Summary
Vi utvecklade ett enkelt flöde cytometri analys för att utvärdera bindningen av PD-1-blockerande antikroppar till T-celler, kräver endast en droppe perifert blod från cancerpatienter.
Abstract
Immun checkpointhämmare, inklusive PD-1-blockerande antikroppar, har avsevärt förbättrat behandlingsresultaten i olika typer av cancer. Den farmakologiska effekten av dessa immunterapier är långvarig, som sträcker sig även utöver utsättningen av deras injektioner, på grund av ihållande blodkoncentrationer. Här utvecklade vi en enkel flödescytometrianalys för att utvärdera T-cellbindningsstatusen för PD-1-blockerande antikroppar nivolumab och pembrolizumab. Som ett glukostest kräver denna analys bara en enda droppe perifert blod. Visualisera antikroppsbindning på T-celler är mer tillförlitlig än att mäta antikroppsblodkoncentrationer. Dessutom, om nödvändigt, kan vi potentiellt analysera många särskiljande immunrelaterade markörer på T-celler bundna till PD-1-blockerande antikroppar. Således är detta en enkel och minimalt invasiv strategi för att analysera den farmakologiska effekten av PD-1-blockerande antikroppar hos cancerpatienter.
Introduction
PD-1-blockerande antikroppar har blivit standardvalet för behandling av olika typer av cancer, inklusive icke-småcellig lungcancer (NSCLC)1,2,3,4. De visar en anmärkningsvärd terapeutisk effekt i en delmängd av cancerpatienter som inte har svarat på konventionella cytotoxiska kemoterapier. Immuncheckpointhämmare (ICI), som inkluderar PD-1-blockerande antikroppar, kan dock orsaka ett unikt och distinkt spektrum av biverkningar, så kallade immunrelaterade biverkningar (irA)5. Även om irAEs kan påverka nästan alla vävnader, de är oftast observeras i mag-tarmkanalen, endokrina körtlar, hud och lever, och de kan orsaka klåda, hudutslag, illamående, diarré, och sköldkörtelrubbningar6,7. I allmänhet uppträder de flesta irAE inom 1 till 2 månader efter det att Icis har inletts. I vissa fall kan de dock förekomma senare än 1 år efter behandlingsbörjan eller till och med efter avslutad behandling6,7. De orsakar också olika symtom som kan vara svåra att diskriminera från andra patologier. Det kan därför vara en utmaning att snabbt diagnostisera irAEs och behandla dem på lämpligt sätt. irAEs kan påverka alla vävnader, och deras debut påverkas starkt av cirkulerande immunceller, särskilt T-celler bundna till PD-1-blockerande antikroppar. Därför är en enkel och minimalt invasiv metod för att övervaka antikroppsriktade T-celler viktigt i kliniska miljöer.
Här utvecklade vi en enkel metod för att bedöma bindningen av PD-1-blockerande antikroppar mot T-celler med hjälp av en droppe perifert helblod från cancerpatienter som fick nivolumab eller pembrolizumab. Med hjälp av detta tillvägagångssätt kunde vi övervaka varoch en av följande: 1) varaktigheten av antikroppar bindning till T-celler, 2) beläggningen av T-cell PD-1 molekyler av terapeutiska antikroppar, och 3) aktiveringstatus och immunologiska funktioner av T-celler. Denna metod är en ändring av en tidigare rapporterad teknik8. Mängden blod som krävs är nästan densamma som det som behövs för ett glukostest, och metoden kräver inte mononukleär cellanrikning eller samodling med PD-1-blockerande antikroppar. Vi bekräftade att denna metod också kan utföras med frysta prover, inklusive perifert blod mononukleära celler (PBMCs) och celler från pleura-effusion, perikardvätska effusion, bronchoalveolar lavage vätska, och ryggmärgsvätskan, vilket tyder på att denna strategi kan vara användbar i samband med en multicenter studie. Denna metod kan underlätta tidig diagnos av irAEs, och även bidra till att bestämma lämpliga immunsuppressiva behandlingar för att kontrollera sina symtom och att identifiera de optimala tiderna för att initiera efterföljande behandlingar efter PD-1-hämmare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Provtagning utfördes under rutinmässiga kliniska förfaranden. Alla mänskliga prover erhölls efter informerat samtycke, i enlighet med Helsingfors förklaring och med godkännande av den etiska granskningsnämnden vid Forskarskolan för medicin, Osakauniversitet, Japan (15383 och 752).
1. Beredning och färgning av helblodsprov
- Samla in helblodprover i bloduppsamlingsrör som innehåller etendiamintetraättiksyra (EDTA).
OBS: Blodinsamling kan utföras med antingen en vanlig nål eller en blodlansett. - Överför 20 μl helblodprov till 5 ml rundbottenspolystyrenflödescytometrirör.
OBS: För att minska icke-specifik bindning av celler till rör tillsätts 1 ml 2% fetalt nötkreatursserum (FBS) i fosfatbuffrad salin (PBS) i rör och virvelrad i 10 s före applicering på prover. - Tillsätt 20 μL 2% FBS i PBS.
- Tillsätt 10 μL av humanspecifikt FcR-blockerande reagens. Blanda väl och inkubera i 15 min vid rumstemperatur.
- Tillsätt 500 μL rödblodslysbuffert. Blanda väl och inkubera i 10 min vid rumstemperatur.
- Tillsätt 4 ml 2 % FBS i PBS och snurra ner celler vid 400 x g (1 500 rpm) i 5 min vid 4 °C. Ta bort supernatant genom aspiration.
- Upprepa tvätt- och aspirationsprocessen som beskrivs i steg 1.6.
- Återhängceller i 100 μL på 2% FBS i PBS och dela upp i två rör av 50 μL vardera.
- Tillsätt ytmarkörantikroppar (tabell 1). Blanda väl och inkubera i 20 min vid rumstemperatur i mörkret.
OBS: Vid profilering av T-cellens immunstatus kan antalet markörer ökas baserat på kvaliteten på flödescytometrimaskinen. - Tvätta proverna 2x enligt beskrivningen i steg 1.6.
- Omblanda celler i 200 μL på 2% FBS i PBS.
2. Flödecytometrisk analys
- Sätt in rören i flödescytometern och hämta celler, i princip efter det rekommenderade protokollet9.
- Spela in 10.000 händelser som lymfocyt grind (Figur 1A) och exportera flödesdata som .fcs filer för analys.
- Öppna filer i analysprogrammet. Visualisera cellerna på en framåt scatter (FSC) (A) vs. side scatter (SSC) (A) tomt och gate lymfocyter (figur 1A).
- När du har valt enstaka celler med FSC (H) vs FSC (W) och SSC (H) jämfört med SSC (W) (figur 1B) och visar dem på en CD3 vs CD8 eller CD3-tomt, utfärda CD8 T-cellerna respektive CD4 T-celler (figur 1C).
- När du har valt de gated cellerna och visat dem på en PD-1 vs. human IgG4-tomt, identifiera PD-1-blockerande antikroppar-bundna CD8 och CD4 T celler baserat på isotyp kontroll (Figur 1D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gating-strategin och flödescytometrianalysen (figur 1) kan upptäcka PD-1-blockerande antikroppsbindning till T-celler som erhålls från en droppe perifert subandeblod från NSCLC-patienten. Innan PD-1-blockerande antikroppar administreras finns inga humana IgG4-positiva CD8- eller CD4 T-celler och PD-1-uttryck kan bekräftas av ett PD-1-detekteringsantikroppar (EH12.1)(figur 2A). Efter administrering av nivolumab eller pembrolizumab kan IgG4 (nivolumab, pembrolizumab) påT-celler av anti-IgG4-antikroppar (HP6025) medan PD-1-detektrande antikroppar EH12.1 inte känner igen någon PD-1 på T-celler eftersom terapeutiska PD-1-antikroppar stör EH12.1-bindningen. Detta innebär att vi indirekt mäter den terapeutiska bindningen av PD-1-blockerande antikroppar baserat på bristen på bindning av PD-1-detektrande antikroppar. Representativa data visar de olika bindningsstatuserna för PD-1-blockerande antikroppar (figur 2A). Nivolumab och pembrolizumab bindning och beläggning av PD-1 på T-celler minskar över tid10, och det finns partiell bindning (PB), som visas i dubbelpositivt område, och slutligen fullständig förlust av bindning (LB)(figur 2B).
Figur 1: Representativ strategi för att utvärdera PD-1-blockerande antikroppsbindning till T-celler från en droppe perifert blod. (A) FSC (A) vs SSC (A) tomt och gating av lymfocyter. (B) Dubpar är undantagna genom att dra grindar runt huvudcellpopulationen på områden i FSC (H) vs FSC (W) och SSC (H) jämfört med SSC (W). (CCd3 vs CD8 tomt (övre) och CD3 vs CD4 tomt (lägre) och gating av CD8 T-celler och CD4 T-celler, respektive. (DPD-1 vs. humanT IgG4-diagram och detektering av bindningen av nivolumab (en PD-1-blockerande antikropp) till CD8- och CD4 T-celler. Orange prickar och svarta prickar indikerar anti-IgG4 antikropp och isotyp kontroll färgning, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Analys av representativflödescytometri som anger ändringen av bindningsstatusen för PD-1-blockerande antikroppar. (A)Färgning av PD-1 och humant IgG4 i CD8 T-celler från ICI-förbehandlat patientblod utvärderades med flödescytometri (vänster). Tio mikroliter förbehandlat blod behandlades med seriell utspädning av nivolumab i 15 min och steg 1,4 till 1,10 i protokollet slutfördes. Fullständig bindning (CB) (röd), partiell bindning (PB) (blå) och förlust av bindning (LB) (grön) definieras av de angivna grindarna. (B) Statusen för PD-1-blockerande antikroppsbindning till CD8 T-celler analyserades vid uppföljningspunkterna, som anges, hos NSCLC-patienter som avbröt nivolumab och pembrolizumab. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Pe | Bv421 (på 1990-år) | PE-Cy7 (på 1960-) | APC-Cy7 (olika) | BV510 (på 1990) | |
| Bindande utvärdering | IgG4 (på 1960-) | CD3 (CD3) | PD-1 (PD-1) | CD4 (CD4) | CD8 (cd8) |
| Isotyp kontroll | Isotyp kontroll | CD3 (CD3) | Isotyp kontroll | CD4 (CD4) | CD8 (cd8) |
Tabell 1: Antikroppar som används i flödescytometrisk analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I den här artikeln rapporterar vi en metod med hjälp av en flödescytometer för att upptäcka PD-1-blockerande antikroppar bundna till T-celler som härrör från en droppe perifert blod, som vi ursprungligen utvecklade för nivolumab detektering10. Även om denna teknik är mycket enkel och lätt att utföra, bör två viktiga punkter noteras för att få korrekta resultat. En är att för att upptäcka PD-1 molekyler, en lämplig antikropp som konkurrerar med nivolumab och pembrolizumab bör användas. Detta problem utvärderades i en tidigare studie11. Den andra är att RBC lys ska utföras noggrant före ytfärgning. Så länge en isotypkontroll har upprättats för varje analys för att bestämma porten till Det IgG4-positiva klustret påverkas inte frekvensen. Men med detta protokoll, när RBC lys är otillräcklig kan det finnas minskningar av både T-cellantal i lymfocyt porten och av intensiteten i varje yta markör. Dessutom måste RBC lys-steget utföras före ytfärgning, annars fungerar inte anti-IgG4-antikroppen (HP6025) korrekt.
Begränsningen av denna metod är att populationen av T-celler som är bundna till PD-1-blockerande antikroppar omfattar specifika T-cellkloner som ansvarar för terapeutiska effekter och iras. Frekvenserna för dessa specifika kloner bland den antikroppsbundna populationen är dock ganska låga. Därför måste vi fortfarande berika det specifika målet med hjälp av vissa markörer, till exempel CD3912. En annan begränsning är att Fluorescensintensiteten i IgG4 inte är hög i vissa fall, vilket gör det svårt att fastställa bindningsstatus (dvs. PB och LB).
Andra studier har övervakat terapeutiska PD-1 antikroppar i blodet för att utvärdera farmakokinetik. Det är viktigt att mäta plasmakoncentrationen av nivolumab eller pembrolizumab för att avgöra hur restmängden av dessa antikroppar i blodet korrelerar med tiden. Vi har dock tidigare rapporterat att koncentrationen av nivolumab inte helt korrelerar med kvarstående bindning till T-celler10. Jämfört med mätningen av plasmaantikroppskoncentration13kan vår metod vara lämpligare för att utvärdera den kvarstående bindningen av antikroppar mot PD-1 till T-celler. Den ursprungliga metoden för övervakning av nivolumab bindning till T-celler i blodet krävs inkubation med fluorescensmärkt nivolumab8. Vi förenklade detta tillvägagångssätt och lyckades avsevärt minska analysen tid och mängden blod som behövs för analys.
Frysta celler kan också analyseras med hjälp av denna analys, vilket tyder på att denna metod är en bra passform för multicenter studier. Nyttan med detta tillvägagångssätt kommer att förbättras ytterligare genom att övervakningen svara med andra immunologiska markörer, såsom Ki-67, av T-celler som är bundna till PD-1-blockerande antikroppar10. Framtida studier bör använda vår metod tillsammans med encelliga RNA-sekvensering och T-cellsreceptorsekvensering för att försöka identifiera och karakterisera de specifika undergrupperna av T-celler som är bundna till PD-1-blockerande antikroppar och som ansvarar för irAEs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av bidrag till S.K. från Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI (JP17K16045) och Japan Agency for Medical Research and Development (JP18cm0106335 och 19cm0106310).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X RBC Lysis Buffer (Multi-species) | Thermo Fisher Scientific | 00-4300-54 | 50 mL |
| APC/Cyanine7 anti-human CD4 Antibody | BioLegend | 300518 | Clone RPA-T4 |
| BD FACS Canto II Flow Cytometer | BD | ||
| Brilliant Violet 510 anti-human CD8a Antibody | BioLegend | 301048 | Clone RPA-T8 |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | nacalai tesque | 14249-95 | 500 mL |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes | STEMCELL Technologies | 352058 | 5 mL |
| FcR Blocking Reagent, human | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | 2 mL |
| FLOWJO | BD | ||
| Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 12676029 | 500 mL |
| Mouse IgG1 monoclonal - Isotype control | abcam | ab81200 | |
| Mouse monoclonal Anti-Human IgG4 Fc | abcam | ab99825 | Clone HP6025 |
| Pacific Blue Mouse Anti-Human CD3 | BD | 558117 | Clone UCHT1 |
| PE-Cy7 Mouse anti-Human CD279 (PD-1) | BD | 561272 | Clone EH12.1 |
| PE-Cy7 Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD | 557646 |
References
- Gong, J., Chehrazi-Raffle, A., Reddi, S., Salgia, R. Development of PD-1 and PD-L1 inhibitors as a form of cancer immunotherapy: a comprehensive review of registration trials and future considerations. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 6 (1), 8 (2018).
- Borghaei, H., et al. Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 373 (17), 1627-1639 (2015).
- Brahmer, J., et al. Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Squamous-Cell Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 373 (2), 123-135 (2015).
- Herbst, R. S., et al. Pembrolizumab versus docetaxel for previously treated, PD-L1-positive, advanced non-small-cell lung cancer (KEYNOTE-010): a randomised controlled trial. The Lancet. 387 (10027), 1540-1550 (2016).
- Postow, M. A., Sidlow, R., Hellmann, M. D. Immune-Related Adverse Events Associated with Immune Checkpoint Blockade. The New England Journal of Medicine. 378 (2), 158-168 (2018).
- Weber, J. S., et al. Safety Profile of Nivolumab Monotherapy: A Pooled Analysis of Patients With Advanced Melanoma. Journal of Clinical Oncology. 35 (7), 785-792 (2017).
- Champiat, S., et al. Management of immune checkpoint blockade dysimmune toxicities: a collaborative position paper. Annals of Oncology. 27 (4), 559-574 (2016).
- Brahmer, J. R., et al. Phase I study of single-agent anti-programmed death-1 (MDX-1106) in refractory solid tumors: safety, clinical activity, pharmacodynamics, and immunologic correlates. Journal of Clinical Oncology. 28 (19), 3167-3175 (2010).
- Bommareddy, P. K., Lowe, D. B., Kaufman, H. L., Rabkin, S. D., Saha, D. Multi-parametric flow cytometry staining procedure for analyzing tumor-infiltrating immune cells following oncolytic herpes simplex virus immunotherapy in intracranial glioblastoma. Journal of Biological Methods. 6 (2), 112 (2019).
- Osa, A., et al. Clinical implications of monitoring nivolumab immunokinetics in non-small cell lung cancer patients. JCI Insight. 3 (19), 59125 (2018).
- Zelba, H., et al. Accurate quantification of T-cells expressing PD-1 in patients on anti-PD-1 immunotherapy. Cancer Immunology, Immunotherapy. 67 (12), 1845-1851 (2018).
- Simoni, Y., et al. Bystander CD8(+) T cells are abundant and phenotypically distinct in human tumour infiltrates. Nature. 557 (7706), 575-579 (2018).
- Chiu, H. H., et al. Development of a general method for quantifying IgG-based therapeutic monoclonal antibodies in human plasma using protein G purification coupled with a two internal standard calibration strategy using LC-MS/MS. Analytica Chimica Acta. 1019, 93-102 (2018).
