Summary
Burada, bölünmüş luciferase tsay sistemi kullanarak HBx-DDB1 etkileşimini inhibe eden anti-hepatit B viral ajanların taranması için bir yöntem salıyoruz. Bu sistem protein-protein etkileşimlerinin kolay algılanmasını sağlar ve bu etkileşimlerin inhibitörlerini belirlemek için uygundur.
Abstract
Hepatit B virüsü (HBV) enfeksiyonu için yeni terapötik ajanlara acil ihtiyaç vardır. Şu anda mevcut nükleos(t)ide analogları viral replikasyonu güçlü bir şekilde inhibe etseler de, viral kovalent olarak kapalı dairesel DNA'dan (cccDNA) transkripsiyonu yapılan viral proteinlerin ekspresyonu üzerinde doğrudan bir etkiye sahip değildirler. Yüksek viral antijen yükü bu kronik ve HBV ile ilişkili karsinogenezde rol oynayabileceğinden, HBV tedavisinin amacı viral proteinleri ortadan kaldırmaktır. HBV düzenleyici protein X (HBx) kromozomların yapısal bakımını bozacak şekilde konak DNA hasar bağlayıcı protein 1 (DDB1) proteinine bağlanır (Smc5/6), cccDNA'dan viral transkripsiyon aktivasyonu ile sonuçlanır. Burada, bölünmüş luciferase kompleman teşeleme sistemi kullanarak, HBx-DDB1 etkileşiminin inhibitörlerini belirlemek için kapsamlı bir bileşik tarama sistemi salıyoruz. Protokolümüz, etkileşim dinamiklerinin canlı hücreler içinde gerçek zamanlı olarak kolayca algılanmasını sağlar. Bu teknik HBV enfeksiyonutedavisi için yeni terapötik ajanlar keşfetmek için önemli bir tetki olabilir.
Introduction
Hepatit B virüsü (HBV) enfeksiyonu dünya çapında önemli bir halk sağlığı sorunudur, yıllık tahminlere göre 240 milyon kişi kronik HBV ile enfekte ve 90.000 ölüm enfeksiyon komplikasyonları nedeniyle, siroz ve hepatosellüler karsinom da dahil olmak üzere (HCC)1. Mevcut anti-HBV terapötik ajanlar, nükleos(t)ide analogları, yeterince viral ters transkripsiyon inhibe rağmen, nadiren viral proteinlerin ortadan kaldırılması elde, hangi uzun vadeli klinik hedeftir. Viral protein eliminasyonu üzerindeki kötü etkileri, hepatosit çekirdeğindeki epizomal viral kovalent kapalı dairesel DNA (cccDNA) minikromozomlarından viral transkripsiyon üzerinde doğrudan etki olmamasından kaynaklanmaktadır2.
HBV transkripsiyonu HBV düzenleyici X (HBx) protein3ile aktive edilir. Son çalışmalar HBx kromozomlar yapısal bakım bozunr ortaya 5/6 (Smc5/6), cccDNA HBV transkripsiyon blokları bir konak kısıtlama faktörü, bir DDB1-CUL4-ROC1 E3 ubiquitin ligaz kompleksi kaçırma yoluyla4,5,6. Bu nedenle, cccDNA viral transkripsiyon teşvik önemli bir adım HBx-DDB1 etkileşimi olduğu düşünülmektedir. HBx ve DDB1 arasındaki bağlanmayı inhibe edebilen bileşikler viral transkripsiyonengelleyebilir, ve gerçekten nitazoxanide bizim laboratuvar da geliştirilen bir tarama sistemi ile HBx-DDB1 etkileşiminin bir inhibitörü olarak tespit edilmiştir7.
Burada, hbx-DDB1 etkileşiminin inhibitörlerini tanımlamak için kullanılan uygun tarama sistemimizi sıyoruz, bu da 7,8'likbölünmüş luciferase tamamlayıcıbirteşp. Split luciferase alt birimleri HBx ve DDB1'e kaynaştırılır ve HBx-DDB1 etkileşimi alt birimleri yakınbir yere getirerek parlak parlak bir sinyal üreten işlevsel bir enzim oluşturur. Alt birimler arasındaki etkileşim tersine çevrilebildiği için, bu sistem hbx-DDB1 proteinlerinin hızla ayrıştırıcı olduğunu algılayabilir(Şekil 1). Bu sistemi kullanarak, büyük bir bileşik kitaplığı kolayca taranabilir, hangi verimli HBx-DDB1 etkileşimini inhibe yeteneğine sahip yeni bileşiklerin keşfi neden olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Bölünmüş luciferase tamsasının şematik gösterimi Şekil 1A'dagösterilmiştir ve isme işlemi Şekil 1B'deözetlenmiştir. Etkileşim dinamiği hücre lisisi olmadan gerçek zamanlı olarak ölçülebilir.
1. Hücre Hazırlama
- Dulbecco'nun modifiye Eagle'S orta (DMEM) % 10 v / v fetal sığır serum (FBS), 1x penisilin / streptomisin ile desteklenmiş kültürlü HEK293T hücreleri korumak 37 ° 20% O2 ve% 5 CO2.
- 10 mL DMEM ile 100 mm'lik bir tabağa 5 x 106 hücre tohumu ve bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
- Aşağıdaki yönteme göre hücrelere bölünmüş luciferases ile HBx ve DDB1 geçici transfect 1 μg.
NOT: Transzmid DNA'sının miktarı kullanılan transfeksiyon naibine bağlı olabilir. Hedef proteine kaynaşmış bölünmüş luciferasein optimal pozisyonu önceden belirlenmelidir. Bu durumda, HBx, C-terminus'ta LgBit'e (HBx-LgBit) ve DDB1'de DDB1'in N-terminus'unda (SmBit-DDB1) SmBit'e kaynaşmış olarak erimiş ve en iyi sonuçları (yani en parlak luciferase sinyalleri) sağlamıştır. Bu işlem daha önce ayrıntılı olarak bildirilmiştir7.- DNA yoğuşma tamponunda(MalzemeTablosu)DNA plazmidini ifade eden 1 μg HBx-LgBit ve 1 μg SmBit-DDB1 toplam 300 μL hacmine seyreltin.
- 16 μL arttırıcı çözelti(Malzeme Tablosu)ekleyin ve 1 s girdap ile karıştırın.
- Numuneyi oda sıcaklığında 3 dakika kuluçkaya yatırın.
- Numuneye 60 μL transfeksiyon reaktifi(Malzeme Tablosu)ekleyin ve 10 s girdap ile karıştırın.
- Numuneyi 8 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.
- Kuluçka sırasında, çanak (adım 1.2 hazırlanan) kültür ortamı aspire ve fosfat tamponlu salin (PBS) 5 mL ile hücreleri yıkayın. Aspirasyon aspirasyon ile PBS kaldırın ve DMEM 7 mL ekleyin.
- Transfeksiyon komplekslerini içeren tüpe 3 mL DMEM ekleyin. Pipetleme ile karıştırın ve 10 cm çanak hücre üzerine transfection kompleksleri ekleyin.
- Hücreleri 37 °C'de bir kuvözde %5 CO2'nin altında 10 saat kuluçkaya yatırın.
- Aşağıdaki yönteme göre 50 μL orta/iyi de 50 μL'lik hücrelerde hücreleri beyaz 96 kuyu plakasına yeniden yerleştirin.
- Harcanan hücre kültürünü orta çıkarın ve 5 mL PBS ile hücreleri yıkayın.
- Aspirasyon ile PBS'yi çıkarın, 1 mL %0,25 tripsin-EDTA ekleyin ve hücreleri ayırmak için 37 °C'de 5 dk kuluçkaya yatırın.
- 4 mL DMEM ekleyin ve hücre tabakasının yüzeyine birkaç kez boru tutarak orta yıkın. Hücre süspansiyonuna bir tüp aktarın.
- Oda sıcaklığında 5 dk için 500 x g santrifüj hücreleri.
- Supernatant atın ve PBS 1 mL hücre pelet resuspend.
- Hücre süspansiyonuna 500 x g'de oda sıcaklığında 5 dakika santrifüj edin ve süpernatant atın.
- 1.0 x 106 hücre/mL bir tohumlama yoğunluğuna% 10 FBS ile desteklenen tamponlu hücre kültür ortamı(Malzeme Tablosu)ile hücre pelet seyreltmek.
- Pipet 50 μL hücre süspansiyonu 96 kuyunun her kuyusu içine ve hücreleri kuvöze geri döndürün.
- 37 °C'de %5 CO2'nin altında 10 saat boyunca kuluçka yakan hücreler.
2. Bileşik Tarama
- Kuluçka sırasında, 13.5x konsantrasyonda tarama bileşiklerini(Malzeme Tablosu)ve çözücü (dimetil sülfoksit [DMSO]) seyreltin. Örneğin, stok 10 mM ve tarama konsantrasyonu 10 μM ise, 73,1 μL arabelleğe alsa 1 μL stok çözeltisi ekleyin.
- Her kuyuya 12,5 μL'lik parlak substrat(Malzeme Tablosu)ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın.
NOT: Negatif kontroller olarak plakanın her iki ucundaki kuyular (yani, sütun 1 ve 12) parlak bir substrat içermemelidir. - Bir luminometre(Malzeme Tablosu)kullanarak temel parlaklığı ölçün.
- İlk ölçümden hemen sonra, 5 μL bileşik ekleyin ve her kuyuya 2,1 adımda seyreltilmiş DMSO'yu kontrol edin.
NOT: Son konsantrasyon 10 μM olacaktır. - Luminesans değerlerini her 30 dk'da 2 saat ölçün.
NOT: Plaka oda sıcaklığında karanlıkta kuluçkaya yatırılmalıdır. - Temel sinyallere normalleştirme den sonra kontrol DMSO tedavisi ile karşılaştırıldığında inhibitör etkileri hesaplayın.
NOT: Her bileşiğin yinelenen veya üç leme halinde taranması varyasyonu azaltabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokolün kullanımını izleyen temsili sonuçlar Şekil 2A,B'degösterilmiştir. Sinyal-arka plan oranı 80'den büyüktü ve Z' faktörü9 (yüksek işlem taraması için altın standart kalite endeksi) 0,5'ten büyüktü ve bu da bu test sisteminin yüksek işlem taraması için kabul edilebilir olduğunu gösteriyordu. Eşik olarak belirlenen >40% inhibisyon kontrol ile karşılaştırıldığında (Sadece DMSO), biz bir aday ilaç olarak nitazoxanide tespit7. Bu sistemi kullanarak, daha iyi aday ilaçlar diğer tarama ile bulunabilir, daha büyük bileşik kütüphaneler.
Şekil 1: HBx-DDB1 etkileşiminin split luciferase analizinin şematik gösterimi. (A) Bölünmüş luciferase tamamlayıcı istinat sistemi kullanılarak HBx-DDB1 bağlamanın altında yatan ilke. Ayrılmış luciferase alt birimleri, LgBit ve SmBit, sırasıyla HBx ve DDB1 ile kaynaşır. HBx-DDB1 etkileşimi, alt birimleri yakınbir yere getirerek Parlak bir sinyal üreten işlevsel bir enzim oluşturur. Alt birimler arasındaki etkileşim tersine çevrilebilir. (B) Split luciferase tsay. LgBit ve DDB1'e kaynaşmış HBx ifadesi için plazmidlerin birlikte transfeksiyonu smBit'e dönüştükten sonra hücreler 96 kuyu plakasına yeniden seri olarak ekildi. Parlak substrat eklenmesi, hücre lisis adımı olmadan luciferase aktivitesinin ölçülmesini sağlar. Luciferase faaliyetleri tarama bileşikleri ekledikten sonra ölçülebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Bölünmüş luciferase tahsinin başarılı sonuçları. (A) Temsili temel parlak sinyalleri 96 kuyu plaka. Luciferase yoğunluğu sayılar ve renklerle temsil edilir. Sütun 1 ve 12, Parlak substratek eklenmediği denetimlerdir. Z faktörü 0.5'ten büyüktü. (B) 96 kuyu plakasına tarama bileşiklerinin eklenmesinden sonra göreceli luciferase aktivite düzeylerinin temsili zaman serisi sonucu. X ekseni, temel luciferase aktivitesine standardizasyondan sonra kontrole (DMSO) göre hesaplanan inhibitör etkilerini temsil eder. En etkili bileşik nitazoxanide idi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HBx-DDB1 bağlayıcı inhibitörlerini bulmak için split luciferase tsay kullanarak uygun bir tarama yöntemi geliştirdik. Hücre lisisine gerek kalmadan canlı hücrelerde etkileşim dinamiği gerçek zamanlı olarak saptanabilir. HBx-DDB1 etkileşiminin inhibisyonu Smc5/6'nın restorasyonuna yol açar, bu da viral transkripsiyon, protein ekspresyonu ve cccDNA üretiminin bastırılmasıyla sonuçlanır7. Antiviral eylem bu yeni mekanizma mevcut HBV tedavilerin yetersizlikleri üstesinden gelebilir.
Canlı hücrelerdeki protein-protein etkileşimlerini araştırmak için bir dizi yöntem mevcut olsa da, bu etkileşimleri incelemek10. Bizim prosedür basit ve bir 96 iyi plaka ekran için sadece kısa bir süre gerektirir. Ayrıca, tarama kalitesi yüksek Z' puanı ile tatmin edici oldu, yüksek iş lenme tarama için altın standart kalite endeksi9. Bizim tsay robotik otomasyon11 için uygun olabilir ve ilaç keşif için etkili bir tsay olduğunu.
Burada açıklanan protokol hek293T hücre hattını yüksek transfeksiyon etkinliği ve yüksek proliferasyon yeteneği yüksek verim taraması için uygun olduğu için kullanırken, bu tarama yöntemi modifikasyonlar olmadan diğer hücre hatları (örn. HepG2) kullanılarak gerçekleştirilebilir7. Bileşiklerin taranması için gerçekçi bir strateji olarak HEK293T hücreleri, ikinci bir doğrulama taramasında HepG2 hücrelerinin takip ettiği ilk taramada kullanılabilir. Etkileri dolaylı mekanizmalara bağlı olduğunda bazı bileşikler farklı hücre hatlarında önemli sonuçlar göstermeyebilir.
Amacımız yüksek iş sahibi tarama yöntemi geliştirmek olduğu için, tanımlanan bileşiklerin etkileşim inhibitörü olarak çalışıp çalışmadığını doğrulamak için sonraki doğrulama çalışmaları gereklidir. Bu teşpteki Parlak sinyallerin azaldığı düzeyler her zaman HBx-DDB1 etkileşiminin inhibisyonu ile örtüşmez. Sitotoksisite testleri, ko-immünopresidasyon çalışmaları ve daha fazla anti-HBV deneyleri etkilerini doğrulamak için önemlidir7.
Daha önce nispeten küçük ölçekli bileşik kütüphane tarama tarafından HBx-DDB1 etkileşiminin bir inhibitörü olarak nitazoxanide tespit rağmen7, çok daha büyük bileşik kütüphanelerin tarama içeren daha fazla çalışma kolayca protein-protein etkileşimlerini daha verimli inhibe yeteneğine sahip yeni bileşikler belirlemek için yapılabilir. Bu tür daha fazla tarama yaparken, nitazoxanide tsay için pozitif bir kontrol olarak kullanılabilir. Ayrıca, burada açıklanan sistem diğer protein-protein etkileşimlerine uygulanabilir. Protein-protein etkileşimleri önemli bir ilaç sınıfıdır12. Nitekim, diğer birçok virüs çoğaltmak veya patojenite ifade etmek için konak faktörleri ile etkileşim13,14. Viral ve konak proteinler arasındaki etkileşimleri hedefleyen burada açıklanan bölünmüş luciferase tabanlı test, HBV ve diğer bulaşıcı hastalıklar için tedavilergeliştirmek için yeni bir strateji sağlayabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, Milli Eğitim Bakanlığı'nın hibe-in-Aid tarafından desteklenmiştir, Kültür, Spor, Bilim ve Teknoloji, Japonya (#19H03430 ve #17K09405 M.O.'ya, #19J11829,#JP19fk0310102 #JP19fk021005 #18H05024,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, Japonya Uygulamalı Enzymoloji Vakfı ve Kobayashi Kanser Araştırmaları Vakfı'ndan (M.O.'ya), GSK Japan Research Grant 2018 (K.S.'ye) ve Miyakawa Memorial Research Foundation'ın (K.S.)'den aldığı bir bağışla.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture microplate, 96 well, PS, F-BOTTOM | Greiner-Bio-One GmbH | 655098 | |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6046 | |
| DMSO | Tocris Bioscience | 3176 | |
| Effectene transfection reagent | Qiagen | 301425 | Includes DNA-condensation buffer, enhancer solution and transfection reagent |
| FBS | Nichirei | 175012 | |
| GloMax 96 microplate luminometer | Promega | E6521 | |
| HBx–LgBit expressing DNA plasmid | Our laboratory | Available upon request | |
| HEK293T cells | American Type Culture Collection | CRL-11268 | |
| NanoBiT PPI starter systems | Promega | N2015 | Includes Nano-Glo Live Cell Reagent |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | Described as "buffered cell culture medium" in the manuscript |
| PBS | Takara | T900 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781 | |
| Screen-Well FDA-approved drug library V2 version 1.0 | Enzo Life Sciences | BML-2841 | Compounds used here were as follows: mequinol, mercaptopurine hydrate, mesna, mestranol, metaproterenol hemisulfate, metaraminol bitartrate, metaxalone, methacholine chloride, methazolamide, methenamine hippurate, methocarbamol, methotrexate, methoxsalen, methscopolamine bromide, methsuximide, methyclothiazide, methyl aminolevulinate·HCl, methylergonovine maleate, metolazone, metyrapone, mexiletine·HCl, micafungin, miconazole, midodrine·HCl, miglitol, milnacipran·HCl, mirtazapine, mitotane, moexipril·HCl, mometasone furoate, mupirocin, nadolol, nafcillin·Na, naftifine·HCl, naratriptan·HCl, natamycin, nebivolol·HCl, nelarabine, nepafenac, nevirapine, niacin, nicotine, nilotinib, nilutamide, nitazoxanide, nitisinone, nitrofurantoin, nizatidine, nortriptyline·HCl, olsalazine·Na, orlistat, oxaprozin, oxtriphylline, oxybutynin Chloride, oxytetracycline·HCl, paliperidone, palonosetron·HCl, paromomycin sulfate, pazopanib·HCl, pemetrexed disodium, pemirolast potassium, penicillamine, penicillin G potassium, pentamidine isethionate, pentostatin, perindopril erbumine, permethrin, perphenazine, phenelzine sulfate, phenylephrine, phytonadione, pimecrolimus, pitavastatin calcium, and podofilox |
| SmBit–DDB1 expressing DNA plasmid | Our laboratory | Available upon request | |
| Trypsin-EDTA | Sigma Aldrich | T4049 |
References
- Tang, L. S. Y., Covert, E., Wilson, E., Kottilil, S. Chronic hepatitis B infection: a review. The Journal of the American Medical Association. 319, 1802-1813 (2018).
- Sekiba, K., et al. Hepatitis B virus pathogenesis: Fresh insights into hepatitis B virus RNA. World Journal of Gastroenterology. 24, 2261-2268 (2018).
- Slagle, B. L., Bouchard, M. J. Hepatitis B virus X and regulation of viral gene expression. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 6, a021402 (2016).
- Murphy, C. M., et al. Hepatitis B Virus X Protein Promotes Degradation of SMC5/6 to Enhance HBV Replication. Cell Reports. 16, 2846-2854 (2016).
- Decorsière, A., et al. Hepatitis B virus X protein identifies the Smc5/6 complex as a host restriction factor. Nature. 531, 386-389 (2016).
- Niu, C., et al. The Smc5/6 complex restricts HBV when localized to ND10 without inducing an innate immune response and is counteracted by the HBV X protein shortly after infection. PLoS One. 12, e0169648 (2017).
- Sekiba, K., et al. Inhibition of HBV Transcription From cccDNA With Nitazoxanide by Targeting the HBx-DDB1 Interaction. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7, 297-312 (2019).
- Eggers, C. T., et al. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11, 400-408 (2015).
- Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4, 67-73 (1999).
- Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. Protein-protein interaction detection: Methods and analysis. International Journal of Proteomics. 2014. 2014, 147648 (2014).
- Michael, S., et al. A Robotic Platform for Quantitative High-Throughput Screening. ASSAY and Drug Development Technologies. 6, 637-657 (2008).
- Skwarczynska, M., Ottmann, C.
- de Chassey, B., Meyniel-Schicklin, L., Vonderscher, J., André, P., Lotteau, V. Virus-host interactomics: New insights and opportunities for antiviral drug discovery. Genome Medicine. 6, 115 (2014).
- Prasad, M., et al. Virus-Host Interactions: New Insights and Advances in Drug Development Against Viral Pathogens. Current Drug Metabolism. 18, 942-970 (2017).
