Summary
Her presenterer vi en metode for screening anti-hepatitt B viral agenter som hemmer HBx-DDB1 interaksjon ved hjelp av en splitt luciferase analysen system. Dette systemet gir enkel påvisning av protein-protein interaksjoner og er egnet for å identifisere hemmere av slike interaksjoner.
Abstract
Det er et presserende behov for romanen terapeutiske midler for hepatitt B virus (HBV) infeksjon. Selv om tiden tilgjengelig nukleos (t) IDE analogs potently hemme viral replikering, har de ingen direkte effekt på uttrykk for viral proteiner skrives fra en viral covalently lukket sirkulær DNA (cccDNA). Ettersom høy viral antigen-belastning kan spille en rolle i denne kroniske og HBV-relaterte kreft, er målet med HBV-behandling å utrydde virus proteiner. HBV regulatoriske protein X (HBx) binder seg til verten DNA skade-bindende protein 1 (DDB1) protein for å svekke strukturelle vedlikehold av kromosomer 5/6 (Smc5/6), noe som resulterer i aktivering av viral transkripsjon fra cccDNA. Her, ved hjelp av en splitt luciferase komplementering analysen system, presenterer vi en omfattende sammensatte screening system for å identifisere hemmere av HBx-DDB1 interaksjon. Vår protokoll muliggjør enkel påvisning av samspill dynamikk i sanntid i levende celler. Denne teknikken kan bli en viktig analysen for å oppdage romanen terapeutiske midler for behandling av HBV infeksjon.
Introduction
Hepatitt B virus (HBV) infeksjon er en stor folkehelse bekymring over hele verden, med årlige anslag på 240 000 000 personer kronisk smittet med HBV og 90 000 dødsfall på grunn av komplikasjoner fra infeksjonen, inkludert skrumplever og leverkreft (HCC)1. Selv om dagens anti-HBV terapeutiske midler, nukleos (t) IDE analoger, tilstrekkelig hemme viral omvendt transkripsjon, de sjelden oppnå eliminering av virale proteiner, som er det langsiktige kliniske målet. Deres dårlig effekt på viral protein eliminering skyldes deres mangel på direkte effekt på viral transkripsjon fra episomal viral covalently lukket sirkulær DNA (cccDNA) minichromosomes i hepatocytter nucleus2.
HBV transkripsjon er aktivert av HBV regulatoriske X (HBx) protein3. Nyere studier avslørte at HBx forringer strukturelle vedlikehold av kromosomer 5/6 (Smc5/6), en vert restriksjon faktor som blokkerer HBV transkripsjon fra cccDNA, via kapre en DDB1-CUL4-ROC1 E3 ubiquitin ligase Complex4,5,6. Derfor er et avgjørende skritt i å fremme viral transkripsjon fra cccDNA antas å være HBx-DDB1 interaksjon. Forbindelser i stand til å hemme bindingen mellom HBx og DDB1 kan blokkere viral transkripsjon, og faktisk Nitazoxanide ble identifisert som en hemmer av HBx-DDB1 interaksjon via en screening system utviklet i vårt laboratorium7.
Her presenterer vi vår praktiske screening system brukes til å identifisere hemmere av HBx-DDB1 interaksjon, som utnytter en splitt luciferase komplementær analysen7,8. Split luciferase under enheter er smeltet til HBx og DDB1, og HBx-DDB1 interaksjon bringer under enheter i umiddelbar nærhet for å danne en funksjonell enzym som genererer en lys selvlysende signal. Som samspillet mellom under enheter er reversibel, kan dette systemet oppdage raskt dissociating HBx-DDB1 proteiner (figur 1). Ved hjelp av dette systemet, en stor sammensatt bibliotek kan lett vist, noe som kan resultere i oppdagelsen av romanen forbindelser i stand til effektivt å hemme HBx-DDB1 interaksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: en skjematisk fremstilling av Split luciferase analysen er vist i figur 1A, og analysen prosessen er skissert i figur 1B. Samspillet dynamikken kan måles i sanntid uten cellelyse.
1. celle forberedelse
- Opprettholde kultivert HEK293T celler i Dulbecco ' s modifisert Eagle ' s medium (DMEM) supplert med 10% v/v fosterets storfe serum (FBS), 1x penicillin/Streptomycin ved 37 ° c i 20% O2 og 5% co2.
- Seed 5 x 106 celler til en 100 mm rett med 10 ml DMEM og ruge ved 37 ° c over natten.
- Midlertidig transfect 1 μg av HBx og DDB1 med splittet luciferases i cellene i henhold til følgende metode.
Merk: mengden av plasmider DNA transfekterte kan avhenge av transfeksjoner Regent brukes. Den optimale plasseringen av splitt luciferase smeltet til målet proteinet må fastsettes på forhånd. I dette tilfellet HBx smeltet til LgBit ved C-Terminus av HBx (HBx-LgBit) og DDB1 smeltet til SmBit på N-Terminus av DDB1 (SmBit-DDB1) gitt de beste resultatene (dvs. den smarteste luciferase signaler). Denne prosessen er rapportert tidligere i detalj7.- Fortynne 1 μg av HBx-LgBit som uttrykker DNA-plasmider og 1 μg av SmBit-DDB1 som uttrykker DNA-plasmider (innholdsfortegnelsen) i en kondens buffer i DNA (Materialfortegnelsen) til et total volum på 300 μL.
- Tilsett 16 μL Enhancer løsning (tabell over materialer) og bland med virvlingen for 1 s.
- Ruge prøven ved romtemperatur i 3 min.
- Tilsett 60 μL av transfeksjoner reagens (materialfortegnelsen) i prøven og bland med virvlingen i 10 s.
- Ruge prøven ved romtemperatur i 8 min.
- Under inkubasjons, aspirer kulturen medium fra fatet (utarbeidet i trinn 1,2), og vaske celler med 5 mL fosfat-bufret saltvann (PBS). Fjern PBS ved aspirasjon og tilsett 7 mL av DMEM.
- Tilsett 3 mL DMEM til røret som inneholder transfeksjoner komplekser. Bland med pipettering og tilsett transfeksjoner komplekser på cellen i 10 cm parabolen.
- Ruge cellene ved 37 ° c i en inkubator under 5% CO2 for 10 timer.
- Reseed cellene til en hvit 96 brønn plate ved 5 x 104 celler/brønn i 50 μL av medium/brønn i henhold til følgende metode.
- Fjern brukt cellekultur medium og vask celler med 5 mL PBS.
- Fjern PBS ved aspirasjon, tilsett 1 mL 0,25% Trypsin-EDTA, og ruge ved 37 ° c i 5 min for å løsne celler.
- Tilsett 4 mL DMEM og spre mediet ved å pipettering over overflaten av celle laget flere ganger. Overfør celle fjæringen til et rør.
- Sentrifuger celler ved 500 x g i 5 min ved romtemperatur.
- Kast supernatanten og resuspend celle pellet i 1 mL PBS.
- Sentrifuger celle fjæringen ved 500 x g i 5 min ved romtemperatur og kast supernatanten.
- Fortynne cellen pellet med bufret cellekultur medium (tabell av materialer) supplert med 10% FBS til en seeding tetthet på 1,0 x 106 celler/ml.
- Pipetter 50 μL av celle oppheng i hver brønn av en 96 brønn plate og returner cellene til inkubator.
- Ruge celler ved 37 ° c under 5% CO2 for 10 timer.
2. sammensatte screening
- Under inkubasjons, fortynne screening forbindelser (tabell over materialer) og løsemiddel (dimethyl SULFOXIDE [DMSO]) ved 13,5 x konsentrasjon. Hvis for eksempel aksjen er 10 mM og screening-konsentrasjonen er 10 μM, tilsett 1 μL lagerløsning på 73,1 μL av bufret cellekultur medium.
- Tilsett 12,5 μL av selvlysende substrat (tabell av materialer) til hver brønn og ruge i 5 min ved romtemperatur.
Merk: som negative kontroller, brønnene i begge ender av platen (dvs. kolonner 1 og 12) bør inneholde ingen selvlysende substrat. - Mål Baseline-luminescence ved hjelp av en luminometeret (tabell med materialer).
- Umiddelbart etter den første målingen, tilsett 5 μL av forbindelser og kontroll DMSO fortynnet i trinn 2,1 til hver brønn.
Merk: den endelige konsentrasjonen vil være 10 μM. - Mål luminescence verdier hver 30 min for 2 t.
Merk: platen skal være inkubert i mørket ved romtemperatur. - Beregn hemmende effekter ved sammenligning med kontroll DMSO-behandling etter normalisering til Baseline signaler.
Merk: screening hver sammensatte i duplikat eller tre eksemplarer kan redusere variasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representative utfall etter bruk av denne protokollen er vist i figur 2A, B. Signalet-til-bakgrunn ratio var større enn 80 og Z ' faktor9 (gull standard kvalitet indeks for høy gjennomstrømming screening) var større enn 0,5, noe som indikerer at denne analysen systemet var akseptabelt for høy gjennomstrømming screening. Med terskelen satt til > 40% hemming sammenlignet med kontroll (DMSO bare), identifiserte vi Nitazoxanide som en kandidat narkotika7. Ved hjelp av dette systemet, bedre kandidat narkotika kan bli funnet av screening andre, større sammensatte biblioteker.
Figur 1: skjematisk representasjon av splittet luciferase analyse av HBx-DDB1 interaksjon. (A) prinsippet underliggende påvisning av HBX-DDB1 bindende ved hjelp av Split luciferase komplementære analysen system. Den separerte luciferase under enheter, LgBit og SmBit, er smeltet sammen med HBx og DDB1, henholdsvis. Den HBx-DDB1 interaksjon bringer under enheter i umiddelbar nærhet for å danne en funksjonell enzym som genererer en selvlysende signal. Samspillet mellom under enheter er reversibel. (B) Split luciferase-analysen. Etter co-transfeksjoner av plasmider for uttrykk for HBx smeltet til LgBit og DDB1 smeltet til SmBit, celler ble re-seeded i en 96 brønn plate. Tilsetning av selvlysende substrat gjør det mulig å måle luciferase aktivitet uten en cellelyse Rings trinn. Luciferase aktiviteter kan måles etter tilsetning av screening forbindelser. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: vellykkede resultater av delt luciferase analysen. (A) representant Baseline selvlysende signaler fra en 96 brønn plate. Luciferase intensitet representeres av tall og farger. Kolonner 1 og 12 er kontroller der selvlysende substrat ikke ble lagt til. Z-faktoren var større enn 0,5. (B) representative tid-serien resultat av relative luciferase aktivitet nivåer etter tilsetning av screening forbindelser til en 96 brønn plate. X-aksen representerer den hemmende effekten beregnet sammenlignet med kontroll (DMSO) etter standardisering til Baseline luciferase aktivitet. Den mest effektive forbindelsen var Nitazoxanide. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi utviklet en praktisk screening metoden ved hjelp av en splitt luciferase analysen for å finne HBx-DDB1 bindende hemmere. Samspillet dynamikk kan påvises i sanntid i levende celler uten behov for cellelyse. Hemming av HBx-DDB1 interaksjon fører til restaurering av Smc5/6, som resulterer i undertrykkelse av viral transkripsjon, protein uttrykk, og cccDNA produksjon7. Denne romanen mekanisme av antiviral handling kan overvinne utilstrekkelighet av dagens HBV terapier.
Selv om en rekke metoder er tilgjengelige for å undersøke protein-protein interaksjoner i levende celler, undersøke disse interaksjoner fortsatt vanskelig10. Vår prosedyre er enkel og krever bare en kort tid til skjermen 1 96 brønn plate. Videre var screening kvaliteten tilfredsstillende med en høy Z ' score, gull standard kvalitet indeks for høy gjennomstrømming screening9. Vår analysen kan være egnet for robot automatisering11 og er en effektiv analysen for narkotika oppdagelse.
Mens protokollen beskrevet her brukte HEK293T cellelinjen fordi høy transfeksjoner effekt og høy spredning evne er egnet for høy gjennomstrømming screening, kan dette screening metoden utføres ved hjelp av andre cellelinjer (f. eks HepG2) uten modifikasjoner7. Som en realistisk strategi for screening forbindelser, kan HEK293T celler brukes i den første screening etterfulgt av HepG2 celler i en andre godkjenningen screening. Noen forbindelser kan ikke vise signifikante resultater i ulike cellelinjer når effekten er avhengig av indirekte mekanismer.
Som vår intensjon var å utvikle en høy gjennomstrømming screening metoden, påfølgende validering studier er nødvendig for å bekrefte om de identifiserte forbindelsene fungerer som interaksjons hemmere. Redusert nivå av selvlysende signaler i denne analysen ikke alltid tilsvarer hemming av HBx-DDB1 interaksjon. Cytotoksisitet tester, co-immunutfelling studier, og videre anti-HBV eksperimenter er viktig å bekrefte virkningene7.
Selv om vi tidligere identifisert Nitazoxanide som en hemmer av HBx-DDB1 interaksjon ved screening en relativt småskala sammensatte biblioteket7, videre studier som involverer screening av mye større sammensatte biblioteker kan enkelt utføres for å identifisere romanen forbindelser som er i stand til å hemme protein-protein interaksjoner mer effektivt. Når du utfører slike ytterligere screening, kan Nitazoxanide brukes som en positiv kontroll for analysen. Videre er systemet beskrevet her kan brukes til andre protein-protein interaksjoner. Proteiner-protein interaksjoner er en viktig klasse av narkotika mål12. Mange andre virus samhandler faktisk med verts faktorer for å gjenskape eller uttrykke sine patogenitet13,14. Den delte luciferase analysen er beskrevet her, som er rettet mot samspillet mellom viral og vert proteiner, kan gi en ny strategi for å utvikle botemidler for HBV og andre smittsomme sykdommer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Grants-i-Aid fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi, Japan (#19H03430 og #17K09405 til Mo., og #19J11829 til K.S.), av en Grant-in-Aid for vitenskapelig forskning på innovative områder (#18H05024 til Mo.), av forskningsprogrammet på hepatitt fra Japan Agency for medisinsk forskning og utvikling, AMED (til Mo., #JP19fk021005), etter program på innovativ utvikling og anvendelse av nye legemidler for hepatitt B (#JP19fk0310102 til K.K.) fra AMED, av tilskudd fra Japan Foundation for Applied Enzymology og fra Kobayashi Foundation for Cancer Research (til Mo.), av GSK Japan Research Grant 2018 (til K.S.), og ved et stipend fra Miyakawa Memorial Research Foundation (til K.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture microplate, 96 well, PS, F-BOTTOM | Greiner-Bio-One GmbH | 655098 | |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6046 | |
| DMSO | Tocris Bioscience | 3176 | |
| Effectene transfection reagent | Qiagen | 301425 | Includes DNA-condensation buffer, enhancer solution and transfection reagent |
| FBS | Nichirei | 175012 | |
| GloMax 96 microplate luminometer | Promega | E6521 | |
| HBx–LgBit expressing DNA plasmid | Our laboratory | Available upon request | |
| HEK293T cells | American Type Culture Collection | CRL-11268 | |
| NanoBiT PPI starter systems | Promega | N2015 | Includes Nano-Glo Live Cell Reagent |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | Described as "buffered cell culture medium" in the manuscript |
| PBS | Takara | T900 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781 | |
| Screen-Well FDA-approved drug library V2 version 1.0 | Enzo Life Sciences | BML-2841 | Compounds used here were as follows: mequinol, mercaptopurine hydrate, mesna, mestranol, metaproterenol hemisulfate, metaraminol bitartrate, metaxalone, methacholine chloride, methazolamide, methenamine hippurate, methocarbamol, methotrexate, methoxsalen, methscopolamine bromide, methsuximide, methyclothiazide, methyl aminolevulinate·HCl, methylergonovine maleate, metolazone, metyrapone, mexiletine·HCl, micafungin, miconazole, midodrine·HCl, miglitol, milnacipran·HCl, mirtazapine, mitotane, moexipril·HCl, mometasone furoate, mupirocin, nadolol, nafcillin·Na, naftifine·HCl, naratriptan·HCl, natamycin, nebivolol·HCl, nelarabine, nepafenac, nevirapine, niacin, nicotine, nilotinib, nilutamide, nitazoxanide, nitisinone, nitrofurantoin, nizatidine, nortriptyline·HCl, olsalazine·Na, orlistat, oxaprozin, oxtriphylline, oxybutynin Chloride, oxytetracycline·HCl, paliperidone, palonosetron·HCl, paromomycin sulfate, pazopanib·HCl, pemetrexed disodium, pemirolast potassium, penicillamine, penicillin G potassium, pentamidine isethionate, pentostatin, perindopril erbumine, permethrin, perphenazine, phenelzine sulfate, phenylephrine, phytonadione, pimecrolimus, pitavastatin calcium, and podofilox |
| SmBit–DDB1 expressing DNA plasmid | Our laboratory | Available upon request | |
| Trypsin-EDTA | Sigma Aldrich | T4049 |
References
- Tang, L. S. Y., Covert, E., Wilson, E., Kottilil, S. Chronic hepatitis B infection: a review. The Journal of the American Medical Association. 319, 1802-1813 (2018).
- Sekiba, K., et al. Hepatitis B virus pathogenesis: Fresh insights into hepatitis B virus RNA. World Journal of Gastroenterology. 24, 2261-2268 (2018).
- Slagle, B. L., Bouchard, M. J. Hepatitis B virus X and regulation of viral gene expression. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 6, a021402 (2016).
- Murphy, C. M., et al. Hepatitis B Virus X Protein Promotes Degradation of SMC5/6 to Enhance HBV Replication. Cell Reports. 16, 2846-2854 (2016).
- Decorsière, A., et al. Hepatitis B virus X protein identifies the Smc5/6 complex as a host restriction factor. Nature. 531, 386-389 (2016).
- Niu, C., et al. The Smc5/6 complex restricts HBV when localized to ND10 without inducing an innate immune response and is counteracted by the HBV X protein shortly after infection. PLoS One. 12, e0169648 (2017).
- Sekiba, K., et al. Inhibition of HBV Transcription From cccDNA With Nitazoxanide by Targeting the HBx-DDB1 Interaction. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7, 297-312 (2019).
- Eggers, C. T., et al. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11, 400-408 (2015).
- Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4, 67-73 (1999).
- Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. Protein-protein interaction detection: Methods and analysis. International Journal of Proteomics. 2014. 2014, 147648 (2014).
- Michael, S., et al. A Robotic Platform for Quantitative High-Throughput Screening. ASSAY and Drug Development Technologies. 6, 637-657 (2008).
- Skwarczynska, M., Ottmann, C. Protein-protein interactions as drug targets. Future Medicinal Chemistry. 7, 2195-2219 (2015).
- de Chassey, B., Meyniel-Schicklin, L., Vonderscher, J., André, P., Lotteau, V. Virus-host interactomics: New insights and opportunities for antiviral drug discovery. Genome Medicine. 6, 115 (2014).
- Prasad, M., et al. Virus-Host Interactions: New Insights and Advances in Drug Development Against Viral Pathogens. Current Drug Metabolism. 18, 942-970 (2017).
