Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att lossa hornhinnans endotelceller (CEC) från Descemets membran (DM) med hjälp av en neodym:YAG (Nd:YAG) laser som en ex vivo sjukdom modell för bullous keratopathy (BK).
Abstract
Nd: YAG lasrar har använts för att utföra noninvasive intraokulär kirurgi, såsom capsulotomy i flera decennier nu. Den skarpt aktiverade effekten bygger på den optiska nedbrytningen vid laserfokus. Akustiska chockvågor och kavitationsbubblor genereras, vilket orsakar vävnadsbristning. Bubble storlekar och tryck amplituder varierar med puls energi och position i fokus. I denna studie, enucleated svin ögon placerades framför en kommersiellt tillgänglig Nd:YAG laser. Variabel puls energier samt olika positioner i fokalfläckarna posteriort till hornhinnan testades. Resulterande skador utvärderades av två foton mikroskopi och histologi för att bestämma de bästa parametrarna för en exklusiv avskildhet av hornhinnans endotel celler (CEC) med minsta indirekta skador. Fördelarna med denna metod är den exakta ablation av CEC, minskad oavsiktlig skada, och framför allt, den beröringsfria behandlingen.
Introduction
Insyn i hornhinnan är viktigt för överföring av ljus till näthinnan och dess fotoreceptorer1. I detta avseende är ett relativt tillstånd av uttorkning avgörande för att hålla kollagenfibrerna inom hornhinnans stroma korrekt anpassade. Denna homeostas underhålls av hornhinnans endotelceller (CEC) som ligger på Descemets membran (DM)2. Endotel är det innersta hornhinnans skikt. Den har en viktig barriär och pump funktion, vilket är avgörande för hornhinnans öppenhet3. I motsats till epitelet kan endotelet inteförnyas 4. Därför stimulerar alla cellskador orsakade av sjukdom eller trauma de återstående endotelcellerna att förstora och migrera, för att täcka resulterande defekter och för att bibehålla hornhinnans funktionalitet5. Men om CEC densitet faller under en kritisk tröskel, decompensation av endotel leder till ett ödem, vilket resulterar i dimsyn och obehag eller till och med svår smärta4. Trots tillgången på läkemedel för att lindra symtom, för närvarande den enda slutgiltiga behandlingen i dessa fall är hornhinnans transplantation, som kan utföras i form av en full-tjocklek moderplantor eller en lamellar endotel transplantation. Det senare förfarandet finns som Descemets membran endotel keratoplasty (DMEK) samt Descemets strippning automatiserad endotel keratoplasty (DSAEK)6. Skyddet av återstående cec och öka deras överlevnad kan dock vara ett alternativt mål, som behöver en adekvat sjukdomsmodell för att testa potentiella terapeutiska läkemedel.
Nuvarande CEC förlust sjukdom modeller fokuserar på förstörelsen av endotel genom injektion av giftiga ämnen (t.ex. bensalkoniumklorid) i den främre kammaren eller genom mekanisk nötning av cellerna med hjälp av en invasiv descemetorhexis teknik7,,8. Även om dessa modeller är väl etablerade, nackdelar såsom allmän inflammatorisk reaktion och oprecisa indirekta skador finns. Därför är dessa modeller mer benägna att representera slutskedet av sjukdomen, när de ovan nämnda kirurgiska alternativen är oundvikliga.
Med framsteg inom cellulära behandlingsstrategier såsom stamceller och genterapi, tillämpningen av dessa cellulära terapier kan vara användbart i ett tidigt skede av CEC förlust9. Därefter behöver vi en modell som representerar dessa tidigare stadier av sjukdomen på ett mer adekvat sätt. I detta avseende, cellodling modeller har förbättrats under det senaste decenniet, men är fortfarande begränsade i sin giltighet, som celler in vitro kan inte komma i närheten av att replikera de komplexa interaktioner som uppstår mellan de olika celltyperna inom hornhinnan10. Därför är ex vivo- och in vivo-sjukdomsmodeller fortfarande i hög efterfrågan och att förbättra de befintliga är av yttersta intresse.
Noninvasive, intraokulär kirurgi genom fotosubkultion med hjälp av en neodym: YAG (Nd: YAG) laser har blivit ett rutinförfarande för ögonläkare över hela världen sedan introduktionen i slutet av 1970-talet11. Fotodisruption bygger på ickelinjär ljusabsorption som leder till bildandet av plasma, generering av akustiska chockvågor och skapande av kavitationsbubblor, när applikationsstället är beläget i en flytande miljö12. I allmänhet bidrar dessa processer till den avsedda effekten av exakt vävnadsskärning. Men de kan också vara källan till onödiga indirekta skador som begränsar den lokala inneslutning av laserkirurgi13.
Förutsägelsen av resulterande mekaniska effekter har förbättrats avsevärt genom karakterisering av chockvågens förökning och kavitationskurs. Det är vårt mål att rikta CEC med så lite skada på omgivande vävnad som möjligt för att ge en noninvasive, laser-assisted experimentell sjukdom modell för de tidiga stadierna av CEC förlust. För detta ändamål är det nödvändigt att bestämma de optimala pulsenergierna och positionerna för laserns fokalfläckar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla försök som involverar djurvävnad följer den lokala djurvårds- och etikkommitténs riktlinjer.
1. Beredning av organkultur och laserbehandling
- Få nyutbildade svinögon från det lokala slakteriet. Håll dem svala (4 °C) i Dulbecco modifierade Eagle medium (DMEM) med hög glukos, kompletterad med L-glutamin, natriumpyruvat, penicillin/streptomycin (1%), och svin serum (10%), hädanefter kallas i denna artikel som fullt medium.
- Ta bort extracellulära vävnader med sax och blöta ögonen i 5% povidone-jod oftalmisk lösning i 5 min innan du placerar dem i steriliserad fosfat-buffrad saltlösning (PBS) tills användning.
- Skärmögon för stora främre segment patologier, såsom hornhinnans ärrbildning, ödem, och andra opaciteter med en spektral-domän optisk koherens tomografi enhet (Tabell av material).
- Placera ögonen framför en slitslampa som är utrustad med en Nd:YAG-laser (Table of Materials), som har en våglängd på 1 064 nm och en fokalpunktsdiameter på 10 μm i luft.
OBS: För optimal placering används en 3D-tryckt anläggningsapparat, som var utformad för att hålla ögonföretaget, utan att sätta för mycket press på den (figur 1). - Använd en förstoring på 12x och avleda belysningen för att visualisera de enskilda hornhinnans lager.
- Ställ in pulsenergin (t.ex. 1,6 mJ) och fokuspunkten (t.ex. 0,16 mm) för selektiv ablation av endotelceller.
- Placera en klar hornhinnan paracentesis nära limbus och injicera viskoelastisk (Tabell av material) för att stabilisera den främre kammaren.
- Punktskatt den laserbehandlade centrala hornhinnan med en 8 mm trephine.
- Placera den strukna hornhinnan i en brunn av en 12-brunnsplatta med endotelplatsen vänd uppåt och inkubera provet i 3 ml fullt medium vid 37 °C i upp till 3 dagar.
OBS: Potentiella cytoprotekiva medel kan läggas till mediet under detta steg.
2. Förberedelse för histologi
- Förbered Sörensens buffert med ett pH-kort på 7,4 innehållande 19,6 ml 133 mM KH2PO4 och 80,4 ml 133 mM Na2HPO4.
- Ta bort mediet från hornhinnan-innehållande brunnen och fixera vävnaden i 20 min vid rumstemperatur (RT) med metanolfri paraformaldehyd (4%) i Sörensens buffert.
- Placera vävnad i 20% sackaros i PBS tills vävnaden sjunker (1 h) och sedan i 30% sackaros i PBS över natten på RT. Var noga med att undvika kontakt med bubblor och luftytans gränssnitt. Bädda in vävnad i optimal skärtemperatur (OCT) förening och förvara på -80 °C.
- Skär sektionerna 10 μm tjockt med en kryostat vid -27 °C.
OBS: En kamel hårborste är användbart för att styra den framväxande delen över knivbladet. - Överför avsnittet till en mikroskoprutschbana genom att vidröra bilden till vävnaden inom 1 min efter att du klippt den för att undvika frystorkning av vävnaden. Förvara rutschbanorna vid -80 °C.
3. Hematoxylin och eosin (H&E) färgning
- Lufttorka sektioner i flera minuter för att avlägsna fukt.
- Betsa med filtrerad 0,1% Mayers hematoxylin i 10 min i ett 50 ml-rör.
- I en Coplin burk, skölj i sval kör ddH2O i 5 min och doppa i 0,5% eosin 10x.
- Doppa i ddH2O tills eosin slutar strimmor och sedan doppa i 50% (10x) samt 70% (10x) EtOH.
- Jämvikt i 95% EtOH (30 s) och 100% EtOH (60 s) innan doppning i xylen flera gånger.
- Montera och täck provexemplaret innan du tar bilder med hjälp av ett ljusmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hjälp av det förfarande som presenteras här behandlade vi ögon med en Nd:YAG-laser, utvärderar olika pulsenergier (1,0−4,6 mJ) och positioner av kontaktpunkter (avstånd från hornhinnans bakre yta: 0,0−0,2 mm) för att hitta de optimala parametrarna. Flera replikat (n = 3) utvärderades för varje konstellation av laserparametrarna (12 x 21).
Förutom ovanstående protokoll analyserades exemplaret med ett tvåfotonmikroskop före fixering och H&E-färgning. Den två-foton mikroskop används en solid-state, läge-låst 80 MHz Ti: safir laser med en tuning intervall på 690−1b040 nm och en genomsnittlig lasereffekt på > 900 mW vid 800 nm som ljuskälla. Det levererade pulserar med en bredd av ungefärligt 150 FS till ta prov. Bilder togs med ett mikroskop mål (20x/0.95) vid en våglängd av 730 nm och 30 mW laser effekt.
Två foton och ljusmikroskopi bilder granskades oberoende av 3 granskare, som var förblindade till experimentella inställningar och var tvungna att tilldela bilderna till tre kategorier: (1) ingen skada, (2) för mycket skada, eller (3) rätt mängd skada (figur 2 och figur 3). På grundval av utvärderingen av dem beräknades en värmekarta (figur 4). Med hjälp av denna heatmap är det möjligt att välja rätt konstellation av laserparametrar för att selektivt ablate CEC med minimal skada på omgivande vävnad (grön). Resultaten visar att laserns brännpunkt måste vara minst 0,15 mm bakom hornhinnans endotel för den lägsta pulsenergin (1,0 mJ) som testats. För pulsenergier som är högre än 2,9 mJ är det längsta brännvidd som provas (0,2 mm) fortfarande för nära endotel.
Figur 1: Experimentell inställning. AA) Ögonen fixerades i en delvis 3D-tryckt anläggningsapparat, vilket möjliggjorde exakt anpassning med avseende på laserstrålen. (B) Före laserbehandling utvärderades vävnaden med ett främre segment optisk koherens tomografi enhet för att kontrollera om stora främre segment patologier. Brännlaserpunkternas positioner anges med exemplarisk för 0,0 mm (svart asterisk), 0,1 mm (röd asterisk) och 0,2 mm (blå asterisk). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Tvåfotonmikroskopi. Resultaten varierade från inga skador alls (A), omfattande oavsiktlig skada (B) till selektiv ablation av endotelceller (C). Den röda pilspetsen visar en brusten Descemets membran, och gröna pilspetsar indikerar selektiv ablation av CEC-kluster. Skala bar = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Histologi. Hematoxylin och eosinfärgning bekräftade att skadorna inte alls kommer från någon skada (A), omfattande oavsiktlig skada (B) till selektiv ablation av endotelceller (C). Den röda pilspetsen visar en brusten Descemets membran, och gröna pilspetsar indikerar selektiv ablation av CEC-kluster. Skala bar = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: En värmekarta som visar sannolikheten för selektiv CEC-skada. I detta avseende måste pulsenergin och nd:YAG-laserns brännpunkt beaktas. Överdriven skada visas i rött, och den önskade delen av skadan visas i grönt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Resultaten av denna pilotstudie visar att en Nd:YAG-laser kan användas för att selektivt ablate hornhinnans endotelceller när lämpliga parametrar för energidos och fokuspunktsposition väljs.
Eftersom endotelfunktionen är viktig för hornhinnans öppenhet och skydda hornhinnan från stromal ödem, modeller av endotel dysfunktion spelar en viktig roll i utvecklingen av anti-edematous läkemedel eller kirurgiska ingrepp. Det finns flera etablerade in vitro-modeller för att härma in vivo situationen10,14,15, men som allmänt känt, in vitro-modeller kan inte helt imitera påverkan av enzymer och cytokiner eller effekten av cell-cell-interaktion. Däremot erbjuder denna nyutvecklade ex vivo modell av endotel cell förlust möjlighet att övervaka olika tillstånd av sjukdomen och hornhinnans decompensation i den naturliga miljön.
Eftersom hornhinnan i vår modell är strukits med en trephine efter laserförfarandet, fysiologi hornhinnan förändringar och liknar in vitro-situationen, regionala interaktioner hämmas avsevärt. Det lokala gränssnittet förblir dock intakt och särskilt den cellulära kommunikationen till andra celler i hornhinnan kvarstår. Vår studie visade att under dessa omständigheter hornhinnan behåller sin funktion i tre dagar i kultur, vilket ger tillräckligt med tid att observera och utvärdera potentiella terapeutiska medel. Å andra sidan kan lång tid läkningsprocesser inte undersökas.
I vår modell använde vi svinögon eftersom större mängder av dessa lätt kan erhållas. Dessutom, svin ögon härma mänskliga ögon mycket väl. I motsats till kaniner som regelbundet används för experiment, svin ögon har en Bowman membran. Ändå skiljer sig hornhinnans tjocklek på svin ögat avsevärt från det mänskliga ögat. I synnerhet är svin stroma mycket tjockare och det finns ingen skillnad mellan centrala och perifera tjocklek i svin hornhinnor16. Det måste också anses att mänskliga CEC inte har någon helande förmåga medan denna regenerativa funktionen rapporteras i vissa djur, såsom grisar och kaniner17,18. Vår studie fokuserade inte på sårläkningsprocesser, men denna skillnad bör hållas i åtanke när man översätter resultat. Eftersom sårläkningen av djurcessa inte överstiger fyra dagar, kan det fortfarande observeras i våra odlade vävnader även om de bara varar i tre dagar.
Jämföra våra experimentella setup med tidigare studier, tillämpade energinivåer var liknande19. Istället för att bara fokusera på endotel, olika platser av kontaktpunkter utvärderades. Därför är den största skillnaden i vår inställning till tidigare studier dess potential att inducera specifika endotelskador utan att skada antingen DM eller stromal vävnad. Noggrann övervakning av energidos och fokusposition möjliggör selektiv CEC ablation utan att orsaka chockvågsskador på andra delar av hornhinnan. Dessutom har vi inte märkt stromal eller subepithelial ödem direkt efter laserbehandling20.
En tidigare studie visade att temperaturer på ~40 °C kan leda till CEC-skada21. Vi har inte mäta den inducerade temperaturen, men det kan vara av intresse för ytterligare studier. Dessutom bör effekten av olika typer av lasersystem utvärderas. Tidigare studier visade en skillnad mellan laserinducerad begränsad CEC skador och andra CEC skador19,22. Detta kan också begränsa jämförbarheten till mänsklig vävnad och sjukdomar eftersom laserinducerad skada verkar följas av olika sjukdomsutvecklingsprocesser. Intressant nog sårläkning efter laser ansökan stannade vid den brända DM i tidigare studier19. Skadekällan kan vara mindre viktig om DM förblir intakt.
Högre energinivåer kan innebära en högre risk för förlängd skada22. Våra resultat visar att det krävs ett snävare fokusområde med högre energinivåer (<2,9 mJ) för selektiv CEC-skada. Medan skadan på CEC tillämpades mekaniskt i tidigare studier17,laser-inducerad skada som används här har en mer exakt dosering av lesion och kan lätt användas i in vivo studier.
Det bör noteras att endast ett litet antal ögon har behandlats och undersökts enligt detta protokoll. Som nämnts ovan kan det finnas skillnader mellan olika djurarter och skillnader mellan hornhinnor hos olika djurarter. Eftersom CEC-skador kan produceras vid olika brännvidd bör vissa trösklar inte överskridas för att undvika förlängd skada.
Slutligen placerades de skador som genereras i denna studie i den centrala delen. En tidigare studie av svin ögon visade accelererad sårläkning i hornhinnans periferi, vilket kan bero på dess närhet till limbala stamceller17 som hornhinnans tjocklek i svin ögon inte skiljer sig mellan regioner. Det bör i framtida studier utvärderas om laserparametrar ska justeras vid byte från mitten av hornhinnan till periferin.
Sammanfattningsvis introducerar vår studie en noninvasive modell för ytterligare undersökningar om CEC dysfunktion. Begränsningar av ex vivo- eller in vivo-studier i form av användning av djur i stället för mänsklig vävnad kvarstår och måste beaktas vid tolkningen av resultaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Christine Örün och Jan A. M. Sochurek för deras hjälp med experimentella metoder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BARRON VACUUM TREPHINE | Katena | K20-2058 | |
| Cryostat | Leica | CM 3050S | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose | PAA | E-15009 | |
| Eye holder | Self | N/A | |
| Inverted Microscope | Leica | DMI 6000 B | |
| KH2PO4 | Merck | 529568 | |
| Na2HPO4 | Merck | 1065860500 | |
| Nd:YAG laser | Zeiss Meditec | visuLAS YAG II plus | |
| OCT Tissue Tek | Sakura Finetechnical | 4583 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010056 | |
| Porcine serum | Sigma-Aldrich | 12736C | |
| Spectral-domain optical coherence tomograph | Heidelberg Engineering | Spectralis | |
| Tissue culture plate 12-well | Sarstedt | 833921 | |
| Two-Photon Microscope | JenLab | DermaInspect | |
| Viscoelastic | OmniVision | Methocel |
References
- DelMonte, D. W., Kim, T.
- Edelhauser, H. F. The balance between corneal transparency and edema: the Proctor Lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (5), 1754-1767 (2006).
- Tuft, S. J., Coster, D. J.
- Bourne, W. M. Biology of the corneal endothelium in health and disease. Eye. 17, 912-918 (2003).
- He, Z., et al. 3D map of the human corneal endothelial cell. Scientific Reports. 6, 29047 (2016).
- Gain, P., et al. Global Survey of Corneal Transplantation and Eye Banking. JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).
- Schwartzkopff, J., Bredow, L., Mahlenbrey, S., Boehringer, D., Reinhard, T. Regeneration of corneal endothelium following complete endothelial cell loss in rat keratoplasty. Molecular Vision. 16, 2368-2375 (2010).
- Bredow, L., Schwartzkopff, J., Reinhard, T. Regeneration of corneal endothelial cells following keratoplasty in rats with bullous keratopathy. Molecular Vision. 20, 683-690 (2014).
- Bartakova, A., Kunzevitzky, N. J., Goldberg, J. L. Regenerative Cell Therapy for Corneal Endothelium. Current Ophthalmology Reports. 2 (3), 81-90 (2014).
- Zhao, B., et al. Development of a three-dimensional organ culture model for corneal wound healing and corneal transplantation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (7), 2840-2846 (2006).
- Aron-Rosa, D., Aron, J. J., Griesemann, M., Thyzel, R. Use of the neodymium-YAG laser to open the posterior capsule after lens implant surgery: a preliminary report. Journal - American Intra-Ocular Implant Society. 6 (4), 352-354 (1980).
- Vogel, A., Hentschel, W., Holzfuss, J., Lauterborn, W. Cavitation bubble dynamics and acoustic transient generation in ocular surgery with pulsed neodymium: YAG lasers. Ophthalmology. 93 (10), 1259-1269 (1986).
- Vogel, A., Schweiger, P., Frieser, A., Asiyo, M. N., Birngruber, R. Intraocular Nd:YAG laser surgery: laser-tissue interaction, damage range, and reduction of collateral effects. IEEE Journal of Quantum Electronics. 26 (12), 2240-2260 (1990).
- Zhu, Q., Zhu, Y., Tighe, S., Liu, Y., Hu, M. Engineering of Human Corneal Endothelial Cells In Vitro. International Journal of Medical Sciences. 16 (4), 507-512 (2019).
- Li, Z., et al. Nicotinamide inhibits corneal endothelial mesenchymal transition and accelerates wound healing. Experimental Eye Research. 184, 227-233 (2019).
- Pescina, S., et al. Development of a convenient ex vivo model for the study of the transcorneal permeation of drugs: histological and permeability evaluation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (1), 63-71 (2015).
- Smeringaiova, I., et al. Endothelial Wound Repair of the Organ-Cultured Porcine Corneas. Current Eye Research. 43 (7), 856-865 (2018).
- Yamashita, K., et al. A Rabbit Corneal Endothelial Dysfunction Model Using Endothelial-Mesenchymal Transformed Cells. Scientific Reports. 8 (1), 16868 (2018).
- Schubert, H. D., Trokel, S. Endothelial repair following Nd:YAG laser injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (8), 971-976 (1984).
- Zhang, W., et al. Rabbit Model of Corneal Endothelial Injury Established Using the Nd: YAG Laser. Cornea. 36 (10), 1274-1281 (2017).
- McCally, R. L., Bonney-Ray, J., de la Cruz, Z., Green, W. R. Corneal endothelial injury thresholds for exposures to 1.54 micro m radiation. Health Physics. 92 (3), 205-211 (2007).
- Nash, J. P., Wickham, M. G., Binder, P. S. Corneal damage following focal laser intervention. Experimental Eye Research. 26 (6), 641-650 (1978).
