Summary
Vi udviklede en simpel flow cytometri analyse til evaluering af bindingen af PD-1-blokerende antistoffer mod T-celler, der kræver kun en dråbe perifert blod fra kræftpatienter.
Abstract
Immune checkpoint hæmmere, herunder PD-1-blokerende antistoffer, har væsentligt forbedret behandlingsresultater i forskellige typer af kræft. Den farmakologiske virkning af disse immunterapier er langvarig og strækker sig selv ud over seponering af injektionerne på grund af vedvarende blodkoncentrationer. Her udviklede vi en simpel flow cytometri analyse til at evaluere T celle bindende status af PD-1-blokerende antistoffer nivolumab og pembrolizumab. Ligesom en glukosetest, denne analyse kræver blot en enkelt dråbe perifert blod. Visualisere antistofbinding på T-celler er mere pålidelig end måling af antistofblodkoncentrationer. Desuden, hvis det er nødvendigt, kan vi potentielt analysere mange karakteristiske immun-relaterede markører på T-celler bundet til PD-1-blokerende antistoffer. Således, Dette er en enkel og minimalt invasiv strategi for at analysere den farmakologiske virkning af PD-1-blokerende antistoffer hos kræftpatienter.
Introduction
PD-1-blokerende antistoffer er blevet standard valg til behandling af forskellige typer af kræft, herunder ikke-småcellet lungekræft (NSCLC)1,2,3,4. De viser en bemærkelsesværdig terapeutisk effekt i en delmængde af kræftpatienter, der ikke har reageret på konventionelle cytotoksiske kemoterapier. Immun checkpoint hæmmere (ICI' er), som omfatter PD-1-blokerende antistoffer, kan dog forårsage et unikt og særskilt spektrum af bivirkninger, såkaldte immunrelaterede bivirkninger (IrAEs)5. Selv irAEs kan påvirke næsten alle væv, de er mest almindeligt observeret i mave-tarmkanalen, endokrine kirtler, hud, og lever, og de kan forårsage kløe, udslæt, kvalme, diarré, og skjoldbruskkirtel lidelser6,7. Generelt forekommer de fleste irA'er inden for 1 til 2 måneder efter indledningen af ICI'er. I nogle tilfælde kan de dog forekomme senere end 1 år efter behandlingens begyndelse eller endda efter behandlingsophør6,7. De forårsager også forskellige symptomer, der kan være svære at diskriminere fra andre patologier. Det kan således være en udfordring hurtigt at diagnosticere iraEs og behandle dem korrekt. irAEs kan påvirke alle væv, og deres debut er stærkt påvirket af cirkulerende immunceller, især T-celler bundet til PD-1-blokerende antistoffer. Derfor er en enkel og minimalt invasiv metode til at overvåge antistof-målrettede T-celler vigtigt i kliniske indstillinger.
Her udviklede vi en enkel metode til at vurdere bindingen af PD-1-blokerende antistoffer mod T-celler ved hjælp af en dråbe perifert fuldblod fra kræftpatienter, der fik nivolumab eller pembrolizumab. Ved hjælp af denne fremgangsmåde, vi var i stand til at overvåge hver af følgende: 1) varigheden af antistof binding til T-celler, 2) belægningen af T-celle PD-1 molekyler ved terapeutiske antistoffer, og 3) aktiveringstatus og immunologiske træk af T-celler. Denne metode er en ændring af en tidligere rapporteret teknik8. Mængden af blod, der kræves, er næsten den samme som den, der er nødvendig for en glukosetest, og tilgangen kræver ikke mononuklear celleberigelse eller co-turing med PD-1-blokerende antistoffer. Vi bekræftede, at denne metode også kan udføres ved hjælp af frosne prøver, herunder perifere blod mononukleare celler (PBPC'er) og celler fra pleural effusion, perikardieeffusion, bronchoalveolar lavage væske, og cerebrospinalvæske, tyder på, at denne strategi kan være nyttig i forbindelse med en multicenter undersøgelse. Denne metode kan lette tidlig diagnosticering af iraEs, og også bidrage til at bestemme de relevante immunsuppressive behandlinger til at kontrollere deres symptomer og til at identificere de optimale tidspunkter for at indlede efterfølgende behandlinger efter PD-1-hæmmere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Prøveudtagningen blev udført under rutinemæssige kliniske procedurer. Alle humane prøver blev indhentet efter informeret samtykke blev leveret af forsøgspersonerne, i overensstemmelse med erklæringen fra Helsinki og med godkendelse af den etiske gennemgang bestyrelse Graduate School of Medicine, Osaka University, Japan (15383 og 752).
1. Fuldblodsprøve Forberedelse og farvning
- Opsamles fuldblodsprøver i blodopsamlingsrør, der indeholder ethylendiamin tetraeddikesyre (EDTA).
BEMÆRK: Blodtapning kan udføres ved hjælp af enten en almindelig nål eller en blodlancet. - Overfør 20 μL fuldblodsprøver til 5 ml rundbundspolystyrenflow cytometrirør.
BEMÆRK: For at reducere ikke-specifik binding af celler til rør tilsættes 1 ml 2% føtal kvægserum (FBS) i fosfatbufferede saltvand (PBS) i rør og hvirvles i 10 s før påføring til prøver. - Der tilsættes 20 μL 2% FBS i PBS.
- Der tilsættes 10 μL human-specifik FcR blokering reagens. Bland godt og inkubere i 15 minutter ved stuetemperatur.
- Der tilsættes 500 μL rød blodcellelysisbuffer. Bland godt og inkubere i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Der tilsættes 4 ml 2% FBS i PBS, og spin ned celler ved 400 x g (1.500 rpm) i 5 min ved 4 °C. Fjern supernatant ved aspiration.
- Gentag den vaske- og aspirationsproces, der er beskrevet i trin 1.6.
- Re-suspendere celler i 100 μL af 2% FBS i PBS og opdeles i to rør på 50 μL hver.
- Tilsæt antistoffer mod overflademarkering(tabel 1). Bland godt og inkubere i 20 minutter ved stuetemperatur i mørke.
BEMÆRK: Når T-cellens immunstatus profilerer, kan antallet af markører øges baseret på flowcytometrimaskinens kvalitet. - Prøverne vaskes 2x som beskrevet i trin 1.6.
- Opslæmningsceller i 200 μL af 2% FBS i PBS.
2. Flow cytometrisk analyse
- Sæt rør ind i flowcytometeret og anskaffe celler, dybest set efter den anbefalede protokol9.
- Optag 10.000 hændelser som lymfocytporten (Figur 1A) og eksportflowdata som .fcs-filer til analyse.
- Åbn filer i analysesoftwaren. Visualiser cellerne på et fremadrettet punkt (FSC) (A) vs. sidescatter (SSC) (A) plot og gate lymfocytter (figur 1A).
- Efter at have valgt enkelte celler ved hjælp af FSC (H) vs FSC (W) og SSC (H) vs. SSC (W) (Figur 1B) og vise dem på en CD3 vs CD8 eller CD3 vs CD4 plot, gate CD8 T celler og CD4 T celler, henholdsvis (Figur 1C).
- Når du har valgt de indhegnede celler og vist dem på et PD-1 vs. humant IgG4-plot, skal du identificere PD-1-blokerende antistofbundne CD8- og CD4 T-celler baseret på isotypekontrolelement(figur 1D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gating strategi og flow cytometri analyse (Figur 1) kan detektere PD-1-blokering antistof binding til T-celler opnået fra en dråbe NSCLC patient perifert blod. Før PD-1-blokerende antistof administreres, er der ingen humane IgG4-positive CD8- eller CD4 T-celler til stede, og PD-1-udtryk kan bekræftes af et PD-1-detekterende antistof (EH12.1) (Figur 2A). Efter nivolumab eller pembrolizumab administration, IgG4 (nivolumab, pembrolizumab) kan påvises på T-celler af anti-IgG4 antistof (HP6025), mens PD-1-detektering antistof EH12.1 ikke genkender nogen PD-1 på T-celler, fordi terapeutiske PD-1 antistoffer forstyrrer EH12.1. Det betyder, at vi indirekte måler den terapeutiske binding af PD-1-blokerende antistof baseret på den manglende binding af PD-1-detektering antistof. Repræsentative data viser de forskellige bindingsstatusser for PD-1-blokerende antistof (figur 2A). Nivolumab og pembrolizumab binding og belægning af PD-1 på T-celler falder over tid10, og der er delvis binding (PB), som er vist i det dobbeltpositive område, og endelig fuldstændig tæmningstab (LB) (figur 2B).
Figur 1: Repræsentativ gatingstrategi til evaluering af PD-1-blokerende antistofbinding til T-celler fra en dråbe perifert blod. (A) FSC (A) vs SSC (A) plot og gating af lymfocytter. B) Doublets er udelukket ved at trække porte omkring hovedcellepopulationen på parceller i FSC (H) vs FSC (W) og SSC (H) vs. SSC (W). C) CD3 vs. CD8-plot (øvre) og CD3 vs. CD4-plot (lavere) og gating af henholdsvis CD8 T-celler og CD4 T-celler. (D) PD-1 vs menneskelige IgG4 plot og påvisning af binding en nivolumab (en PD-1-blokering antistof) til CD8 og CD4 T celler. Orange prikker og sorte prikker indikerer anti-IgG4 antistof og isotype kontrol farvning, henholdsvis. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Repræsentativ flowcytometrianalyse, der angiver ændringen i bindingsstatus for PD-1-blokerende antistoffer. (A) Farvning af PD-1 og human IgG4 i CD8 T-celler fra ICI-forbehandlet patientblod blev vurderet ved flowcytometri (venstre). Ti mikroliter forbehandlet blod blev behandlet med seriefortynding af nivolumab i 15 min. Komplet binding (CB) (rød), delvis binding (PB) (blå) og tab af binding (LB) (grøn) defineres af de angivne porte. (B) Status for PD-1-blokerende antistofbinding til CD8 T-celler blev analyseret på opfølgningstidspunkterne som angivet hos NSCLC-patienter, der ophørte nivolumab og pembrolizumab. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Pe | BV421 | PE-Cy7 | APC-Cy7 | BV510 | |
| Bindende evaluering | IgG4 | CD3 | PD-1 | CD4 | CD8 |
| Kontrolelement til Isotype | Kontrolelement til Isotype | CD3 | Kontrolelement til Isotype | CD4 | CD8 |
Tabel 1: Antistoffer, der anvendes i flowcytometrisk analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne artikel rapporterer vi en metode ved hjælp af et flow cytometer til at opdage PD-1-blokerende antistoffer bundet til T-celler stammer fra en dråbe perifert blod, som vi oprindeligt udviklet til nivolumab detektion10. Selv om denne teknik er meget enkel og nem at udføre, to vigtige punkter skal bemærkes for at opnå nøjagtige resultater. Den ene er, at for at opdage PD-1 molekyler, et passende antistof, der konkurrerer med nivolumab og pembrolizumab bør anvendes. Dette problem blev evalueret i en tidligere undersøgelse11. Den anden er, at RBC lysis skal udføres grundigt før overfladefarvning. Så længe der er etableret en isotypekontrol for hver analyse for at bestemme porten til den IgG4-positive klynge, påvirkes frekvensen ikke. Men med denne protokol, når RBC lysis er utilstrækkelig, kan der være reduktioner af både T-celletallet i lymfocytporten og intensiteten af hver overflademarkør. Desuden skal RBC lysis-trinnet udføres før overfladefarvning, ellers fungerer anti-IgG4-antistoffet (HP6025) ikke korrekt.
Begrænsningen af denne metode er, at populationen af T-celler bundet til PD-1-blokerende antistoffer omfatter specifikke T-cellekloner, der er ansvarlige for terapeutiske virkninger og irAEs; Hyppigheden af disse specifikke kloner blandt antistofbundne populationer er imidlertid ret lave. Derfor er vi stadig nødt til at berige det specifikke mål ved hjælp af visse markører, f.eks CD3912. En anden begrænsning er, at fluorescensintensiteten i IgG4 ikke er høj i nogle tilfælde, hvilket gør det vanskeligt at bestemme bindende status (dvs. PB og LB).
Andre undersøgelser har overvåget terapeutiske PD-1 antistoffer i blodet for at evaluere farmakokinetik. Måling af plasmakoncentrationen af nivolumab eller pembrolizumab er afgørende for at bestemme, hvordan restmængden af disse antistoffer i blodet korrelerer med tiden. Vi har dog tidligere rapporteret, at koncentrationen af nivolumab ikke korrelerer fuldstændigt med restbinding til T-celler10. Sammenlignet med målingen af plasmaantistofkoncentration13kan vores metode være mere egnet til at vurdere den resterende binding af anti-PD-1 antistoffer mod T-celler. Den oprindelige metode til monitorering af nivolumab binding til T-celler i blodet krævede inkubation med fluorescensmærket nivolumab8. Vi forenklede denne tilgang og lykkedes at reducere analysen stid og mængden af blod, der er nødvendig for analyse.
Frosne celler kan også analyseres ved hjælp af denne analyse, hvilket tyder på, at denne metode er en god pasform til multicenter undersøgelser. Nytten af denne fremgangsmåde vil blive yderligere forbedret ved at kombinere overvågningsbindende status med andre immunologiske markører, såsom Ki-67, af T-celler bundet til PD-1-blokerende antistoffer10. Fremtidige undersøgelser bør bruge vores metode i forbindelse med encellede RNA sekventering og T celle receptor sekventering at forsøge at identificere og karakterisere de specifikke delmængder af T-celler, der er bundet til PD-1-blokerende antistoffer og er ansvarlige for irAEs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud til S.K. fra Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI (JP17K16045) og Japan Agency for Medical Research and Development (JP18cm0106335 og 19cm0106310).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X RBC Lysis Buffer (Multi-species) | Thermo Fisher Scientific | 00-4300-54 | 50 mL |
| APC/Cyanine7 anti-human CD4 Antibody | BioLegend | 300518 | Clone RPA-T4 |
| BD FACS Canto II Flow Cytometer | BD | ||
| Brilliant Violet 510 anti-human CD8a Antibody | BioLegend | 301048 | Clone RPA-T8 |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | nacalai tesque | 14249-95 | 500 mL |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes | STEMCELL Technologies | 352058 | 5 mL |
| FcR Blocking Reagent, human | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | 2 mL |
| FLOWJO | BD | ||
| Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 12676029 | 500 mL |
| Mouse IgG1 monoclonal - Isotype control | abcam | ab81200 | |
| Mouse monoclonal Anti-Human IgG4 Fc | abcam | ab99825 | Clone HP6025 |
| Pacific Blue Mouse Anti-Human CD3 | BD | 558117 | Clone UCHT1 |
| PE-Cy7 Mouse anti-Human CD279 (PD-1) | BD | 561272 | Clone EH12.1 |
| PE-Cy7 Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD | 557646 |
References
- Gong, J., Chehrazi-Raffle, A., Reddi, S., Salgia, R. Development of PD-1 and PD-L1 inhibitors as a form of cancer immunotherapy: a comprehensive review of registration trials and future considerations. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 6 (1), 8 (2018).
- Borghaei, H., et al. Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 373 (17), 1627-1639 (2015).
- Brahmer, J., et al. Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Squamous-Cell Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 373 (2), 123-135 (2015).
- Herbst, R. S., et al. Pembrolizumab versus docetaxel for previously treated, PD-L1-positive, advanced non-small-cell lung cancer (KEYNOTE-010): a randomised controlled trial. The Lancet. 387 (10027), 1540-1550 (2016).
- Postow, M. A., Sidlow, R., Hellmann, M. D. Immune-Related Adverse Events Associated with Immune Checkpoint Blockade. The New England Journal of Medicine. 378 (2), 158-168 (2018).
- Weber, J. S., et al. Safety Profile of Nivolumab Monotherapy: A Pooled Analysis of Patients With Advanced Melanoma. Journal of Clinical Oncology. 35 (7), 785-792 (2017).
- Champiat, S., et al. Management of immune checkpoint blockade dysimmune toxicities: a collaborative position paper. Annals of Oncology. 27 (4), 559-574 (2016).
- Brahmer, J. R., et al. Phase I study of single-agent anti-programmed death-1 (MDX-1106) in refractory solid tumors: safety, clinical activity, pharmacodynamics, and immunologic correlates. Journal of Clinical Oncology. 28 (19), 3167-3175 (2010).
- Bommareddy, P. K., Lowe, D. B., Kaufman, H. L., Rabkin, S. D., Saha, D. Multi-parametric flow cytometry staining procedure for analyzing tumor-infiltrating immune cells following oncolytic herpes simplex virus immunotherapy in intracranial glioblastoma. Journal of Biological Methods. 6 (2), 112 (2019).
- Osa, A., et al. Clinical implications of monitoring nivolumab immunokinetics in non-small cell lung cancer patients. JCI Insight. 3 (19), 59125 (2018).
- Zelba, H., et al. Accurate quantification of T-cells expressing PD-1 in patients on anti-PD-1 immunotherapy. Cancer Immunology, Immunotherapy. 67 (12), 1845-1851 (2018).
- Simoni, Y., et al. Bystander CD8(+) T cells are abundant and phenotypically distinct in human tumour infiltrates. Nature. 557 (7706), 575-579 (2018).
- Chiu, H. H., et al. Development of a general method for quantifying IgG-based therapeutic monoclonal antibodies in human plasma using protein G purification coupled with a two internal standard calibration strategy using LC-MS/MS. Analytica Chimica Acta. 1019, 93-102 (2018).
