Summary
ここでは、スプリットルシフェラーゼアッセイ系を用いてHBx-DDB1相互作用を阻害する抗肝炎ウイルス剤をスクリーニングする方法を提示する。このシステムはタンパク質間相互作用の容易な検出を可能にし、そのような相互作用の阻害剤を同定するのに適している。
Abstract
B型肝炎ウイルス(HBV)感染に対する新しい治療薬が緊急に必要である。現在利用可能なnucleos(t)ideアナログはウイルス複製を強力に阻害しますが、ウイルス共有閉じた円形DNA(cccDNA)から転写されたウイルスタンパク質の発現に直接影響はありません。高いウイルス抗原負荷は、この慢性およびHBV関連発癌の役割を果たし得るとして、HBV治療の目的は、ウイルスタンパク質を根絶することである。HBV調節タンパク質X(HBx)は、クロムソーム5/6(Smc5/6)の構造維持を分解するために宿主DNA損傷結合タンパク質1(DDB1)タンパク質に結合し、cccDNAからのウイルス転写の活性化をもたらす。ここでは、スプリットルシフェラーゼ補体アッセイシステムを用いて、HBx-DDB1相互作用の阻害剤を同定する包括的な化合物スクリーニングシステムを提示する。当社のプロトコルは、生細胞内の相互作用ダイナミクスをリアルタイムで簡単に検出できるようにします。この技術は、HBV感染の治療のための新しい治療薬を発見するための重要なアッセイとなり得る。
Introduction
B型肝炎ウイルス(HBV)感染は世界的に大きな公衆衛生上の懸念事項であり、年間推定では2億4,000万人がHBVに慢性的に感染し、肝硬変や肝細胞癌(HCC)1を含む感染症による合併症による死亡が9万人にのぼります。現在の抗HBV治療薬である核(t)ideアナログは、ウイルス逆転写を十分に阻害するが、長期的な臨床目標であるウイルスタンパク質の排除を達成することはめったにない。ウイルスタンパク質除去に対する彼らの悪い効果は、肝細胞核2におけるエピソームウイルス共有閉環DNA(cccDNA)ミニクロモソームからのウイルス転写に対する直接的な影響の欠如によるものである。
HBV転写は、HBV調節X(HBx)タンパク質3によって活性化される。最近の研究では、HBxがDDB1-CUL4-ROC1 E3ユビキチンリガーゼ複合体4、5、6をハイジャックすることによって、cccDNAからのHBV転写をブロックする宿主制限因子である染色体5/6(Smc5/6)の構造維持を低下させることが明らかになった。したがって、cccDNAからのウイルス転写を促進する上で重要なステップは、HBx-DDB1相互作用であると考えられている。HBxとDDB1との結合を阻害し得る化合物は、ウイルス転写を遮断し得るが、実際にニタゾキサニドは、当研究室7で開発されたスクリーニングシステムを介したHBx-DDB1相互作用の阻害剤として同定された。
ここでは、分割ルシフェラーゼ相補アッセイ7、8を利用したHBx-DDB1相互作用の阻害剤を同定するために用いられる便利なスクリーニングシステムを提示する。スプリットルシフェラーゼサブユニットはHBxおよびDDB1に融合され、HBx-DDB1相互作用はサブユニットを近接させ、明るい発光シグナルを生成する機能的酵素を形成します。サブユニット間の相互作用は可逆的であるため、このシステムはHBx-DDB1タンパク質の急速な解離を検出することができます(図1)。このシステムを使用すると、大きな化合物ライブラリーを容易にスクリーニングすることができ、HBx-DDB1相互作用を効率的に阻害し得る新規化合物の発見をもたらす可能性がある。
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Protocol
注: 分割ルシフェラーゼアッセイの概略図を図1Aに示し、アッセイプロセスを図1Bに概説する。相互作用ダイナミクスは、細胞リシスなしでリアルタイムで測定することができます。
1. 細胞調製
- ドゥルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)で培養HEK293T細胞を維持し、10%v/v胎児ウシ血清(FBS)、1xペニシリン/ストレプトマイシンを37°Cで20%O2および5%CO2で補充する。
- 種子5 x 106細胞を100mm皿にDMEMの10mLで、37°Cで一晩インキュベートする。
- 以下の方法に従って細胞内に分割ルシフェラーゼを用いてHBxおよびDDB1の1μgを一過性にトランスフェクトする。
注:トランスフェクトされたプラスミドDNAの量は、使用されるトランスフェクションリージェントに依存し得る。標的タンパク質に融合した分割ルシフェラーゼの最適位置は、事前に決定されなければならない。この場合、HBxはHBxのC末端(HBx-LgBit)でLgBitに融合し、DDB1(SmBit-DDB1)のN末端でSmBitに融合し、最良の結果(すなわち、最も明るいルシフェラーゼ信号)を提供した。このプロセスは、以前に詳細7で報告されています。- Dna縮合緩衝液中のDNAプラスミド(材料表)を発現するHBx-LgBitの希薄1μgとSmBit-DDB1の1μgを、総体積300μLにした。
- エンハンサー溶液(材料表)を16°L加え、1sのボルテックスで混ぜます。
- 室温で3分間サンプルをインキュベートします。
- 60°Lのトランスフェクション試薬(材料表)を試料に加え、10sのボルテックスで混合します。
- 室温で8分間サンプルをインキュベートします。
- インキュベーション中に、皿から培養培地を吸引し(ステップ1.2で調製)、リン酸緩衝生理食塩酸(PBS)を5mLで細胞を洗浄した。吸引によってPBSを削除し、DMEMの7 mLを追加します。
- トランスフェクション複合体を含むチューブに3mLのDMEMを加えます。ピペットで混ぜ、トランスフェクションコンプレックスを10cm皿のセルに加えます。
- 5%CO2の下で37°Cの細胞を10時間インキュベートします。
- 次の方法に従って、5 x 104セル/ウェルの 50°L の中/ウェルで白い 96 ウェルプレートに細胞を再シードします。
- 使用済み細胞培養培地を除去し、5mLのPBSで細胞を洗浄します。
- 吸引によってPBSを取り除き、0.25%トリプシンEDTAの1 mLを加え、細胞を剥離するために37°Cでインキュベートします。
- DMEMを4mL加え、細胞層の表面に数回ピペットをして培地を分散させます。細胞懸濁液をチューブに移します。
- 室温で5分間500 x gで遠心分離細胞。
- 上清を廃棄し、1 mLのPBSで細胞ペレットを再サスペンドする。
- 室温で5分間500xgで細胞懸濁液を遠心分離し、上清を廃棄する。
- 10%FBSを添加した緩衝細胞培養培地(材料表)で細胞ペレットを1.0 x 106細胞/mLの播種密度に希釈します。
- ピペット50μLの細胞懸濁液を96ウェルプレートの各ウェルに入れ、細胞をインキュベーターに戻す。
- 細胞を37°Cで5%CO2で10時間インキュベートする。
2. 複合スクリーニング
- インキュベーション中に、スクリーニング化合物(材料表)および溶媒(ジメチルスルホキシド[DMSO])を13.5倍濃度で希釈する。例えば、ストックが10mMで、スクリーニング濃度が10μMの場合、73.1μLの緩衝細胞培養培地に1μLの原液を加えます。
- 12.5°Lの発光基板(材料表)を各ウェルに加え、室温で5分間インキュベートします。
注意:負のコントロールとして、プレートの両端のウェル(すなわち、列1と12)は発光基板を含んでいてはなりません。 - ルミノメータ(材料表)を使用してベースライン発光を測定します。
- 最初の測定の直後に、5μLの化合物を加え、各ウェルにステップ2.1で希釈したDMSOを制御します。
メモ:最終濃度は10μMとなります。 - 2時間30分ごとに発光値を測定します。
メモ:プレートは室温で暗闇の中でインキュベートする必要があります。 - ベースラインシグナルへの正規化後の制御DMSO処理と比較して阻害効果を計算する。
メモ:重複または三重に各化合物をスクリーニングすると、変動を減らすことができます。
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Representative Results
このプロトコルの使用に続く代表的な結果を図 2A,Bに示します。信号対バックグラウンド比は80より大きく、Z'ファクター9(ハイスループットスクリーニングのゴールドスタンダード品質指数)は0.5より大きく、このアッセイシステムがハイスループットスクリーニングに許容されたことを示しています。閾値を対照と比較して>40%阻害に設定した(DMSOのみ)と共に、ナイタゾキサニドを候補薬7として同定した。このシステムを使用して、より良い候補薬は、他のより大きな化合物ライブラリーをスクリーニングすることによって見つけることができます。
図1:HBx-DDB1相互作用の分割ルシフェラーゼ解析の概略表現(A)分割ルシフェラーゼ相補アッセイ系を用いたHBx-DDB1結合の基礎となる原理。分離されたルシフェラーゼサブユニット、LgBitおよびSmBitは、それぞれHBxおよびDDB1に融合される。HBx-DDB1相互作用は、サブユニットを近接に導き、発光シグナルを生成する機能的酵素を形成します。サブユニット間の相互作用は可逆的です。(B) スプリットルシフェラーゼアッセイ。LgBitとDDB1とをSmBitに融合したHBxの発現のためのプラスミドの共トランスフェクション後、細胞を96ウェルプレートに再播種した。発光基質の添加により、細胞溶解工程を伴わずにルシフェラーゼ活性の測定が可能になります。ルシフェラーゼ活性は、スクリーニング化合物を添加した後に測定することができる。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:分割ルシフェラーゼアッセイの成功結果(A)96ウェルプレートからの代表的なベースライン発光信号。ルシフェラーゼ強度は、数字と色で表されます。列1及び12は、発光基板が添加されなかった制御である。Z率は0.5より大きかった。(B)96ウェルプレートにスクリーニング化合物を添加した後の相対ルシフェラーゼ活性レベルの代表的な時系列結果。x軸は、ベースラインルシフェラーゼ活性への標準化後に対照(DMSO)と比較して算出された阻害効果を表す。最も有効な化合物はニタゾキサニドであった。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
HBx-DDB1結合阻害剤を見つけるためにスプリットルシフェラーゼアッセイを用いた便利なスクリーニング方法を開発した。相互作用ダイナミクスは、細胞リシスを必要とせずに生細胞内でリアルタイムに検出することができる。HBx-DDB1相互作用の阻害は、Smc5/6の回復をもたらし、ウイルス転写、タンパク質発現、およびcccDNA産生の抑制をもたらす7。抗ウイルス作用のこの新しいメカニズムは、現在のHBV療法の不十分さを克服するかもしれない。
生きている細胞におけるタンパク質間相互作用を調べる方法は数多くありますが、これらの相互作用を調べるのは困難なまま10.私たちの手順は簡単で、1つの96ウェルプレートをスクリーニングするために短い時間を必要とします。また、スクリーニング品質は、高いZ'スコア、ハイスループットスクリーニングのためのゴールドスタンダード品質指数9で満足でした。当社のアッセイはロボットオートメーション11に適している可能性があり、創薬のための効率的なアッセイです。
ここで説明するプロトコルは、その高いトランスフェクション有効性および高い増殖能が高スループットスクリーニングに適しているため、HEK293T細胞株を使用したが、このスクリーニング方法は、改変7なしで他の細胞株(例えば、HepG2)を用いて行うことができる。化合物をスクリーニングするための現実的な戦略として、HEK293T細胞は、第1のスクリーニングで使用され、その後、2回目の検証スクリーニングでHepG2細胞が使用され得る。一部の化合物は、効果が間接的なメカニズムに依存している場合、異なる細胞株で有意な結果を示さない場合があります。
我々の意図は、ハイスループットスクリーニング法を開発することであったため、その後の検証研究は、同定された化合物が相互作用阻害剤として機能するかどうかを確認するために必要である。このアッセイにおける発光シグナルの減少レベルは、必ずしもHBx-DDB1相互作用の阻害に対応するわけではない。細胞傷害性試験、共免疫沈降試験、およびさらなる抗HBV実験は、効果7を確認するために重要である。
ニタゾキサニドは、比較的小規模な化合物ライブラリー7をスクリーニングすることでHBx-DDB1相互作用の阻害剤として以前に同定されたが、より大きな化合物ライブラリーのスクリーニングを伴うさらなる研究を容易に行い、タンパク質間相互作用をより効率的に阻害することができる新規化合物を同定することができる。このようなさらなるスクリーニングを行う場合、ニタゾキサニドはアッセイの陽性対照として用いることができる。さらに、ここで説明するシステムは、他のタンパク質間相互作用に適用することができる。タンパク質間相互作用は、薬物標的12の重要なクラスである。実際、他の多くのウイルスは、宿主因子と相互作用して病原性13、14を複製または発現させる。ウイルスタンパク質と宿主タンパク質の相互作用を標的とするここで説明するスプリットルシフェラーゼベースのアッセイは、HBVおよび他の感染症の治療法を開発するための新しい戦略を提供するかもしれない。
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Disclosures
著者たちは何も開示する必要はない。
Acknowledgments
この作品は、文部科学省の助成金によって支えられ、 スポーツ・サイエンス・テクノロジー,#19J11829 #19H03430 日本のスポーツ・科学・#17K09405,・#17K09405,革新的分野科学研究助成(#18H05024~M.O.)による日本医学 #JP19fk021005研究開発機構の肝炎研究プログラムによる、B型肝炎の革新的開発と新薬の応用に関するプログラムによる革新的開発・新薬の応用に関するプログラムによる革新的な開発・#JP19fk0310102国際交流基金、小林がん研究財団(M.O.)、GSKジャパン研究助成2018(株式会社)、宮川記念研究財団(代表)の助成を受けています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture microplate, 96 well, PS, F-BOTTOM | Greiner-Bio-One GmbH | 655098 | |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6046 | |
| DMSO | Tocris Bioscience | 3176 | |
| Effectene transfection reagent | Qiagen | 301425 | Includes DNA-condensation buffer, enhancer solution and transfection reagent |
| FBS | Nichirei | 175012 | |
| GloMax 96 microplate luminometer | Promega | E6521 | |
| HBx–LgBit expressing DNA plasmid | Our laboratory | Available upon request | |
| HEK293T cells | American Type Culture Collection | CRL-11268 | |
| NanoBiT PPI starter systems | Promega | N2015 | Includes Nano-Glo Live Cell Reagent |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | Described as "buffered cell culture medium" in the manuscript |
| PBS | Takara | T900 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781 | |
| Screen-Well FDA-approved drug library V2 version 1.0 | Enzo Life Sciences | BML-2841 | Compounds used here were as follows: mequinol, mercaptopurine hydrate, mesna, mestranol, metaproterenol hemisulfate, metaraminol bitartrate, metaxalone, methacholine chloride, methazolamide, methenamine hippurate, methocarbamol, methotrexate, methoxsalen, methscopolamine bromide, methsuximide, methyclothiazide, methyl aminolevulinate·HCl, methylergonovine maleate, metolazone, metyrapone, mexiletine·HCl, micafungin, miconazole, midodrine·HCl, miglitol, milnacipran·HCl, mirtazapine, mitotane, moexipril·HCl, mometasone furoate, mupirocin, nadolol, nafcillin·Na, naftifine·HCl, naratriptan·HCl, natamycin, nebivolol·HCl, nelarabine, nepafenac, nevirapine, niacin, nicotine, nilotinib, nilutamide, nitazoxanide, nitisinone, nitrofurantoin, nizatidine, nortriptyline·HCl, olsalazine·Na, orlistat, oxaprozin, oxtriphylline, oxybutynin Chloride, oxytetracycline·HCl, paliperidone, palonosetron·HCl, paromomycin sulfate, pazopanib·HCl, pemetrexed disodium, pemirolast potassium, penicillamine, penicillin G potassium, pentamidine isethionate, pentostatin, perindopril erbumine, permethrin, perphenazine, phenelzine sulfate, phenylephrine, phytonadione, pimecrolimus, pitavastatin calcium, and podofilox |
| SmBit–DDB1 expressing DNA plasmid | Our laboratory | Available upon request | |
| Trypsin-EDTA | Sigma Aldrich | T4049 |
References
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