Summary
Aquí, presentamos un protocolo para separar las células endoteliales corneales (CEC) de la membrana de Descemet (DM) utilizando un láser neodimio:YAG (Nd:YAG) como modelo de enfermedad ex vivo para la queratopatía bullosa (BK).
Abstract
Los láseres Nd:YAG se han utilizado para realizar cirugía intraocular no invasiva, como la capsulotomía desde hace varias décadas. El efecto incisivo se basa en la descomposición óptica en el foco láser. Se generan ondas de choque acústicas y burbujas de cavitación, causando ruptura del tejido. Los tamaños de burbuja y las amplitudes de presión varían con la energía del pulso y la posición del punto focal. En este estudio, los ojos porcinos enucleados se colocaron frente a un láser Nd:YAG disponible comercialmente. Se probaron las energías de pulso variables, así como las diferentes posiciones de los puntos focales posteriores a la córnea. Las lesiones resultantes fueron evaluadas por microscopía de dos fotones e histología para determinar los mejores parámetros para un desprendimiento exclusivo de células endoteliales corneales (CEC) con un daño colateral mínimo. Las ventajas de este método son la ablación precisa de la CEC, la reducción de los daños colaterales y, sobre todo, el tratamiento sin contacto.
Introduction
La transparencia de la córnea es esencial para la transmisión de la luz a la retina y sus fotorreceptores1. En este sentido, un estado relativo de deshidratación es fundamental para mantener las fibras de colágeno dentro del estroma corneal correctamente alineados. Esta homeostasis es mantenida por células endoteliales corneales (CEC) ubicadas en la membrana del Descemet (DM)2. El endotelio es la capa corneal más interna. Tiene una importante función de barrera y bomba, que es crucial para la transparencia corneal3. A diferencia del epitelio, el endotelio no es capaz de renovarse así mismo 4. Por lo tanto, cualquier daño celular causado por enfermedad o trauma estimula las células endoteliales restantes para agrandar y migrar, para cubrir los defectos resultantes y para mantener la funcionalidad corneal5. Sin embargo, si la densidad CEC cae por debajo de un umbral crítico, la descompensación del endotelio conduce a un edema, lo que resulta en visión borrosa y malestar o incluso dolor intenso4. A pesar de la disponibilidad de fármacos para aliviar los síntomas, actualmente el único tratamiento definitivo en estos casos es el trasplante de córnea, que se puede realizar en forma de un injerto de espesor completo o un trasplante endotelial lamelar. Este último procedimiento está disponible como queratoplastia endotelial de membrana (DMEK) de Descemet, así como como queratoplastia endotelial automatizada de Descemet (DSAEK)6. Sin embargo, la protección de la CEC restante y la mejora de su supervivencia podrían ser un objetivo alternativo, que necesita un modelo adecuado de enfermedad para probar posibles medicamentos terapéuticos.
Los modelos actuales de enfermedad por pérdida de CEC se centran en la destrucción del endotelio mediante la inyección de agentes tóxicos (por ejemplo, cloruro de benzalconio) en la cámara anterior o por abrasión mecánica de las células mediante una técnica invasiva dedescemetorhexis7,8. Si bien estos modelos están bien establecidos, existen desventajas como la respuesta inflamatoria general y los daños colaterales imprecisos. Por lo tanto, estos modelos son más propensos a representar las etapas finales de la enfermedad, cuando las opciones quirúrgicas antes mencionadas son inevitables.
Con los avances en las estrategias de tratamiento celular como las células madre y la terapia génica, la aplicación de estas terapias celulares podría ser útil en las primeras etapas de la pérdida de CEC9. Posteriormente, necesitamos un modelo que represente estas etapas tempranas de la enfermedad de manera más adecuada. En este sentido, los modelos de cultivo celular han mejorado en la última década, pero todavía están limitados en su validez, ya que las células in vitro no pueden acercarse a replicar las complejas interacciones que se producen entre los diferentes tipos de células dentro de la córnea10. Por lo tanto, los modelos de enfermedad ex vivo e in vivo siguen siendo muy demandados y mejorar los existentes es de suma interés.
La cirugía intraocular no invasiva por fotodisfial utilizando un láser neodimio:YAG (Nd:YAG) se ha convertido en un procedimiento de rutina para oftalmólogos de todo el mundo desde su introducción a finales de la década de 197011. La fotorinterrupción se basa en la absorción de luz no lineal que conduce a la formación de plasma, generación de ondas de choque acústicas y creación de burbujas de cavitación, siempre que el sitio de aplicación se encuentra en un entorno líquido12. En general, estos procesos contribuyen al efecto previsto del corte preciso de tejidos. Sin embargo, también pueden ser la fuente de daños colaterales innecesarios que limitan el confinamiento local de la cirugía láser13.
La predicción de los efectos mecánicos resultantes ha mejorado significativamente a través de la caracterización del curso de propagación de ondas de choque y cavitación. Nuestro objetivo es atacar la CEC con el menor daño posible al tejido circundante para proporcionar un modelo de enfermedad experimental no invasiva, asistida por láser para las primeras etapas de la pérdida de CEC. Para ello, es necesario determinar las energías óptimas del pulso y las posiciones de los puntos focales del láser.
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Protocol
Todos los procedimientos relacionados con el tejido animal siguen las directrices del Comité local de cuidado y ética de los animales.
1. Preparación del cultivo de órganos y tratamiento con láser
- Obtenga ojos porcinos recién enucledados del matadero local. Manténgalos frescos (4oC) en el medio águila modificado de Dulbecco (DMEM) con alta glucosa, complementado con L-glutamina, piruvato sódico, penicilina/estreptomicina (1%), y suero porcino (10%), a partir de ahora mencionado en este artículo como medio completo.
- Retire los tejidos extracelulares con tijeras y empape los ojos en una solución oftálmica de povidona-yodo al 5% durante 5 minutos antes de colocarlos en solución salina esterilizada con fosfato (PBS) hasta su uso.
- Los ojos de la pantalla son las principales patologías del segmento anterior, como la cicatrización de la córnea, el edema y otras opacidades con un dispositivo de tomografía de coherencia óptica de dominio espectral(Tabla de materiales).
- Coloque los ojos delante de una unidad de lámpara de hendidura equipada con un láser Nd:YAG(Tabla de materiales),que tiene una longitud de onda de 1.064 nm y un diámetro de punto focal de 10 m en el aire.
NOTA: Para un posicionamiento óptimo se utiliza un aparato de sujeción impreso en 3D, que fue diseñado para mantener el ojo firme, sin poner demasiada presión sobre él(Figura 1). - Utilice un aumento de 12x y desvíese la iluminación para visualizar las capas corneales individuales.
- Ajuste la energía del pulso (por ejemplo, 1,6 mJ) y el punto de enfoque (por ejemplo, 0,16 mm) para la ablación selectiva de células endoteliales.
- Colocar una paracentesis de córnea transparente cerca del limbo e inyectar viscoelástico(Tabla de Materiales)para estabilizar la cámara anterior.
- Infórmese la córnea central tratada con láser utilizando una trephine de 8 mm.
- Colocar la córnea extirpada en un pozo de una placa de 12 pocillos con el sitio endotelial hacia arriba e incubar el espécimen en 3 ml de medio completo a 37oC durante un máximo de 3 días.
NOTA: Los posibles agentes citoprotectores se pueden agregar al medio durante este paso.
2. Preparación para la histología
- Preparar el tampón de Sorensen con un pH de 7,4 que contenga 19,6 ml de 133 mM KH2PO4 y 80,4 ml de 133 mM Na2HPO4.
- Retire el medio del pozo que contiene la córnea y fije el tejido durante 20 minutos a temperatura ambiente (RT) utilizando paraformaldehído libre de metanol (4%) en el tampón de Sorensen.
- Colocar el tejido en 20% sacarosa en PBS hasta que el tejido se hunda (1 h) y luego en 30% sacarosa en PBS durante la noche en RT. Tenga cuidado de evitar el contacto con las burbujas y la interfaz de la superficie de aire. Incruste el tejido en el compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) y guárdelo a -80 oC.
- Cortar las secciones de 10 m de espesor con un criostato a -27 oC.
NOTA: Un cepillo de pelo de camello es útil para ayudar a guiar la sección emergente sobre la cuchilla. - Transfiera la sección a una diapositiva del microscopio tocando la diapositiva al tejido dentro de 1 min después de cortarla para evitar el secado por congelación del tejido. Almacene las diapositivas a -80 oC.
3. Tinción de hematoxilina y eosina (H&E)
- Seque las secciones durante varios minutos para eliminar la humedad.
- Mancha con hematoxilina filtrada 0.1% Mayers durante 10 min en un tubo de 50 ml.
- En un frasco de Coplin, enjuague en frío ddH2O durante 5 min y sumerja en 0.5% eosin 10x.
- Sumerja en ddH2O hasta que la eosina deje de rayar y luego sumerja en 50% (10x) así como 70% (10x) EtOH.
- Equilibrar en 95% EtOH (30 s) y 100% EtOH (60 s) antes de sumergirse en xileno varias veces.
- Finalmente monte y cubra la muestra antes de tomar imágenes utilizando un microscopio de luz.
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Representative Results
Usando el procedimiento presentado aquí, tratamos los ojos con un láser Nd:YAG, evaluando diferentes energías de pulso (1.0-4.6 mJ) y posiciones de los puntos focales (distancia de la superficie posterior de la córnea: 0.0-0.2 mm) para encontrar los parámetros óptimos. Se evaluaron múltiples réplicas (n x 3) para cada constelación de los parámetros láser (12 x 21).
Además del protocolo antes mencionado, la muestra fue analizada con un microscopio de dos fotones antes de la fijación y la tinción de H&E. El microscopio de dos fotones utilizaba un láser Ti de 80 MHz de estado sólido, con bloqueo de modo, con un rango de afinación de 690 a 1b040 nm y una salida láser media de >900 mW a 800 nm como fuente de luz. Entregó pulsos con una anchura de aproximadamente 150 fs a la muestra. Las imágenes se tomaron con un objetivo de microscopio (20x/0.95) a una longitud de onda de 730 nm y 30 mW de potencia láser.
3 revisores, que fueron cegados a entornos experimentales, revisaron de forma independiente las imágenes de dos fotones y microfotografía ligeras, y tuvieron que asignar las imágenes a tres categorías: (1) sin daño, (2) demasiado daño o (3) cantidad correcta de daño(Figura 2 y Figura 3). En función de su evaluación, se calculó un mapa de calor(Figura 4). Usando este mapa de calor es posible seleccionar la constelación correcta de parámetros láser para ablar selectivamente CEC con un daño mínimo al tejido circundante (verde). Los resultados muestran que el punto focal del láser debe estar al menos 0,15 mm detrás del endotelio corneal para la energía de pulso más baja (1,0 mJ) probada. Para energías de pulso superiores a 2,9 mJ, la distancia focal más larga probada (0,2 mm) todavía está demasiado cerca del endotelio.
Figura 1: Configuración experimental. (A) Los ojos se fijaron en un aparato de sujeción parcialmente impreso en 3D, lo que permitió una alineación precisa con respecto al rayo láser. (B) Antes del tratamiento con láser, el tejido se evaluó con un dispositivo de tomografía de coherencia óptica del segmento anterior para comprobar si hay patologías principales del segmento anterior. Las posiciones de los puntos láser focales se indican con un ejemplar de 0,0 mm (asterisco negro), 0,1 mm (asterisco rojo) y 0,2 mm (asterisco azul). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Microscopía de dos fotones. Los resultados no variaron desde ningún daño (A), daño colateral extenso (B) a la ablación selectiva de células endoteliales (C). La punta de flecha roja muestra una membrana de Descemet rota, y las puntas de flecha verdes indican la ablación selectiva de los racimos CEC. Barra de escala a 100 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Histología. La tinción de hematoxilina y eosina confirmó el rango de daño desde ningún daño (A), daño colateral extenso (B) a la ablación selectiva de células endoteliales (C). La punta de flecha roja muestra una membrana de Descemet rota, y las puntas de flecha verdes indican la ablación selectiva de los racimos CEC. Barra de escala a 100 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Un mapa de calor que muestra la probabilidad de daño selectivo cec. En este sentido, debe tenerse en cuenta la energía del pulso, así como la posición del punto focal láser Nd:YAG. El daño excesivo se muestra en rojo, y la parte deseada del daño se muestra en verde. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los resultados de este estudio piloto indican que un láser Nd:YAG se puede utilizar para ablar selectivamente las células endoteliales corneales cuando se eligen los parámetros adecuados para la dosis de energía y la posición del punto de enfoque.
Como la función endotelial es importante para la transparencia corneal y la protección de la córnea del edema estromales, los modelos de disfunción endotelial juegan un papel importante en el desarrollo de fármacos antiedematosos o procedimientos quirúrgicos. Existen varios modelos in vitro establecidos para imitar la situación in vivo10,14,15, pero como se conoce generalmente, los modelos in vitro no pueden imitar completamente las influencias de enzimas y citoquinas o el efecto de la interacción célula-célula. Por el contrario, este nuevo modelo ex vivo de pérdida celular endotelial ofrece la posibilidad de monitorear diferentes estados de la enfermedad y descompensación corneal en el medio natural.
Como la córnea en nuestro modelo se extirpan con un trephine después del procedimiento láser, la fisiología de la córnea cambia y similar a la situación in vitro, las interacciones regionales se ven significativamente obstaculizadas. Sin embargo, la interfaz local permanece intacta y especialmente la comunicación celular a otras células dentro de la córnea persiste. Nuestro estudio reveló que en estas circunstancias la córnea mantiene su función durante tres días en cultivo, lo que ofrece tiempo suficiente para observar y evaluar posibles agentes terapéuticos. Por otro lado, los procesos de curación de larga data no pueden ser investigados.
En nuestro modelo, utilizamos ojos porcinos como grandes cantidades de esos se pueden obtener fácilmente. Además, los ojos porcinos imitan muy bien los ojos humanos. A diferencia de los conejos que se utilizan regularmente para el experimento, los ojos porcinos tienen una membrana de Bowman. Sin embargo, el grosor de la córnea del ojo porcino difiere considerablemente del ojo humano. En particular, el estroma porcino es mucho más grueso y no hay diferencia entre el espesor central y periférico en las córneas porcinas16. También hay que considerar que la CEC humana no tiene ninguna capacidad curativa, mientras que esta característica regenerativa se informa en algunos animales, como cerdos y conejos17,,18. Nuestro estudio no se centró en los procesos de cicatrización de heridas, pero esta diferencia debe tenerse en cuenta al traducir los resultados. Como la cicatrización de heridas de la CEC animal no supera los cuatro días, todavía podría observarse en nuestros tejidos cultivados, incluso si duran sólo tres días.
Comparando nuestra configuración experimental con estudios anteriores, los niveles de energía aplicados fueron similares19. En lugar de centrarse sólo en el endotelio, se evaluaron diferentes ubicaciones de los puntos focales. Por lo tanto, la principal diferencia de nuestra configuración a estudios anteriores es su potencial para inducir daño endotelial específico sin dañar el tejido DM o stromal. El monitoreo preciso de la dosis de energía y la posición de enfoque permite la ablación selectiva cec sin causar daños por ondas de choque a otras partes de la córnea. Además, no hemos notado edema estrovo o subepitelial directamente después del tratamiento con láser20.
Un estudio anterior mostró que las temperaturas de 40 oC pueden provocar daños en la CEC21. No medimos la temperatura inducida, pero podría ser de interés para estudios posteriores. Además, debe evaluarse el efecto de los diferentes tipos de sistemas láser. Estudios anteriores mostraron una diferencia entre el daño por CEC circunscrito inducido por láser y otras lesiones de CEC19,,22. Esto también podría limitar la comparabilidad con el tejido humano y las enfermedades porque el daño inducido por láser parece ser seguido por diferentes procesos de desarrollo de la enfermedad. Curiosamente, la cicatrización de la herida después de la aplicación láser se detuvo en el DM quemado en estudios anteriores19. La fuente de lesiones podría ser menos importante si el DM permanece intacto.
Los niveles de energía más altos pueden suponer un mayor riesgo de lesiones prolongadas22. Nuestros resultados muestran que el uso de niveles de energía más altos (<2.9 mJ) para daño CEC selectivo requiere un rango de enfoque más ajustado. Mientras que el daño a la CEC se aplicó mecánicamente en estudios anteriores17, daño inducido por láser utilizado aquí tiene una dosificación más precisa de la lesión y se puede utilizar fácilmente en estudios in vivo.
Cabe señalar que sólo un pequeño número de ojos han sido tratados y examinados de acuerdo con este protocolo. Como se mencionó anteriormente, podría haber diferencias interindividuales en la respuesta al tratamiento con láser, así como diferencias entre las córneas de diferentes especies animales. Dado que el daño CEC se puede producir en diferentes posiciones focales, no se deben superar ciertos umbrales para evitar daños prolongados.
Finalmente, las lesiones generadas en este estudio se colocaron en la parte central. Un estudio anterior de los ojos porcinos mostró una cicatrización acelerada de la herida en la periferia corneal, que podría deberse a su proximidad a las células madre limbares17, ya que el grosor de la córnea en los ojos porcinos no difiere entre regiones. Debe evaluarse en estudios futuros si los parámetros del láser deben ajustarse al cambiar del centro de la córnea a la periferia.
En conclusión, nuestro estudio introduce un modelo no invasivo para nuevas investigaciones sobre la disfunción de la CEC. Las limitaciones de los estudios ex vivo o in vivo en términos de uso de animales en lugar de tejido humano permanecen y deben tenerse en cuenta al interpretar los resultados.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Christine y Jan A. M. Sochurek por su ayuda con métodos experimentales.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BARRON VACUUM TREPHINE | Katena | K20-2058 | |
| Cryostat | Leica | CM 3050S | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose | PAA | E-15009 | |
| Eye holder | Self | N/A | |
| Inverted Microscope | Leica | DMI 6000 B | |
| KH2PO4 | Merck | 529568 | |
| Na2HPO4 | Merck | 1065860500 | |
| Nd:YAG laser | Zeiss Meditec | visuLAS YAG II plus | |
| OCT Tissue Tek | Sakura Finetechnical | 4583 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010056 | |
| Porcine serum | Sigma-Aldrich | 12736C | |
| Spectral-domain optical coherence tomograph | Heidelberg Engineering | Spectralis | |
| Tissue culture plate 12-well | Sarstedt | 833921 | |
| Two-Photon Microscope | JenLab | DermaInspect | |
| Viscoelastic | OmniVision | Methocel |
References
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