правильное созвездие лазерных параметров, чтобы выборочно абляции ЦИК с минимальным повреждением окружающих тканей (зеленый). Результаты показывают, что координационный центр лазера должен быть не менее 0,15 мм позади эндотелия роговицы для тестирования наименьшей импульсной энергии (1,0 мЛ). Для импульсных энергий выше 2,9 мДж самое длинное очаговое расстояние (0,2 мм) все еще находится слишком близко к эндотелию.
Рисунок 1: Экспериментальная установка. (A) Глаза были зафиксированы в частично 3D-печатном удерживая аппарате, который позволил точное выравнивание по отношению к лазерного луча. (B) Перед лазерным лечением, ткань была оценена с передним сегментом оптического устройства компьеорной компиенции для проверки на основные патологии переднего сегмента. Позиции фокусальных лазерных точек обозначены образцовым для 0,0 мм (черная звездочка), 0,1 мм (красная звездочка) и 0,2 мм (синяя звездочка). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Двухфотоническая микроскопия. Результаты варьировались от отсутствия повреждений на всех (A), обширный сопутствующий ущерб (B) к селективной абляции эндотелиальных клеток (C). Красная наконечник стрелы показывает разорванную мембрану Десцемета, а зеленые наконечники стрел указывают на селективную абляцию кластеров ЦИК. Шкала бар 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Гистология. Гематоксилин и эозиновые окрашивания подтвердили ущерб диапазоне от отсутствия повреждений на всех (A), обширный сопутствующий ущерб (B) к селективной абляции эндотелиальных клеток (C). Красная наконечник стрелы показывает разорванную мембрану Десцемета, а зеленые наконечники стрел указывают на селективную абляцию кластеров ЦИК. Шкала бар 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Тепловая карта, показывающая вероятность избирательного ущерба ЦИК. В связи с этим необходимо учитывать энергию импульса, а также положение лазерного координационного центра Nd:YAG. Чрезмерное повреждение отображается красным цветом, а желаемая часть повреждений показана зеленым цветом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Результаты этого экспериментального исследования показывают, что nd:YAG лазер может быть использован для выборочно абляции роговицы эндотелиальных клеток, когда соответствующие параметры для дозы энергии и точки фокуса позиции выбраны.
Поскольку эндотелиальная функция важна для прозрачности роговицы и защиты роговицы от стромального отека, модели эндотелиальной дисфункции играют важную роль в разработке противоотеденных препаратов или хирургических процедур. Есть несколько установленных моделей in vitro для имитации ситуации in vivo10,,14,,15, но, как известно, модели in vitro не могут полностью имитировать влияние ферментов и цитокинов или эффект клеточного взаимодействия. В отличие от этого, это недавно разработанная модель ex vivo эндотелиальной потери клеток предлагает возможность контролировать различные состояния болезни и декомпенсации роговицы в естественной среде.
Поскольку роговица в нашей модели вырезается трефином после лазерной процедуры, физиология роговицы меняется и аналогична ситуации in vitro, региональные взаимодействия значительно затруднены. Тем не менее, локальный интерфейс остается нетронутым и особенно сотовой связи с другими клетками в роговицы сохраняется. Наше исследование показало, что в этих обстоятельствах роговица сохраняет свою функцию в течение трех дней в культуре, которая предлагает достаточно времени для наблюдения и оценки потенциальных терапевтических агентов. С другой стороны, длительные процессы заживления не могут быть исследованы.
В нашей модели, мы использовали свиные глаза, как большее количество тех, которые могут быть легко получены. Кроме того, свиные глаза очень хорошо имитируют человеческие глаза. В отличие от кроликов, которые регулярно используются для экспериментов, свиные глаза имеют мембрану Боумана. Тем не менее, толщина роговицы свиного глаза значительно отличается от человеческого глаза. В частности, свиная строма гораздо толще и нет никакой разницы между центральной и периферической толщиной в свиной роговицы16. Следует также учитывать, что человек ЦИК не имеют каких-либо возможностей исцеления в то время как эта регенеративная функция сообщается в некоторых животных, таких как свиньи и кролики17,18. Наше исследование не было сосредоточено на процессах заживления ран, но это различие следует иметь в виду при переводе результатов. Поскольку заживление раны животных ЦИК не превышает четырех дней, оно все равно может наблюдаться в наших культурных тканях, даже если они длятся всего три дня.
Сравнивая нашу экспериментальную установку с предыдущими исследованиями, прикладные уровни энергии были похожина 19. Вместо того, чтобы сосредоточиться только на эндотелии, были оценены различные места координационных центров. Таким образом, основное отличие нашей установки к более ранним исследованиям является его потенциал, чтобы вызвать конкретные эндотелиальные повреждения без повреждения dM или стромальной ткани. Точный мониторинг дозы энергии и фокусировки позволяет селективной абляции ЦИК, не вызывая ударной волны повреждения других частей роговицы. Кроме того, мы не заметили стромальный или субэпителиальный отек непосредственно после лазерного лечения20.
Предыдущее исследование показало, что температура в 40 градусов по Цельсию может привести к повреждению ЦИК21. Мы не измеряли индуцированную температуру, но она могла бы представлять интерес для дальнейших исследований. Кроме того, следует оценить влияние различных типов лазерных систем. Более ранние исследования показали разницу между лазером индуцированных ограниченный ущерб ЦИК и другие травмы ЦИК19,22. Это может также ограничить сопоставимость тканей и болезней человека, поскольку лазерное индуцированное повреждение, как представляется, сопровождается различными процессами развития болезней. Интересно, что заживление раны после лазерного применения остановился на сожгли DM в более ранних исследованиях19. Источник травмы может быть менее важным, если DM остается нетронутым.
Более высокие уровни энергии могут представлять более высокий риск длительной травмы22. Наши результаты показывают, что использование более высоких уровней энергии (2,9 мДж) для выборочного повреждения ЦИК требует более жесткого диапазона фокусировки. В то время как повреждение ЦИК было механически применено в предыдущих исследованиях17, лазерно-индуцированных повреждений, используемых здесь имеет более точное дозирование поражения и может быть легко использован в in vivo исследований.
Следует отметить, что в соответствии с этим протоколом было обработано и обследовано лишь небольшое количество глаз. Как упоминалось выше, могут быть межиндивидуальные различия в ответ на лазерное лечение, а также различия между роговицы различных видов животных. Поскольку ущерб, нанесенный ЦИК, может быть произведен на различных координационных должностях, определенные пороговые значения не должны быть превышены, чтобы избежать расширенного ущерба.
Наконец, поражения, полученные в этом исследовании, были помещены в центральную часть. Более раннее исследование свиных глаз показало ускоренное заживление ран в периферии роговицы, что может быть связано с его близостью к лимбациальным стволовым клеткам17, так как толщина роговицы в свиных глазах не отличается между регионами. В будущих исследованиях следует оценивать, следует ли корректировать лазерные параметры при переключении с центра роговицы на периферию.
В заключение наше исследование вводит неинвазивную модель дальнейших расследований дисфункции ЦИК. Ограничения ex vivo или in vivo исследований с точки зрения использования животных вместо тканей человека остаются и должны быть рассмотрены при интерпретации результатов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим Кристино Эрон и Яна А. М. Сочурек за помощь в экспериментальных методах.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BARRON VACUUM TREPHINE | Katena | K20-2058 | |
| Cryostat | Leica | CM 3050S | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose | PAA | E-15009 | |
| Eye holder | Self | N/A | |
| Inverted Microscope | Leica | DMI 6000 B | |
| KH2PO4 | Merck | 529568 | |
| Na2HPO4 | Merck | 1065860500 | |
| Nd:YAG laser | Zeiss Meditec | visuLAS YAG II plus | |
| OCT Tissue Tek | Sakura Finetechnical | 4583 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010056 | |
| Porcine serum | Sigma-Aldrich | 12736C | |
| Spectral-domain optical coherence tomograph | Heidelberg Engineering | Spectralis | |
| Tissue culture plate 12-well | Sarstedt | 833921 | |
| Two-Photon Microscope | JenLab | DermaInspect | |
| Viscoelastic | OmniVision | Methocel |
References
- DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract and Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
- Edelhauser, H. F. The balance between corneal transparency and edema: the Proctor Lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (5), 1754-1767 (2006).
- Tuft, S. J., Coster, D. J. The corneal endothelium. Eye. 4, London, England. Pt 3 389-424 (1990).
- Bourne, W. M. Biology of the corneal endothelium in health and disease. Eye. 17, 912-918 (2003).
- He, Z., et al. 3D map of the human corneal endothelial cell. Scientific Reports. 6, 29047 (2016).
- Gain, P., et al. Global Survey of Corneal Transplantation and Eye Banking. JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).
- Schwartzkopff, J., Bredow, L., Mahlenbrey, S., Boehringer, D., Reinhard, T. Regeneration of corneal endothelium following complete endothelial cell loss in rat keratoplasty. Molecular Vision. 16, 2368-2375 (2010).
- Bredow, L., Schwartzkopff, J., Reinhard, T. Regeneration of corneal endothelial cells following keratoplasty in rats with bullous keratopathy. Molecular Vision. 20, 683-690 (2014).
- Bartakova, A., Kunzevitzky, N. J., Goldberg, J. L. Regenerative Cell Therapy for Corneal Endothelium. Current Ophthalmology Reports. 2 (3), 81-90 (2014).
- Zhao, B., et al. Development of a three-dimensional organ culture model for corneal wound healing and corneal transplantation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (7), 2840-2846 (2006).
- Aron-Rosa, D., Aron, J. J., Griesemann, M., Thyzel, R. Use of the neodymium-YAG laser to open the posterior capsule after lens implant surgery: a preliminary report. Journal - American Intra-Ocular Implant Society. 6 (4), 352-354 (1980).
- Vogel, A., Hentschel, W., Holzfuss, J., Lauterborn, W. Cavitation bubble dynamics and acoustic transient generation in ocular surgery with pulsed neodymium: YAG lasers. Ophthalmology. 93 (10), 1259-1269 (1986).
- Vogel, A., Schweiger, P., Frieser, A., Asiyo, M. N., Birngruber, R. Intraocular Nd:YAG laser surgery: laser-tissue interaction, damage range, and reduction of collateral effects. IEEE Journal of Quantum Electronics. 26 (12), 2240-2260 (1990).
- Zhu, Q., Zhu, Y., Tighe, S., Liu, Y., Hu, M. Engineering of Human Corneal Endothelial Cells In Vitro. International Journal of Medical Sciences. 16 (4), 507-512 (2019).
- Li, Z., et al. Nicotinamide inhibits corneal endothelial mesenchymal transition and accelerates wound healing. Experimental Eye Research. 184, 227-233 (2019).
- Pescina, S., et al. Development of a convenient ex vivo model for the study of the transcorneal permeation of drugs: histological and permeability evaluation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (1), 63-71 (2015).
- Smeringaiova, I., et al. Endothelial Wound Repair of the Organ-Cultured Porcine Corneas. Current Eye Research. 43 (7), 856-865 (2018).
- Yamashita, K., et al. A Rabbit Corneal Endothelial Dysfunction Model Using Endothelial-Mesenchymal Transformed Cells. Scientific Reports. 8 (1), 16868 (2018).
- Schubert, H. D., Trokel, S. Endothelial repair following Nd:YAG laser injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (8), 971-976 (1984).
- Zhang, W., et al. Rabbit Model of Corneal Endothelial Injury Established Using the Nd: YAG Laser. Cornea. 36 (10), 1274-1281 (2017).
- McCally, R. L., Bonney-Ray, J., de la Cruz, Z., Green, W. R. Corneal endothelial injury thresholds for exposures to 1.54 micro m radiation. Health Physics. 92 (3), 205-211 (2007).
- Nash, J. P., Wickham, M. G., Binder, P. S. Corneal damage following focal laser intervention. Experimental Eye Research. 26 (6), 641-650 (1978).
