Summary
Hier presenteren we een protocol om hoornvliesendodelialcellen (CEC) los te koppelen van het membraan (DM) van Descemet met behulp van een neodymium:YAG (Nd:YAG) laser als ex vivo ziektemodel voor bullous keratopathie (BK).
Abstract
Nd: YAG lasers zijn gebruikt om niet-invasieve intraoculaire chirurgie uit te voeren, zoals capsulotomy voor meerdere decennia nu. Het indringende effect is afhankelijk van de optische afbraak bij de laserfocus. Akoestische schokgolven en cavitatiebellen ontstaan, waardoor weefselbreuk ontstaat. Belgroottes en drukamplitudes variëren met pulsenergie en positie van het brandpunt. In deze studie werden enucleated varkensogen geplaatst voor een commercieel beschikbare Nd:YAG laser. Variabele puls energieën evenals verschillende posities van de brandpunten posterior naar het hoornvlies werden getest. Resulterende laesies werden geëvalueerd door twee-foton microscopie en histologie om de beste parameters voor een exclusieve onthechting van hoornvlies endotheel cellen (CEC) met minimale bijkomende schade te bepalen. De voordelen van deze methode zijn de precieze ablatie van CEC, verminderde bijkomende schade, en vooral de contactloze behandeling.
Introduction
Transparantie van het hoornvlies is essentieel voor de overdracht van licht naar het netvlies en de fotoreceptoren1. In dit verband is een relatieve staat van uitdroging van cruciaal belang om de collageenvezels in de hoornvliesstroma correct uitgelijnd te houden. Deze homeostase wordt onderhouden door hoornvliesendotheelcellen (CEC) gelegen op het membraan van de Descemet (DM)2. Het endotheel is de binnenste hoornvlieslaag. Het heeft een belangrijke barrière en pomp functie, die cruciaal is voor hoornvlies transparantie3. In tegenstelling tot het epitheel is het endotheel niet in staat om zichzelf te vernieuwen4. Daarom stimuleert elke celschade veroorzaakt door ziekte of trauma de resterende endotheelcellen om te vergroten en te migreren, resulterende defecten te dekken en hoornvliesfunctionaliteit te behouden5. Als de CEC-dichtheid echter onder een kritische drempel zakt, leidt decompensatie van het endotheel tot een oedeem, wat resulteert in wazig zicht en ongemak of zelfs ernstige pijn4. Ondanks de beschikbaarheid van geneesmiddelen om de symptomen te verlichten, momenteel de enige definitieve behandeling in deze gevallen is hoornvliestransplantatie, die kan worden uitgevoerd in de vorm van een volledige-dikte graft of een lamellen endotheeltransplantatie. Deze laatste procedure is beschikbaar als Descemet's membraan endothelial keratoplastie (DMEK) evenals Descemet's strippen geautomatiseerde endotheel keratoplastie (DSAEK)6. De bescherming van de resterende CEC en het verbeteren van hun overleving zou echter een alternatief doel kunnen zijn, dat een adequaat ziektemodel nodig heeft om potentiële therapeutische geneesmiddelen te testen.
De huidige CEC-verliesziektemodellen richten zich op de vernietiging van het endotheel door de injectie van toxische stoffen (bijvoorbeeld benzalkoniumchloride) in de voorste kamer of door mechanische slijtage van de cellen met behulp van een invasieve descemetorhexistechniek7,8. Hoewel deze modellen goed ingeburgerd zijn, bestaan er nadelen zoals algemene ontstekingsreactie en onnauwkeurige bijkomende schade. Daarom zijn deze modellen meer kans om de laatste stadia van de ziekte te vertegenwoordigen, wanneer de bovengenoemde chirurgische opties onvermijdelijk zijn.
Met vooruitgang in cellulaire behandelingsstrategieën zoals stamcellen en gentherapie, zou de toepassing van deze cellulaire therapieën in vroege stadia van verlies CEC9nuttig kunnen zijn. Vervolgens hebben we een model nodig dat deze eerdere stadia van de ziekte beter vertegenwoordigt. In dit verband zijn celkweekmodellen de afgelopen tien jaar verbeterd, maar zijn ze nog steeds beperkt in hun geldigheid, omdat cellen in vitro niet in de buurt kunnen komen van het repliceren van de complexe interacties die optreden tussen de verschillende celtypen binnen het hoornvlies10. Daarom zijn ex vivo en in vivo ziektemodellen nog steeds in trek en het verbeteren van de bestaande modellen is van het grootste belang.
Niet-invasieve, intraoculaire chirurgie door fotoverstoring met behulp van een neodymium: YAG (Nd:YAG) laser is uitgegroeid tot een routineprocedure voor oogartsen wereldwijd sinds de invoering ervan in de late jaren 197011. Fotoverstoring is afhankelijk van niet-lineaire lichtabsorptie die leidt tot de vorming van plasma, het genereren van akoestische schokgolven en het ontstaan van cavitatiebellen, wanneer de toepassingsplaats zich in een vloeibare omgeving bevindt12. In het algemeen dragen deze processen bij aan het beoogde effect van nauwkeurig weefselsnijden. Echter, ze kunnen ook de bron van onnodige bijkomende schade beperken van de lokale opsluiting van laserchirurgie13.
De voorspelling van de resulterende mechanische effecten is aanzienlijk verbeterd door karakterisering van de schokgolf voortplanting en cavitatie cursus. Het is ons doel om CEC te richten met zo weinig mogelijk schade aan omliggende weefsel om een niet-invasieve, laser-ondersteunde experimentele ziekte model voor de vroege stadia van CEC verlies te bieden. Hiervoor is het noodzakelijk om de optimale pulsenergieën en posities van de brandpunten van de laser te bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures met betrekking tot dierlijk weefsel volgen de richtlijnen van de plaatselijke Commissie dierverzorging en ethiek.
1. Voorbereiding van de orgaancultuur en laserbehandeling
- Verkrijg vers opgesomde varkensogen van het plaatselijke slachthuis. Houd ze koel (4 °C) in dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) met hoge glucose, aangevuld met L-glutamine, natriumpyruvaat, penicilline/streptomycine (1%) en varkensserum (10%), voortaan in dit artikel als volledig medium aangeduid.
- Verwijder extracellulaire weefsels met een schaar en week de ogen in 5% povidone-jodium oogheelkundige oplossing voor 5 min voor het plaatsen van hen in gesteriliseerde fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) tot gebruik.
- Scherm ogen voor belangrijke voorste segment pathologieën, zoals hoornvlies littekens, oedeem, en andere opacities met een spectral-domein optische coherentie tomografie apparaat (Tabel van materialen).
- Plaats de ogen voor een spleet-lamp unit uitgerust met een Nd:YAG laser (Tabel van materialen), die een golflengte van 1.064 nm en een brandpuntspuntsafstand diameter van 10 μm in de lucht heeft.
OPMERKING: Voor een optimale positionering wordt een 3D-geprint e-apparaat gebruikt, dat is ontworpen om het oog stevig vast te houden, zonder er te veel druk op te leggen (figuur 1). - Gebruik een vergroting van 12x en buig de verlichting af om de individuele hoornvlieslagen te visualiseren.
- Stel de pulsenergie (bijvoorbeeld 1,6 mJ) en het focuspunt (bijvoorbeeld 0,16 mm) in voor selectieve ablatie van endotheelcellen.
- Plaats een helder hoornvlies paracentesis dicht bij de limbus en injecteer visco-elastische(Tabel van materialen)om de voorste kamer te stabiliseren.
- Accijns het laserbehandelde centrale hoornvlies uit met een trephine van 8 mm.
- Plaats het uitgesneden hoornvlies in een put van een 12-put plaat met de endotheel site naar boven gericht en uitbroed het monster in 3 mL van volledig medium bij 37 °C gedurende maximaal 3 dagen.
OPMERKING: Tijdens deze stap kunnen potentiële cytoprotectiemiddelen aan het medium worden toegevoegd.
2. Voorbereiding van de histologie
- Bereid de buffer van Sorensen voor met een pH van 7,4 met 19,6 mL van 133 mM KH2PO4 en 80,4 mL van 133 mM Na2HPO4.
- Verwijder het medium uit het hoornvlies houdende put en fixer het weefsel gedurende 20 min bij kamertemperatuur (RT) met methanolvrije paraformaldehyde (4%) in de buffer van Sorensen.
- Plaats weefsel in 20% sacharose in PBS tot weefsel zinkt (1 uur) en vervolgens in 30% sacharose in PBS 's nachts bij RT. Zorg ervoor dat u contact met bellen en de interface van het luchtoppervlak vermijdt. Sluit weefsel in in optimale snijtemperatuur (OCT) verbinding en bewaar op -80 °C.
- Snijd secties 10 μm dik met behulp van een cryostat bij -27 °C.
OPMERKING: Een kameel haarborstel is handig om te helpen begeleiden de opkomende sectie over het mes. - Breng de sectie naar een microscoopdia door de dia aan te raken in het weefsel binnen 1 min van het snijden om te voorkomen dat het weefsel invriesdroogt. Bewaar de dia's op -80 °C.
3. Hematoxylin en eosine (H&E) kleuring
- Lucht droge secties gedurende enkele minuten om vocht te verwijderen.
- Vlek met gefilterde 0,1% Mayers hematoxylin gedurende 10 min in een 50 mL buis.
- Spoel in een Coplin pot in koel lopende ddH2O gedurende 5 min en dompel in 0,5% eosine 10x.
- Dip in ddH2O totdat de eosine stopt strepen en duik dan in 50% (10x) evenals 70% (10x) EtOH.
- Equilibrate in 95% EtOH (30 s) en 100% EtOH (60 s) alvorens in xyleen meerdere keren te dompelen.
- Monteer en bedek het monster ten slotte voordat u foto's maakt met een lichtmicroscoop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van de hier gepresenteerde procedure behandelden we ogen met een Nd:YAG-laser, waarbij we verschillende puls-energieën (1,0−4,6 mJ) en posities van brandpunten (afstand tot het achterste oppervlak van het hoornvlies: 0,0−0,2 mm) evalueerden om de optimale parameters te vinden. Meerdere replica's (n = 3) werden geëvalueerd voor elke constellatie van de laserparameters (12 x 21).
In aanvulling op de bovengenoemde protocol, monster werd geanalyseerd met een twee-foton microscoop voor fixatie en H & E kleuring. De twee-foton microscoop gebruikt een solid-state, mode-locked 80 MHz Ti: sapphire laser met een tuning bereik van 690−1b040 nm en een gemiddelde laser output van >900 mW op 800 nm als lichtbron. Het leverde impulsen met een breedte van ongeveer 150 fs aan het monster. Beelden werden genomen met een microscoop doelstelling (20x/0.95) op een golflengte van 730 nm en 30 mW van laser kracht.
Twee-foton en licht microscopie beelden werden onafhankelijk beoordeeld door 3 reviewers, die werden verblind om experimentele instellingen en moest de beelden toe te wijzen aan drie categorieën: (1) geen schade, (2) te veel schade, of (3) juiste hoeveelheid schade (Figuur 2 en figuur 3). Op basis van hun evaluatie werd een heatmap berekend (Figuur 4). Met behulp van deze heatmap is het mogelijk om de juiste constellatie van laserparameters te selecteren om CEC selectief te ableren met minimale schade aan omringend weefsel (groen). Uit de resultaten blijkt dat het brandpunt van de laser ten minste 0,15 mm achter het hoornvliesendotheel moet liggen voor de laagste geteste pulsenergie (1,0 mJ). Voor puls-energieën hoger dan 2,9 mJ is de langste brandpuntsafstand (0,2 mm) nog steeds te dicht bij het endotheel.
Figuur 1: Experimentele opstelling. (A) De ogen werden bevestigd in een gedeeltelijk 3D-geprint e-werkapparaat, dat een nauwkeurige uitlijning ten opzichte van de laserstraal mogelijk maakte. (B) Vóór de laserbehandeling werd het weefsel geëvalueerd met een anterieure segment optische coherentie tomografie apparaat om te controleren op belangrijke voorste segment pathologieën. Posities van focale laserpunten zijn aangegeven met voorbeeldig voor 0,0 mm (zwart sterretje), 0,1 mm (rood sterretje) en 0,2 mm (blauw sterretje). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Microscopie met twee fotonen. De resultaten varieerden van helemaal geen schade (A), uitgebreide bijkomende schade(B)tot selectieve ablatie van endotheelcellen (C). De rode pijlpunt toont een gescheurd descemet's membraan, en groene pijlpunten wijzen op selectieve ablatie van CEC-clusters. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Histologie. Hematoxylin en eosine kleuring bevestigd de schade variëren van geen schade op alle (A), uitgebreide collateral damage (B) tot selectieve ablatie van endotheelcellen (C). De rode pijlpunt toont een gescheurd descemet's membraan, en groene pijlpunten wijzen op selectieve ablatie van CEC-clusters. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Een heatmap met de waarschijnlijkheid van selectieve CEC-schade. Hierbij moet rekening worden gehouden met de pulsenergie en de positie van het Nd:YAG-laserbrandpunt. Overmatige schade wordt weergegeven in het rood, en het gewenste deel van de schade wordt weergegeven in het groen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De resultaten van deze pilot studie geven aan dat een Nd:YAG laser kan worden gebruikt om selectief ablate hoornvlies endotheel cellen wanneer de juiste parameters voor energie dosis en focus punt positie worden gekozen.
Aangezien de endotheliale functie belangrijk is voor de transparantie van het hoornvlies en het beschermen van het hoornvlies tegen stronaal oedeem, spelen modellen van endotheeldisfunctie een belangrijke rol bij de ontwikkeling van anti-oedematousgeneesmiddelen of chirurgische ingrepen. Er zijn verschillende in vitro modellen voor het nabootsen van de in vivo situatie10,14,15, maar zoals algemeen bekend, kunnen in vitro modellen de invloeden van enzymen en cytokinen of het effect van celcel-interactie niet volledig imiteren. In tegenstelling, dit nieuw ontwikkelde ex vivo model van endotheel celverlies biedt de mogelijkheid om verschillende toestanden van de ziekte en hoornvlies decompensatie in de natuurlijke omgeving te controleren.
Aangezien het hoornvlies in ons model na de laserprocedure wordt weggesneden met een trephine, verandert de fysiologie van het hoornvlies en vergelijkbaar met de in vitro situatie, regionale interacties worden aanzienlijk belemmerd. Echter, de lokale interface blijft intact en vooral de cellulaire communicatie naar andere cellen binnen het hoornvlies blijft bestaan. Onze studie toonde aan dat onder deze omstandigheden het hoornvlies zijn functie gedurende drie dagen in de cultuur behoudt, wat voldoende tijd biedt om potentiële therapeutische middelen te observeren en te evalueren. Aan de andere kant kunnen oude genezingsprocessen niet worden onderzocht.
In ons model gebruikten we varkensogen als grotere hoeveelheden van die gemakkelijk kan worden verkregen. Bovendien bootsen varkensogen de menselijke ogen heel goed na. In tegenstelling tot konijnen die regelmatig worden gebruikt voor het experiment, varkensogen hebben een Bowman's membraan. Niettemin verschilt de hoornvliesdikte van het varkensoog aanzienlijk van het menselijk oog. In het bijzonder, de varkensstroma is veel dikker en er is geen verschil tussen centrale en perifere dikte in varkenshoornvliezen16. Er moet ook rekening worden gehouden met het vermogen van de menselijke CEC om te genezen, terwijl deze regeneratieve eigenschap wordt gemeld bij sommige dieren, zoals varkens en konijnen17,18. Onze studie richtte zich niet op wondgenezingsprocessen, maar dit verschil moet in gedachten worden gehouden bij het vertalen van resultaten. Aangezien de wondgenezing van dier CEC niet meer dan vier dagen bedraagt, kan het nog steeds worden waargenomen in onze gekweekte weefsels, zelfs als ze slechts drie dagen duren.
In vergelijking met onze experimentele opzet met eerdere studies waren de toegepaste energieniveaus vergelijkbaarmet 19. In plaats van zich alleen te richten op het endotheel, werden verschillende locaties van brandpunten geëvalueerd. Daarom is het belangrijkste verschil van onze setup naar eerdere studies het potentieel om specifieke endotheelschade te veroorzaken zonder dm of stromaviaal weefsel te beschadigen. Nauwkeurige monitoring van de energiedosis en focuspositie maakt selectieve CEC-ablatie mogelijk zonder schokgolfschade te veroorzaken aan andere delen van het hoornvlies. Ook hebben we niet gemerkt stromal of subepithelial oedeem direct na laserbehandeling20.
Een eerdere studie toonde aan dat temperaturen van ~40 °C kunnen leiden tot CEC schade21. We hebben de geïnduceerde temperatuur niet gemeten, maar het kan interessant zijn voor verdere studies. Bovendien moet het effect van verschillende soorten lasersystemen worden geëvalueerd. Eerdere studies toonden een verschil aan tussen laser geïnduceerde omschreven CEC schade en andere CEC verwondingen19,22. Dit kan ook de vergelijkbaarheid met menselijk weefsel en ziekten beperken, omdat laser veroorzaakte schade lijkt te worden gevolgd door verschillende ziekte ontwikkelingsprocessen. Interessant is dat de wond genezing na laser toepassing gestopt bij de verbrande DM in eerdere studies19. De oorzaak van de schade kan minder belangrijk zijn als de DM intact blijft.
Hogere energieniveaus kunnen een hoger risico op langdurig letsel opleveren22. Onze resultaten tonen aan dat het gebruik van hogere energieniveaus (<2.9 mJ) voor selectieve CEC-schade een strakker focusbereik vereist. Terwijl de schade aan CEC mechanisch werd toegepast in eerdere studies17, laser-geïnduceerde schade die hier wordt gebruikt heeft een meer nauwkeurige doseren van de laesie en kan gemakkelijk worden gebruikt in in vivo studies.
Opgemerkt moet worden dat slechts een klein aantal ogen zijn behandeld en onderzocht volgens dit protocol. Zoals hierboven vermeld, kunnen er verschillen zijn in de respons op de laserbehandeling en verschillen tussen de hoornvliezen van verschillende diersoorten. Aangezien CEC-schade op verschillende focale posities kan worden veroorzaakt, mogen bepaalde drempels niet worden overschreden om langdurige schade te voorkomen.
Ten slotte werden de laesies die in deze studie werden gegenereerd, in het centrale deel geplaatst. Een eerdere studie van varkensogen toonde versnelde wondgenezing in de hoornvliesperiferie, wat te wijten zou kunnen zijn aan de nabijheid van limbale stamcellen17, omdat de hoornvliesdikte in varkensogen niet verschilt tussen regio's. In toekomstige studies moet worden geëvalueerd of laserparameters moeten worden aangepast bij het overschakelen van het centrum van het hoornvlies naar de periferie.
Tot slot introduceert onze studie een niet-invasief model voor verder onderzoek naar CEC-disfunctie. Beperkingen van ex vivo of in vivo studies in termen van gebruik van dierlijk in plaats van menselijk weefsel blijven en moeten in aanmerking worden genomen bij de interpretatie van de resultaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Christine Örün en Jan A. M. Sochurek voor hun hulp bij experimentele methoden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BARRON VACUUM TREPHINE | Katena | K20-2058 | |
| Cryostat | Leica | CM 3050S | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose | PAA | E-15009 | |
| Eye holder | Self | N/A | |
| Inverted Microscope | Leica | DMI 6000 B | |
| KH2PO4 | Merck | 529568 | |
| Na2HPO4 | Merck | 1065860500 | |
| Nd:YAG laser | Zeiss Meditec | visuLAS YAG II plus | |
| OCT Tissue Tek | Sakura Finetechnical | 4583 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010056 | |
| Porcine serum | Sigma-Aldrich | 12736C | |
| Spectral-domain optical coherence tomograph | Heidelberg Engineering | Spectralis | |
| Tissue culture plate 12-well | Sarstedt | 833921 | |
| Two-Photon Microscope | JenLab | DermaInspect | |
| Viscoelastic | OmniVision | Methocel |
References
- DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract and Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
- Edelhauser, H. F. The balance between corneal transparency and edema: the Proctor Lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (5), 1754-1767 (2006).
- Tuft, S. J., Coster, D. J. The corneal endothelium. Eye. 4, London, England. Pt 3 389-424 (1990).
- Bourne, W. M. Biology of the corneal endothelium in health and disease. Eye. 17, 912-918 (2003).
- He, Z., et al. 3D map of the human corneal endothelial cell. Scientific Reports. 6, 29047 (2016).
- Gain, P., et al. Global Survey of Corneal Transplantation and Eye Banking. JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).
- Schwartzkopff, J., Bredow, L., Mahlenbrey, S., Boehringer, D., Reinhard, T. Regeneration of corneal endothelium following complete endothelial cell loss in rat keratoplasty. Molecular Vision. 16, 2368-2375 (2010).
- Bredow, L., Schwartzkopff, J., Reinhard, T. Regeneration of corneal endothelial cells following keratoplasty in rats with bullous keratopathy. Molecular Vision. 20, 683-690 (2014).
- Bartakova, A., Kunzevitzky, N. J., Goldberg, J. L. Regenerative Cell Therapy for Corneal Endothelium. Current Ophthalmology Reports. 2 (3), 81-90 (2014).
- Zhao, B., et al. Development of a three-dimensional organ culture model for corneal wound healing and corneal transplantation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (7), 2840-2846 (2006).
- Aron-Rosa, D., Aron, J. J., Griesemann, M., Thyzel, R. Use of the neodymium-YAG laser to open the posterior capsule after lens implant surgery: a preliminary report. Journal - American Intra-Ocular Implant Society. 6 (4), 352-354 (1980).
- Vogel, A., Hentschel, W., Holzfuss, J., Lauterborn, W. Cavitation bubble dynamics and acoustic transient generation in ocular surgery with pulsed neodymium: YAG lasers. Ophthalmology. 93 (10), 1259-1269 (1986).
- Vogel, A., Schweiger, P., Frieser, A., Asiyo, M. N., Birngruber, R. Intraocular Nd:YAG laser surgery: laser-tissue interaction, damage range, and reduction of collateral effects. IEEE Journal of Quantum Electronics. 26 (12), 2240-2260 (1990).
- Zhu, Q., Zhu, Y., Tighe, S., Liu, Y., Hu, M. Engineering of Human Corneal Endothelial Cells In Vitro. International Journal of Medical Sciences. 16 (4), 507-512 (2019).
- Li, Z., et al. Nicotinamide inhibits corneal endothelial mesenchymal transition and accelerates wound healing. Experimental Eye Research. 184, 227-233 (2019).
- Pescina, S., et al. Development of a convenient ex vivo model for the study of the transcorneal permeation of drugs: histological and permeability evaluation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (1), 63-71 (2015).
- Smeringaiova, I., et al. Endothelial Wound Repair of the Organ-Cultured Porcine Corneas. Current Eye Research. 43 (7), 856-865 (2018).
- Yamashita, K., et al. A Rabbit Corneal Endothelial Dysfunction Model Using Endothelial-Mesenchymal Transformed Cells. Scientific Reports. 8 (1), 16868 (2018).
- Schubert, H. D., Trokel, S. Endothelial repair following Nd:YAG laser injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (8), 971-976 (1984).
- Zhang, W., et al. Rabbit Model of Corneal Endothelial Injury Established Using the Nd: YAG Laser. Cornea. 36 (10), 1274-1281 (2017).
- McCally, R. L., Bonney-Ray, J., de la Cruz, Z., Green, W. R. Corneal endothelial injury thresholds for exposures to 1.54 micro m radiation. Health Physics. 92 (3), 205-211 (2007).
- Nash, J. P., Wickham, M. G., Binder, P. S. Corneal damage following focal laser intervention. Experimental Eye Research. 26 (6), 641-650 (1978).
